尹 麗，劉仁綠`，廖永輝，宋勇生，賀根和10

（1.井岡山大學生命科學學院，江西，吉安 343009；2.江西省紅壤丘陵區(qū)農(nóng)業(yè)環(huán)境污染防控重點實驗室，江西，吉安 343009）

在微酸性和中性土壤中，鋁主要以三價氧化態(tài)和穩(wěn)定的礦物質形式存在，隨著土壤pH 的降低，鋁以離子態(tài)釋放到土壤溶液中，對土壤生物產(chǎn)生較強的毒害作用[1-2]。紅壤分布于我國南方地區(qū)，鋁含量較高。酸性沉降導致pH 下降和活性含量升高，pH 下降會導致土壤質量下降已是不爭的事實[2]。然而，酸性沉降導致的土壤質量的下降是pH 改變直接導致的結果，還是由于鋁對作物或者微生物的毒性導致的結果呢？以酸性紅壤作為研究對象，研究鋁對植物生長影響已有大量的報道[3]。鋁對紅壤微生物影響的研究報道較少。我們前期研究表明，當土壤中活性鋁含量增加時，土壤細菌和真菌的數(shù)量、活性及種群結構均會發(fā)生改變[2,4]，說明鋁脅迫可以通過改變土壤微生物的行為而影響土壤質量。

氨氧化是全球氮循環(huán)的關鍵過程，主要通過硝化作用完成。硝化作用是微生物將氨轉換成硝酸鹽的過程，其中氨氮氧化成亞硝酸鹽是硝化作用的限制性步驟，起直接作用的酶是氨單加氧酶（ammonium monooxygenase,AMO）[6]。近年來，國內外學者利用amoA 基因作為標記，從分子水平上研究環(huán)境樣品中氨氧化菌的種群特征和系統(tǒng)發(fā)育狀況[5]。近年來，越來越多的研究結果發(fā)現(xiàn)泉古菌（Crenarchaeota）具有很強的氨氧化能力，這群獨特的微生物迅速吸引了人們的目光，成為一個新的研究熱點[7-8]。

紅壤區(qū)是我國主要的糧食產(chǎn)區(qū)，壤中的碳、氮和磷等是影響土壤肥力和植物生長發(fā)育的重要營養(yǎng)元素[9]。然而，土壤酸化導致活性鋁含量的升高對古菌種群影響的研究報道較少。本實驗以紅壤地區(qū)典型的農(nóng)田土壤和森林土壤為研究材料，應用古細菌amoA 基因克隆文庫技術分析不同鋁濃度脅迫下紅壤氨氧化古菌群落結構組成情況。通過研究酸性土壤中氨氧化古菌的多樣性，對開發(fā)利用紅壤中豐富的微生物資源以及理解酸性沉降對氨氧化古菌的多樣性的影響提供參考依據(jù)，并為進一步研究我國酸性土壤地區(qū)微生物生態(tài)系統(tǒng)提供重要參考。

1 材料和方法

1.1 樣品收集

以紅壤丘陵區(qū)森林土壤（Forest soils,FOR）和農(nóng)田土壤（Agriculture soils,AGR）為研究對象，森林土壤樣品取自江西省井岡山海拔83 m 處的常綠闊葉林(27°06ˊN,115°01ˊE)，試驗區(qū)屬于溫和的亞熱帶季風氣候，雨水充沛，四季分明；農(nóng)田土壤從距森林邊緣不超過200 m 的農(nóng)田中采集。土樣采用五點法收集0-20 cm 的土層。樣品取好后用封口袋封裝帶回實驗室，一部分土樣貯藏在4℃的冰箱中備用；一部分風干、磨碎后通過2 mm 篩后，供土壤理化特性分析，土壤的基本理化特性見表1。

表1 土壤基本理化特征Table 1 The basic physicochemical properties of studied soils

1.2 實驗設計

將100 g 土壤樣品置于250 mL 的錐形瓶中，調節(jié)土壤含水量為田間持水量的60%，將土壤置于28℃的人工氣候箱中預培養(yǎng)1 周。1 周后將鋁（AlCl3·6H2O）加入土壤，添加Al3+的濃度分別為0、100、200 mg·kg-1（干土），鋁加入后充分混合，置于28℃的人工氣候箱中溫育，保持如上的土壤水分含量。被測土壤分別標記為F0(森林土，加ddH2O)，F(xiàn)100(森林土，100 mg·kg-1Al3+)，F(xiàn)200(森林土，200 mg·kg-1Al3+)和A0(農(nóng)田土，加ddH2O)，A100(農(nóng)田土，100 mg·kg-1Al3+)，A200(農(nóng)田土，200 mg·kg-1Al3+)。所有的實驗均設3 個重復，分別培養(yǎng)后在第30 d 從錐形瓶中取樣進行分析。

1.3 菌株、培養(yǎng)基與試劑

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、pMD18-T Vector、氨芐青霉素和DNA回收試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR引物由上海生工合成。

1.4 DNA 提取

DNA 提取按Ezup 柱式土壤DNA 抽提試劑盒的方法進行，試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.5 古細菌amoA 基因PCR 擴增

