樊 雪， 霍 春 紅， 關(guān) 海 晴， 李 倩， 王 際 輝，3， 王 亮

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 遼寧 大連 116622；3.東莞理工學(xué)院 化學(xué)工程與能源技術(shù)學(xué)院， 廣東 東莞 523808 )

0 引 言

蟲草素(cordycepin)，又名蛹蟲草菌素、蟲草菌素，化學(xué)名稱為3′-脫氧腺苷(3′-deoxya-denosine)，是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗生素[1]，具有抗癌、抗肺細胞纖維化、治療白血病、免疫調(diào)節(jié)等[2-4]藥用價值。

蛹蟲草菌液體發(fā)酵法是目前生產(chǎn)蟲草素的主要方式，但因其生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量低、分離純化較煩瑣等缺點，使蟲草素的價格居高不下，限制其規(guī)?；a(chǎn)及應(yīng)用。目前，對提高蟲草素產(chǎn)量的報道已有許多，但這些研究基本圍繞篩選及誘變高產(chǎn)菌株[5]、優(yōu)化培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件[6-7]、添加蟲草素合成前體及激活子[8]三個方面展開。蟲草素是蛹蟲草菌發(fā)酵中的重要次級代謝產(chǎn)物，會干擾細胞中的RNA合成及轉(zhuǎn)錄過程[9]，從而對蛹蟲草菌產(chǎn)生毒害作用。前期研究表明，蟲草素在發(fā)酵液中積累對蟲草素產(chǎn)量有明顯影響[10]。為解決這一問題，研究者們提出生物反應(yīng)與分離耦合技術(shù)[11]。

生物反應(yīng)與分離耦合技術(shù)，又稱原位產(chǎn)物分離技術(shù)或發(fā)酵分離耦合技術(shù)，是一種在生物反應(yīng)過程中通過合適的分離手段持續(xù)不斷的將對生物反應(yīng)有抑制或毒害作用的產(chǎn)物或副產(chǎn)物或不穩(wěn)定性產(chǎn)物選擇性地從生產(chǎn)性細胞或生物催化劑周圍原位移除的方法[12]。目前這種方法已成功應(yīng)用于多種產(chǎn)品的生產(chǎn)中，尤以應(yīng)用于乙醇[13]、丁醇[14]、乳酸[15]等初級代謝產(chǎn)物發(fā)酵的研究報道居多，而將發(fā)酵分離耦合技術(shù)應(yīng)用于蛹蟲草菌液體發(fā)酵產(chǎn)蟲草素的研究較少。關(guān)海晴等[12]利用大孔樹脂吸附耦合液體發(fā)酵實現(xiàn)了蟲草素高產(chǎn)。利用原位產(chǎn)物分離技術(shù)可能成為提高蟲草素產(chǎn)量的有效策略。構(gòu)建發(fā)酵分離耦合體系，需選擇合適的分離手段，其中，鹽析萃取法[16]是一種新型的雙水相體系，具有成相時間短、操作簡便、易放大、對設(shè)備要求較低等優(yōu)點。

本研究通過構(gòu)建蛹蟲草菌補料分批發(fā)酵耦合鹽析萃取發(fā)酵體系，發(fā)酵過程中及時移除高濃度蟲草素，解除產(chǎn)物抑制，以期探究該體系對蟲草素液體發(fā)酵產(chǎn)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

菌種：蛹蟲草CordycepsmilitarisFFCC 5111，大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院選育保藏。

1.2 方 法

1.2.1 樣品預(yù)處理

選用蛹蟲草菌C.militarisFFCC 5111進行搖瓶液體培養(yǎng)，25 ℃、160 r/min培養(yǎng)20 d，收集發(fā)酵液，8 000 r/min離心10 min，取上清。

1.2.2 鹽析法分離發(fā)酵液中蟲草素

取一定體積上清液于10 mL具塞比色管中，加入適量無機鹽，完全溶解后加入一定體積的有機溶劑，渦漩振蕩1 min，靜置分相，對上下相分別取樣，測定體積及蟲草素含量，計算鹽析萃取體系的相比(R)、分配系數(shù)(K)及回收率(Y)。

R=VT/VB

(1)

K=ρT/ρB

(2)

Y=(ρTVT)/(ρFVF)

(3)

式中：VT、VB分別為上、下相體積，mL；ρT、ρB分別為上、下相蟲草素質(zhì)量濃度，mg/L；ρF為發(fā)酵液中蟲草素質(zhì)量濃度，mg/L；VF為鹽析體系中發(fā)酵液體積，mL。

1.2.2.1 有機溶劑種類對蟲草素分離效果的影響

取上清液4 mL于10 mL具塞比色管中，加入(NH4)2SO41.06 g，分別加入2.4 mL的甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、乙酸乙酯或異戊醇，渦漩振蕩1 min，靜置分相。計算分配系數(shù)及回收率。

