潘海娟，林 玲，謝學(xué)建，高 茗

0 引 言

一測多評(píng)(quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS)，是通過測定一個(gè)成分(對(duì)照品容易得到者)實(shí)現(xiàn)多成分(對(duì)照品難以得到或不穩(wěn)定者)同步定量的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式[1-2]。該方法2006年提出，至今已有近 15 年時(shí)間，經(jīng)過眾多研究者的共同努力，QAMS已然成為了適合中藥特點(diǎn)的質(zhì)量評(píng)價(jià)新模式[3-5]。同時(shí)其應(yīng)用范圍已不再局限于中藥飲片、成方制劑等的質(zhì)量評(píng)價(jià)，在炮制工藝優(yōu)化、制劑過程考察和一致性評(píng)價(jià)等方面也有應(yīng)用研究[6-7]。我院藥劑科依托醫(yī)院全軍腎臟病研究中心，多品種、多劑型的大黃制劑是科室的一大特色。保腎片、新保腎片、炎黃保腎膠囊、新腎炎膠囊是我科產(chǎn)值較高的4個(gè)大黃制劑，主要成分均為大黃提取物。本研究通過探討含大黃的成方制劑新保腎片中相同待測成分的定量分析，建立內(nèi)參物與待測成分之間的相對(duì)校正因子(f) 并將結(jié)果應(yīng)用于組成成分相似制劑(保腎片、炎黃保腎膠囊、新腎炎膠囊)的質(zhì)量評(píng)價(jià)，對(duì)于拓展 QAMS 在科研和生產(chǎn)實(shí)踐中減少重復(fù)勞動(dòng)等的應(yīng)用具有重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器Agilent1100高效液相色譜儀，DAD二極管陣列檢測器；電子分析天平(FA1204B，上海精密科學(xué)有限公司)；美國Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)，包括在線脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器Prominence SIL-20A，二極管陣列檢測器waters2998和柱溫箱CTO-20A，Empower色譜工作站；萬分之一電子天平(FA1204B，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；百萬分之一電子天平;超聲波清洗機(jī)(AS20500A，Auto Science)。Kromasil 100-5 C18色譜柱：(4.6×250 mm；5 μm)；Agilent TC-18；Accurasil C18；Diamonsil C18；Luna 5μ ODS-2 C18。

1.2 材料蘆薈大黃素(批號(hào)110795-201007)、大黃素甲醚(批號(hào)110758-201013)、大黃酚(批號(hào)110796-201319)、大黃素(批號(hào)110795-201007)、大黃酸(批號(hào)110757-200206)，以上對(duì)照品均購自中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用。上述對(duì)照品經(jīng)面積歸一化法測定，純度均〉98%。甲醇(江蘇漢邦科技有限公司)、乙腈(美國Tedia試劑公司)為色譜醇，水為超純水，95 %醫(yī)用乙醇、磷酸等均為國產(chǎn)分析純。新保腎片樣品批號(hào)分別為YP1-0225、YP2-0311、YP3-0326、YP4-0523、YP5-0529、YP6-0606、YP7-0611、YP8-0626、YP9-0724、YP10-0811；保腎片YP1-0302、YP2-0320、YP3-0409、YP4-0427、YP5-0521、YP6-0826、YP7-0920、YP8-1015、YP9-1122、YP10-0126；炎黃保腎膠囊YP1-0408、YP2-0505、YP3-0714、YP4-0906、YP5-1012、YP6-1117、YP7-1215；均由東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科提供。

2 結(jié) 果

2.1 色譜條件Kromasil 100-5 C18色譜柱，流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1 %磷酸水溶液(B)，等度洗脫(0～80 min，A∶B=70∶30)，體積流量1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長254 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取各對(duì)照品，加甲醇溶解制成蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對(duì)照品濃度分別為24.46、33.80、33.60、65.64和106.28 μg/mL的混合對(duì)照品溶液1#備用。再分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液9.0、8.0、7.0、6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液2#～10#，備用。

2.3 供試品溶液的制備取重量差異項(xiàng)下的新保腎片20片，除去薄膜衣，精密稱定，研細(xì)，過四號(hào)篩，精密稱取細(xì)粉約0.3 g，置平底燒瓶中，加甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，14 000 r/min 離心5 min，取上清液備用。 供試品與混合對(duì)照品HPLC圖譜見圖1。

1：蘆 薈大黃素；2：大黃酸；3：大黃素；4：大黃酚；5：大黃素甲醚a(bǔ):供試品;b:混合對(duì)照品圖1 供試品與混合對(duì)照品色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下10個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積，得到各成分的回歸方程及線性范圍。見表1。