采用氨氧化細菌特異性用于擴增古細菌amoA基因。引物為Arch-amoAF:5’-STAATGGTCTGGCTTAGACG-3’，Arch-amoAR’-GCGGCCATCCATCTGTATGT-3’。擴增反應體系為:10×buffer 緩沖液5 μL，dNTP(25 mmol/L)2μL，引物21F(10 pmol/μL)lμL，引物 958R( 10 pmol/μL) l μL，模板 (基因組DNA)4μL，Taq DNA 聚合酶(5U/μL)0.5μL，雙蒸水36.5μL，總體積50μL。擴增條件：94℃預變性5min：94℃變性30 s，53℃復性45 s，72℃延伸45 s, 最后72℃延伸10 min。

5μL PCR 擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)電泳檢測。PCR 產(chǎn)物純化:用UNIQ-10 柱式DNA 純化試劑盒對PCR 產(chǎn)物進行純化，純化產(chǎn)物和PMD18-T 質粒載體進行重組而后導入到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。

1.6 古細菌amoA 基因文庫的構建

純化后古細菌amoA擴增產(chǎn)物分別與pMD18-T 載體進行連接，條件為：pMD18-T 0.5μL，超純水1.5μL，PCR 純化產(chǎn)物3μL，Ligation Mix 5μL，16℃連接1.5 h，然后4℃過夜。連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，隨機選擇大約150 個陽性菌落進行菌體PCR 證實amoA 序列插入完成。PCR 引物 為M13F (5’-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3’) and M13R(5’- GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG-3’)。接著6 個來自不同處理的土壤樣品amoA 基因克隆文庫創(chuàng)建完成（F0、F100、F200、A0、A100和A200），相應的克隆依次從1 到628 標記。

1.7 古細菌amoA 基因的RFLP（限制性片段多態(tài)性）分析

通過引物M13F/R PCR 篩選陽性克隆的產(chǎn)物分別用HhaI 和RsaI 兩個限制酶消化（37 ℃，1 h）。酶切DNA 片段用2%的瓊脂糖凝膠（H，上海生工）電泳分離，經(jīng)SYBR Green I 染色和凝膠成像系統(tǒng)成像后, 所得DNA 帶型圖譜在GIS 凝膠分析軟件輔助下進行人工比較。以基因片段多態(tài)圖譜為基礎進行聚類，聚合到一起的具有相同圖譜的克隆需要用第2 種限制性內切酶進行消化與電泳分離。當?shù)诙嗡@得的基因圖譜仍然相同時，則認為它們是相同的基因型。每一個基因型作為一個分類操作單位(OTU, Operational Taxonomic Unit) 或稱為唯一基因型[10]。選取每個OUT 中的代表克隆送上海生工測序。將序列上的載體序列去除并去除嵌合序列后，通過NCBI 序列分析工具Blast(www.ncb.nlm.gov/blast/blast.cgi)和RDP 聚類分析分類(RDP classifier,http://rdp.cme.msu.edu/)，確定序列的種屬特征。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用文庫總的克隆和OTU 數(shù)量計算文庫的庫容(C)[11]：

其中，代表在文庫中僅出現(xiàn)一次的OTU 的數(shù)量，N為文庫中總克隆數(shù)。

應用Mothur 聚類分析分析文庫內種群的多樣性指數(shù)（距陣小于或等于0.02）[12]。通過clustal X 2.0[13]and Mega 5.0[14]構建基于amoA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果

2.1 土壤DNA 的提取和古菌amoA 基因的擴增

從6 個土壤樣品中提取DNA 并用巢式PCR 擴增古菌amoA rDNAs。提取的DNA 和PCR 擴增產(chǎn)物在1%(w/v) 瓊脂糖電泳并通過凝膠成像系統(tǒng)拍照，所得產(chǎn)物片段大小與預期的大小一致（圖1）。

圖1 土壤樣品DNA(左)和amoA基因PCR產(chǎn)物(右)Fig.1 Soil DNA(Left)and PCR amplification of archaeon amoA gene fragments(Right)

2.2 古菌amoA 基因克隆文庫的構建和PCR-RFLP 分析

從6 份DNA 樣品的克隆文庫中隨機挑選628個白斑進行陽性檢測，確定了602 個陽性克隆，陽性克隆率達到95.9﹪。將602 個amoA 基因克隆子PCR 鑒定產(chǎn)物用限制性內切酶RsaI 和HalI 酶切并進行多態(tài)性分析，65 個獨特的OTU 被確定。從65個OTUs 中隨機挑取1 個克隆子進行測序，序列去除含嵌合子后，確定了62 個獨立的amoA 基因序列。Blast 和RDP 系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明，62 個amoA 基因序列100%（62）屬于Crenarchaeotes（泉古菌門），相似性為97-100%，分布于4 個基因族（Cluster1-4）（圖2）。其中，Cluster 1 占38.7%（24），Cluster 2 占25.8%（16），Cluster 3 占14.5%（9），Cluster 4 占21.0%（13）。Cluster 1 氨氧化古菌在所有測試樣品占比最多，其相對豐度在FOR 土壤分別達39.5%，40.0%和44.7%，在AGR 土壤分別達38.2%，42.9%和38.5%。Cluster 3 含量最低，在兩種供試土壤中隨著鋁濃度變的差異性明顯，在高鋁濃度農(nóng)田土中檢測不到Cluster 3 的存在（表2）。