1.2.2.2 無機鹽種類對蟲草素分離效果的影響

取上清液4 mL，分別加入K2HPO42.24 g、KH2PO40.32 g、NaH2PO41.22 g、NaCO30.15 g、(NH4)2SO41.06 g或NaCl 0.50 g，再加入乙醇2.4 mL，渦漩振蕩1 min，靜置分相。計算分配系數(shù)及回收率。

1.2.2.3 無機鹽濃度對蟲草素分離效果的影響

取上清液4 mL，加入不同量(NH4)2SO4和K2HPO4(0.66、1.06、1.46、1.86、2.26、2.66 g)待溶解后加入2.4 mL乙醇，渦漩振蕩1 min，靜置分相。計算相比及回收率。

1.2.2.4 相圖繪制

稱取一定量的無機鹽(m1)加入10 mL具塞比色管中，稱取一定量去離子水(m2)溶解，逐滴加入有機溶劑(m3)至溶液恰好出現(xiàn)渾濁，判定出現(xiàn)渾濁的方法為向該體系中滴加一滴水，溶液立刻澄清，多加一滴有機溶劑，溶液又出現(xiàn)渾濁，則可認為該點為臨界點。反復(fù)操作，可得多個臨界點，按公式4和5分別計算每個臨界點的有機溶劑及無機鹽的質(zhì)量分數(shù)，以無機鹽質(zhì)量分數(shù)(w1)為橫坐標，有機溶劑質(zhì)量分數(shù)(w2)為縱坐標，繪制相圖。

w1=m1/(m1+m2+m3)

(4)

w2=m3/(m1+m2+m3)

(5)

1.2.3 補料分批發(fā)酵與鹽析萃取耦合工藝的建立

利用蛹蟲草菌C.militarisFFCC 5111進行液體發(fā)酵，分別在第6、9、12天取出部分發(fā)酵液，8 000 r/min 離心10 min，收集上清液進行鹽析分離蟲草素，沉淀部分(下相)重新循環(huán)回發(fā)酵體系，并補充一定體積新鮮合成培養(yǎng)基，使發(fā)酵液總體積維持在100 mL，以不進行耦合實驗的搖瓶為對照組。發(fā)酵15 d，每隔3 d取樣，測定菌體生物量、殘?zhí)羌跋x草素濃度等參數(shù)。

1.2.4 分析方法

1.2.4.1 生物量的測定

取發(fā)酵液2 mL，12 000 r/min離心10 min，上清液用于殘?zhí)橇考跋x草素含量測定，沉淀用去離子水清洗2遍，80 ℃烘干至恒重，稱重計算生物量。

1.2.4.2 殘?zhí)橇繙y定

殘?zhí)橇窟x用南京建成公司的F006葡萄糖測試盒進行測定。

1.2.4.3 蟲草素含量測定

發(fā)酵液中蟲草素含量利用高效液相色譜進行檢測[12]。高效液相色譜Waters e2695，檢測器為Waters 2998，紫外檢測器波長260 nm，色譜柱選用Venusil MP C18(2)(4.6 mm×250 mm)，柱溫25 ℃，流動相為體積比20∶80的甲醇-水溶液，體積流量0.8 mL/min，進樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 有機溶劑種類對蟲草素分離的影響

研究表明，有機溶劑的種類影響鹽析萃取體系的成相能力[17]，(NH4)2SO4是已報道文獻中常用于構(gòu)建鹽析萃取體系的無機鹽[18]。本研究考察了不同種類有機溶劑與(NH4)2SO4組成的鹽析萃取體系對蟲草素分離的效果，結(jié)果如表1所示。由表1可知，乙醇、丙酮與(NH4)2SO4組成的鹽析萃取體系對蟲草素的回收率與分配系數(shù)較高，回收率均達到93%以上；其次為異丙醇；而乙酸乙酯、戊醇與(NH4)2SO4組成的鹽析萃取體系蟲草素回收率較低，僅為12.37%和24.95%。推測是因為蟲草素易溶于水，乙醇、丙酮與異丙醇在水中溶解度較高且極性較強，可爭奪更多的水分子，使上相水分子含量較高，蟲草素回收率較高；乙酸乙酯與戊醇在水中的溶解度較低且極性較弱，使得上相中水分子含量較少，蟲草素的回收率較低。而甲醇/(NH4)2SO4體系不能成相，且有沉淀產(chǎn)生，這一結(jié)果與Gu等[19]的研究結(jié)論一致，推測是由于甲醇的親水性太強，使得水分子過多分配在上相，而使(NH4)2SO4析出。綜上，乙醇/(NH4)2SO4體系及丙酮/(NH4)2SO4體系對蟲草素的萃取效果最好，考慮成本及溶劑毒性因素，選擇乙醇作為萃取劑。