表1 5種大黃游離蒽醌的回歸方程和線性范圍

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取同一份對(duì)照品(編號(hào)：6#)溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，分別測定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.11%、0.95%、1.03%、1.29%和1.88%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批新保腎片(樣品編號(hào)：YP2-0311)按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備5份，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積，并計(jì)算得到各成分含量RSD分別為0.91%、2.277%、2.03%、1.16%、0.94%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同份新保腎片(樣品編號(hào)：YP2-0311)，室溫放置，分別在0、2、4、6、10、12 h時(shí)取樣按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積，并計(jì)算各成分峰面積，RSD分別為2.64%、2.57%、2.95%、2.78%和2.62%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收實(shí)驗(yàn)取同一批新保腎片(樣品編號(hào)：YP2-0311)按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備5份，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積，并計(jì)算得到各成分含量RSD分別為0.91%、2.277%、2.03%、1.16 %、0.94%，表明該方法的重復(fù)性良好。

取己知含量的新保腎片制劑樣品(樣品編號(hào)：YP2-0311)，相當(dāng)于蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚分別為0.335、0.798、0.456、1.407、1.007mg)的粉末0.3 g，精密稱定9份分成3組，各組分別按樣品含量分別加入80%、100%、120%的對(duì)照品，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定5種成分的峰面積，并計(jì)算加樣回收率和RSD。蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚加樣回收率分別為102.39%、100.71%、102.31%、102.69%、100.89%，RSD分別為1.39%、2.06%、1.66%、0.94%、2.58%。

2.5 相對(duì)校正因子的確定校正因子的計(jì)算按線性關(guān)系考察項(xiàng)下的試驗(yàn)方法，f=fi/fs=(Ai/Wi)/(As/Ws) ，Ai 為待測成分的峰面積，Wi 為待測成分的質(zhì)量；As為內(nèi)參物 s 的峰面積，Ws 為內(nèi)參物 s 的質(zhì)量。取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，進(jìn)樣體積為 1、2、5、8、10、12、14、16、18、20 μL ，計(jì)算以大黃素為內(nèi)參物時(shí)，5種大黃游離蒽醌間的f值，分別為f蘆薈大黃素/大黃素=0.75、f大黃酸/大黃素=0.87、f大黃酚/大黃素=0.89、f大黃素甲醚/大黃素=3.39。

2.6 相對(duì)校正因子的耐用性評(píng)價(jià)

2.6.1 不同色譜柱系統(tǒng)對(duì)f的影響采用Kromasil 100-5 C18色譜柱，分別考察了Agilent1100和Waters e2695共2種不同的高效液相色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果顯示蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚的相對(duì)校正因子的RSD分別為2.28%、1.03%、1.57%和4.29%。

2.6.2 不同柱溫對(duì)f的影響釆用Agilent1100高效液相色譜儀，Kromasil 100-5 C18色譜柱，分別在30 ℃、35 ℃和40 ℃對(duì)蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚相對(duì)校正因子進(jìn)行測定。結(jié)果顯示相對(duì)校正因子的RSD分別為1.49%、1.53%、0.23%、3.19%，表明柱溫對(duì)相對(duì)校正因子無顯著性影響。

2.6.3 不同流速對(duì)f的影響釆用Agilent1100高效液相色譜儀，Kromasil 100-5 C18色譜柱，分別在不同流速(0.9 mL/min、1.0 mL/min、1.1 mL/min)下對(duì)蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚相對(duì)校正因子進(jìn)行測定。結(jié)果顯示相對(duì)校正因子RSD分別為0.74%、0.88%、0.88%、3.26%，表明流速對(duì)相對(duì)校正因子無顯著性影響。

2.6.4 不同修飾劑對(duì)f的影響釆用Agilent1100高效液相色譜儀，Kromasil 100-5 C18色譜柱，分別考察流動(dòng)相中不容修飾劑對(duì)5種蒽醌間相對(duì)校正因子進(jìn)行測定。結(jié)果顯示相對(duì)校正因子無顯著性影響，RSD<5%。綜合不同系統(tǒng)、不同色譜柱、不同柱溫、不同流速度、不同修飾劑對(duì)相對(duì)校正因子的影響，最終取所有相對(duì)校正因子的平均值為f蘆薈大黃素/大黃素=0.75、f大黃酸/大黃素=0.88、f大黃酚/大黃素=0.89、f大黃素甲醚/大黃素=3.25。

