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        高產(chǎn)核黃素菌株中代謝途徑酶基因表達(dá)與核黃素積累的關(guān)聯(lián)分析

        2021-10-13 01:13:34彬,川,偉,
        關(guān)鍵詞:高產(chǎn)產(chǎn)量

        楊 彬, 劉 川, 張 大 偉, 張 春 枝

        ( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034;2.中國科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所, 天津 300308 )

        0 引 言

        核黃素,又名維生素B2,是一種人體必需的維生素[1]。核黃素應(yīng)用廣泛,可以用作食品添加劑,飼料添加劑以及制作藥品,具有廣泛的應(yīng)用前景[2]。核黃素的生產(chǎn)方法有3種,分別為化學(xué)合成法、半化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法[3]。由于生物發(fā)酵法生產(chǎn)核黃素產(chǎn)量高且成本低,目前已成為核黃素大規(guī)模生產(chǎn)的方法[4]。用于核黃素生產(chǎn)的菌株有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、阿舒假囊酵母(Eremotheciumashbyii)以及曾經(jīng)用于生產(chǎn)的酵母念珠菌(C.famata)[5-7]??莶菅挎邨U菌作為一種安全高效的模式菌株是核黃素生產(chǎn)的主流菌株。

        核黃素的代謝通路可以分為3個部分[8]:磷酸戊糖途徑合成核黃素前體物質(zhì)核酮糖-5-磷酸(Ru5P),嘌呤代謝途徑合成黃素的另一前體物質(zhì)鳥苷三磷酸(GTP),核黃素合成途徑利用Ru5P與GTP合成核黃素[9]。核黃素的代謝通路已經(jīng)研究清楚,通過分析高產(chǎn)菌株的核黃素代謝通路變化,可以為從頭構(gòu)建一株高產(chǎn)核黃素菌株提供思路。

        本研究通過發(fā)酵測定一株高產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌SYL-1高產(chǎn)菌株的核黃素產(chǎn)量,使用實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)分析其核黃素代謝通路基因表達(dá)量變化,探明這一高產(chǎn)核黃素菌株的核黃素代謝通路的變化,以期為枯草芽孢桿菌高產(chǎn)核黃素提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和改造思路。

        1 材料與方法

        1.1 材 料

        菌種:高產(chǎn)核黃素菌株SYL-1,具有紅霉素抗性基因,實(shí)驗(yàn)室保藏;低產(chǎn)核黃素菌株LY-05,實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

        試劑:細(xì)菌總RNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒,賽默飛世爾科技公司;實(shí)時熒光定量試劑盒,近岸蛋白質(zhì)科技有限公司;DNA聚合酶,膠回收試劑盒,Omega Bio-tek公司。

        1.2 儀 器

        ABI 7500 Fast快速實(shí)時熒光定量PCR儀;AR124CN精密天平,奧豪斯儀器(上海)有限公司;V-1600型可見分光光度計,上海美譜達(dá)儀器有限公司;Centrifuge 5418小型臺式離心機(jī),德國Eppendorf有限公司。

        1.3 方 法

        1.3.1 發(fā)酵方案

        使用LB培養(yǎng)基進(jìn)行菌株活化,利用玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。采用500 mL搖瓶進(jìn)行培養(yǎng),添加培養(yǎng)基80 mL。培養(yǎng)條件:37 ℃、180 r/min,調(diào)整發(fā)酵初始OD600為0.1,發(fā)酵中不補(bǔ)料。培養(yǎng)基組分:2%玉米漿干粉,4%蔗糖,0.05%硫酸鎂,1%硫酸銨,1.5%酵母抽提物,0.3%磷酸氫二鉀,0.1%磷酸二氫鉀,調(diào)節(jié)pH至7.1。

        1.3.2 核黃素產(chǎn)量測定

        核黃素產(chǎn)量(g/L)測定根據(jù)發(fā)酵液經(jīng)堿處理后在444 nm處吸光度計算。

        ρ=A444/0.032 1

        1.3.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

        采用細(xì)菌總RNA提取試劑盒進(jìn)行菌株RNA提取,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄操作,使用試劑盒中提供的隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR。

        1.3.4 RT-PCR方法

        采用NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus酶和ABI 7500 Fast實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行RT-PCR,采用7500 Software V2.0.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)使用的內(nèi)參基因?yàn)锳TP合成酶基因atpA以及RNA聚合酶亞基基因rpoA。在反應(yīng)體系中加入ROXII平衡各樣品之間的熒光值,反應(yīng)體系為20 μL,每個基因重復(fù)5次,引物見表1。

        表1 實(shí)時熒光定量PCR所需引物Tab.1 Primes of RT-PCR

        1.3.5 質(zhì)粒構(gòu)建

        使用PrimeSTAR?Mix DNA Polymerase進(jìn)行質(zhì)粒和目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,膠回收試劑盒進(jìn)行片段回收,使用ClonExpress?Ⅱ連接試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒與目的基因的組裝,并進(jìn)行測序,測序工作由金唯智公司完成。組裝好的質(zhì)粒導(dǎo)入DH5α菌株中進(jìn)行保存和復(fù)制,使用細(xì)菌質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行提取。