2.3 酸性土壤中鋁脅迫對氨氧化古菌種群多樣性的影響

所構建的6 個基因文庫庫容(C)從64.8%到81.1%(表3)，文庫庫容值較大，覆蓋程度較高，代表性較好，這表明文庫能比較真實代表不同鋁處理濃度下土壤樣品中氨氧化古菌的多樣性。從表3 可以看出氨氧化古菌的多樣性明顯受鋁脅迫的影響。Shannon 和Simpson 指數(shù)值表明，鋁濃度的提高會降低土壤氨氧化古菌多樣性，卻能在一定程度上提高其均勻度，而且鋁脅迫對農(nóng)田土壤的影響要高于森林土壤。A0土壤樣品氨氧化古菌種群多樣性最高，均勻度最低，相對更多的種群被發(fā)現(xiàn)于A0中。

3 討論

氨氧化古菌廣泛地分布于海洋和陸地土壤，對生態(tài)系統(tǒng)中氮素循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用。土壤酸化嚴重影響土壤質量，也影響著土壤氮素轉化微生物的分布及特征[7-9]。同時，長期的環(huán)境脅迫會導致土壤微生物的多樣性及功能發(fā)生了一些適應性改變[15]。我們前期的研究表明隨著酸性紅壤Al3+濃度的增大，土壤環(huán)境中真菌生長及數(shù)量會受到抑制，但也會產(chǎn)生一些耐受性強的優(yōu)勢種群[2]。目前，已有不少文獻報道土壤氨氧化古菌的群落結構及相對豐度與土壤理化性質存在一定的相關性[6,16-17]。然而，酸性紅壤中鋁脅迫對氨氧化古菌種群結構變化的研究報道則較少。

分子生物學技術被認為是對土壤微生物種群豐度解析最有效的方法[18]。PCR-RFLP 擴增氨氧化古菌amoA 基因序列作為一種便捷的技術被廣泛用于土壤氨氧化菌多態(tài)性的分析[19]。本研究表明，酸性紅壤中分布的氨氧化古菌100%（62）屬于Crenarchaeotes（嗜泉古菌界），這與目前多數(shù)研究的報道相一致。進一步通過Blast 分析發(fā)現(xiàn)酸性紅壤中的氨氧化古菌分布于4 個基因族（Cluster1-4）（圖2），而且在兩種供試土壤中隨著鋁濃度的變化差異性明顯，在高鋁濃度農(nóng)田土中檢測不到Cluster 3 的存在（表3），說明農(nóng)田土中存在的基因族Cluster 3 氨氧化古菌對鋁的敏感性更強，抑或該族菌在農(nóng)田土中多樣性較低，相關的原因還需要進一步的深入研究。

酸性化肥的施用會導致稻田土壤酸化，在一定程度上會促進氨氧化古菌優(yōu)勢種群的生長，進化出對NH3具有較高親和力的新種群，并能在酸性土壤中發(fā)揮主導作用[20]。本實驗通過比較兩種典型酸性土壤樣品中氨氧化古菌多樣性的差異，發(fā)現(xiàn)農(nóng)田土壤和森林土壤所含的氨氧化古菌種群有所不同，農(nóng)田土壤中氨氧化古菌具有較高種群豐度和多樣性，在A0土壤樣品的種群多樣性最高，結果與上述研究結果具有明顯一致性。我們進一步研究表明，隨著鋁脅迫濃度的增加，兩種土壤中氨氧化古菌的豐度明顯下降，農(nóng)田土中氨氧化古菌對鋁的脅迫表現(xiàn)得更為敏感，而且不同基因族（Cluster1-4）在不同土壤中表現(xiàn)出較大的差異（表3）?？梢?，農(nóng)田土壤可能由于酸性肥料的施加，一定程度降低了土壤氨氧化古菌的多樣性，同時還能在一定程度提高了其分布的均勻度和豐富度，其結果可能與種群的特異性有關，這能為高濃度鋁脅迫下高耐性氨氧化古菌的分離鑒定提供了重要的理論依據(jù)。

4 小結

隨著全球酸沉降的日益嚴重以及酸性肥料在農(nóng)業(yè)中的大量使用，紅壤丘陵區(qū)土壤富鋁化作用加劇。鋁毒可以通過影響土壤微生物的作用進而影響土壤生態(tài)功能，促進紅壤提質增效勢在必行。我們的研究表明，鋁脅迫導致土壤氨氧化古菌群落結構改變，高鋁脅迫下厭氧氨氧化菌也會發(fā)生適應性的轉變；農(nóng)田土壤由于酸性肥料的施用，氨氧化古菌群落分布受鋁脅迫的影響大于森林土壤。