2.7 待測成分的色譜峰定位待測成分色譜峰的定位通常采用相對(duì)保留值法或保留時(shí)間差法輔以待測成分的紫外吸收特征，一般即能對(duì)色譜峰進(jìn)行準(zhǔn)確定位。相對(duì)保留值即待測成分i與內(nèi)參物s間的保留時(shí)間的比值，計(jì)算公式：ri/s=tRi/tRs；保留時(shí)間差即待測成分i與內(nèi)參物s間保留時(shí)間的差值，計(jì)算公式：△tRi/s=tRi-tRs；實(shí)驗(yàn)中分別考察了復(fù)方蒽醌類成分間的相對(duì)保留值和保留時(shí)間差在不同品牌儀器和不同品牌色譜柱中的重現(xiàn)性。結(jié)果表明，保留時(shí)間差的波動(dòng)較為明顯，相對(duì)保留值的波動(dòng)較小，因此采用相對(duì)保留值法進(jìn)行新保腎片復(fù)方中蒽醌類待測成分色譜峰的定位較為可行。最終確定5種復(fù)方制劑蒽醌間的相對(duì)保留值分別為r蘆薈大黃素/大黃素=0.36、r大黃酸/大黃素=0.52、r大黃酚/大黃素=1.36、r大黃素甲醚/大黃素=2.13。

2.8 QAMS和外標(biāo)測定結(jié)果比較首先采用外標(biāo)法(ESM)對(duì)10批新保腎片(批號(hào)分別為YP1-0225、YP2-0311、YP3-0326、YP4-0523、YP5-0529、YP6-0606、YP7-0611、YP8-0626、YP9-0724、YP10-0811)樣品中的5種蒽醌類成分進(jìn)行多成分同步測定，再用建立的QAMS法對(duì)待測成分進(jìn)行定位并計(jì)算含量，最后將2種方法得到的結(jié)果以相對(duì)誤差進(jìn)行評(píng)價(jià)，以驗(yàn)證QAMS技術(shù)用于新保腎片中蒽醌類多成分質(zhì)量評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，2種方法所得結(jié)果無顯著性差異，相對(duì)誤差<5%，表明建立的新保腎片QAMS質(zhì)量評(píng)價(jià)模式具有較好的準(zhǔn)確性與可行性。見表2。

表2 QAMS和ESM測得新保腎片中5種蒽醌類成分的含量結(jié)果(n=2，mg/g)

2.9 QAMS數(shù)據(jù)在類似制劑中的應(yīng)用將本實(shí)驗(yàn)結(jié)果f蘆薈大黃素/大黃素=0.75、f大黃酸/大黃素=0.88、f大黃酚/大黃素=0.89、f大黃素甲醚/大黃素=3.25應(yīng)用到我科保腎片、炎黃保腎膠囊、新腎炎膠囊的含量測定中，比較在不同制劑、不同劑型中ESM和QAMS的測定結(jié)果，結(jié)果表明，一測多評(píng)質(zhì)量評(píng)價(jià)體系應(yīng)用于我院的保腎片、炎黃保腎膠囊、新腎炎膠囊時(shí)方法所得結(jié)果無顯著性差異，相對(duì)誤差<5 %，表明在主要組成均為大黃提取物的制劑中，即便是不同的劑型，所建立的QAMS質(zhì)量評(píng)價(jià)模式也可以用于不同制劑的質(zhì)量控制。見表3-表5。

表3 QAMS和ESM測得保腎片中5種蒽醌類成分的定位結(jié)果 (n=2，mg/g)

表4 QAMS和ESM測得炎黃保腎膠囊中5種蒽醌類成分的定位結(jié)果(n=2，mg/g)

表5 QAMS和ESM測得炎黃保腎膠囊中5種蒽醌類成分的定位結(jié)果(n=2，mg/g)

3 討 論

QAMS經(jīng)過多年的發(fā)展與實(shí)踐，在中藥材，飲片和提取物質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用已被行業(yè)普遍接受，但應(yīng)用于中成藥仍處于探索和研究階段。建立了QAMS檢測方法在實(shí)際生產(chǎn)檢測中操作較EMS方法更加簡便、快速[8-10]。本研究選擇了主要組成相似，但劑型不同的四個(gè)制劑，以新保腎片為主要研究對(duì)象，建立的QAMS評(píng)價(jià)模式應(yīng)用于保腎片、炎黃保腎膠囊、新腎炎膠囊，結(jié)果表明ESM與QAMS數(shù)據(jù)無顯著性差異。實(shí)驗(yàn)在相同色譜條件下待測成分分離度良好并且無干擾情況下，經(jīng)過系統(tǒng)驗(yàn)證的藥材中目標(biāo)成分的fs 可以直接應(yīng)用于制劑對(duì)應(yīng)成分含量計(jì)算，無需重新進(jìn)行fs 的建立和耐用性考察，可以節(jié)省大量的研究時(shí)間和分析成本[11-12]。研究為大黃制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善和提高提供數(shù)據(jù)支撐的同時(shí)，并為拓展一測多評(píng)法在中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制中的應(yīng)用，為組成類似的系列制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了新的研究思路和方法參考[13-15]。