        1.3.6 過表達(dá)菌株構(gòu)建

        采用spizzen轉(zhuǎn)化的方式在LY-05菌株中導(dǎo)入過表達(dá)質(zhì)粒,采用含有壯觀霉素抗性的LB培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,構(gòu)建的菌株及其攜帶質(zhì)粒的基本信息如表2所示。

        表2 LY-05中構(gòu)建的過表達(dá)菌株基本信息Tab.2 Basic information of overexpression strainconstructed in LY-05

        2 結(jié)果與討論

        2.1 核黃素生產(chǎn)能力檢測

        搖瓶發(fā)酵測定SYL-1與LY-05發(fā)酵48 h的核黃素產(chǎn)量。SYL-1菌株的核黃素產(chǎn)量在發(fā)酵48 h達(dá)到1.90 g/L(±0.02 g/L),對照菌株LY-05核黃素產(chǎn)量為320.52 mg/L(±10 mg/L),SYL-1核黃素產(chǎn)量比LY-05高4.9倍。表明SYL-1的核黃素代謝通路較LY-05有明顯不同,在細(xì)胞中有更多的物質(zhì)流向核黃素代謝通路。

        2.2 代謝通路基因表達(dá)量變化

        為了探究SYL-1菌株核黃素代謝通路上基因表達(dá)量的變化,對其基因gmk、gntZ、prs、purE、yqeC、yqjI、zwf表達(dá)量進(jìn)行分析,如圖1所示。將菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期,提取總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,并利用cDNA進(jìn)行RT-PCR分析。從圖1可以看出,在SYL-1菌株中基因gmk、gntZ、prs、purE、yqeC、yqjI、zwf表達(dá)量相較于LY-05有提高,可能通過過表達(dá)這些基因或相關(guān)基因提高LY-05核黃素產(chǎn)量。

        2.3 過表達(dá)發(fā)酵

        在LY-05中使用質(zhì)粒過表達(dá)基因prs、gntZ、zwf以及核黃素操縱子基因ribA發(fā)酵結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出,過表達(dá)基因prs、gntZ、zwf均可以提高LY-05的核黃素產(chǎn)量,其中過表達(dá)基因ribA核黃素產(chǎn)量最高,在發(fā)酵48 h達(dá)到469.23 mg/L。證明在LY-05中過表達(dá)prs、gntZ、zwf基因可以提高核黃素產(chǎn)量。

        圖1 SYL-1菌株相較于LY-05基因表達(dá)量的變化Fig.1 Changes in gene expression of SYL-1 comparedwith LY-05

        圖2 質(zhì)粒過表達(dá)基因核黃素產(chǎn)量Fig.2 Riboflavin production of strain with plasmidoverexpression gene

        2.4 代謝通路變化與核黃素產(chǎn)量

        對核黃素代謝通路上的基因進(jìn)行RT-PCR檢測,以探索核黃素代謝通路在基因水平上的變化,結(jié)果如圖3所示。yfkN、prs、tkt以及ywlF基因的表達(dá)量提高,證明rpe基因突變會使核黃素代謝通路上的基因表達(dá)量發(fā)生變化,從而使SYL-1改造菌株的核黃素產(chǎn)量提高。在實(shí)驗(yàn)室保藏的構(gòu)建菌株LY-05中使用pHP13質(zhì)粒過表達(dá)核黃素代謝通路上的基因prs、gntZ、zwf,核黃素產(chǎn)量均有提高,表明在LY-05中提高核黃素代謝通路流量可以提高核黃素產(chǎn)量。

        3 結(jié) 論

        采用搖瓶發(fā)酵法測定SYL-1菌株核黃素產(chǎn)量,通過RT-PCR分析其核黃素代謝通路上基因表達(dá)量。對比SYL-1與LY-05核黃素代謝通路基因表達(dá)量的變化,發(fā)現(xiàn)磷酸戊糖途徑和嘌呤代謝途徑基因表達(dá)量提高,SYL-1中核黃素代謝通路流量增加。通過在LY-05中過表達(dá)基因prs、gntZ、zwf提高了核黃素產(chǎn)量。

        圖3 與LY-01相比基因yfkN、prs、tkt、ywlF表達(dá)量的變化Fig.3 Changes of gene yfkN, prs, tkt, ywlFexpression compared with LY-01

        通過分析高產(chǎn)核黃素菌株的核黃素代謝通路上基因表達(dá)量的變化,可以找到有利于代謝改造的基因位點(diǎn),通過在構(gòu)建菌種中導(dǎo)入這些位點(diǎn),可以提高核黃素的產(chǎn)量,為以后核黃素高產(chǎn)菌株構(gòu)建提供了基礎(chǔ)。

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