表1 蟲草素在有機溶劑/硫酸銨鹽析萃取體系中的分配系數(shù)及回收率

2.2 無機鹽種類對蟲草素分離的影響

由表2可知，除NaCl外，其余種類無機鹽均可與乙醇組成雙水相體系。比較不同鹽析萃取體系的萃取能力，其中乙醇/(NH4)2SO4體系及乙醇/K2HPO4的回收率較高，達到98.51%和92.27%，因此選擇乙醇/(NH4)2SO4體系及乙醇/K2HPO4兩種體系進行研究。

表2 蟲草素在乙醇/無機鹽鹽析萃取體系中的分配系數(shù)及回收率

2.3 乙醇/(NH4)2SO4及乙醇/K2HPO4體系相圖

通過濁點法分別測定乙醇/(NH4)2SO4體系及乙醇/K2HPO4體系雙結(jié)線數(shù)據(jù)，繪制相圖，如圖1所示。由圖1可以看出，乙醇/(NH4)2SO4體系及乙醇/K2HPO4體系的分相范圍均較大，對于乙醇/(NH4)2SO4體系，(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)在5%～41%時，添加適量的乙醇都能形成穩(wěn)定的雙水相體系。在(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)較低時，(NH4)2SO4的鹽析能力較弱，因此分相需要較多的乙醇；隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)的升高，分相所需的乙醇體積分數(shù)逐漸降低。在相同質(zhì)量分數(shù)的(NH4)2SO4體系中，使用蟲草素發(fā)酵液代替水，需要的乙醇體積幾乎不變，但成相范圍變窄，推測是由于發(fā)酵液中含有的無機鹽爭奪了部分水分子，使得可以加入的(NH4)2SO4質(zhì)量變小，成相范圍變??；同樣對于乙醇/K2HPO4體系，K2HPO4質(zhì)量分數(shù)在10%～40%時，添加適量的乙醇都能形成穩(wěn)定的雙水相體系。當K2HPO4質(zhì)量分數(shù)較低時，其鹽析能力較弱，因此分相需要較多的乙醇；隨著其質(zhì)量分數(shù)的升高，分相所需的乙醇體積分數(shù)逐漸降低。

(a) 乙醇/(NH4)2SO4

(b) 乙醇/K2HPO4

由圖2可知，在乙醇體積分數(shù)相同時，成相所需的K2HPO4的質(zhì)量分數(shù)小于(NH4)2SO4，乙醇/K2HPO4的雙結(jié)線位置相較于乙醇/(NH4)2SO4體系更靠左，這說明K2HPO4的鹽析成相能力強于(NH4)2SO4，雙水相分相時所需鹽的質(zhì)量分數(shù)更小，這與周夢飛等[17]結(jié)論一致，該研究有效排出體積理論，比較了10種鹽的鹽析能力發(fā)現(xiàn)，K2HPO4的鹽析能力遠大于(NH4)2SO4。

圖2 乙醇/(NH4)2SO4和乙醇/K2HPO4雙水相體系相圖比較Fig.2 Comparison of the phase diagrams of ethanol/(NH4)2SO4 and ethanol/K2HPO4 ATPSs

2.4 無機鹽質(zhì)量分數(shù)對蟲草素分離的影響

由圖3可知，對于兩種體系而言，隨著無機鹽質(zhì)量分數(shù)的增加，相比均逐漸減小，且趨于穩(wěn)定。無機鹽會與有機小分子醇爭奪體系中的水分子。無機鹽質(zhì)量分數(shù)的增大，其爭奪水分子的能力增強，溶于上相的水分子會進入下相，使上相體積減小，下相體積增大，從而使相比減小。相比過大或過小，不利于回收，因此考察相比為4.0～0.8、無機鹽質(zhì)量分數(shù)在15%～25%時對蟲草素回收率的影響。

圖3 無機鹽質(zhì)量分數(shù)對相比的影響Fig.3 Effects of inorganic salt content on phase ratio

由表3可知，在乙醇/(NH4)2SO4體系中，增加無機鹽質(zhì)量分數(shù)，會降低蟲草素的回收率；增加乙醇體積分數(shù)，可提高蟲草素回收率。但當乙醇體積分數(shù)大于27%后，蟲草素回收率不再增加，反而略有下降，這與陸秀華等[20]的研究結(jié)果一致。因此確定雙水相體系中乙醇體積分數(shù)為27%，(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)為15%。

表3 補料分批發(fā)酵與鹽析萃取耦合體系蟲草素產(chǎn)量Tab.3 Production of cordycepin by coupling fed batchfermentation with ATPS

由表4可知，在乙醇/K2HPO4體系中，無機鹽質(zhì)量分數(shù)對蟲草素回收率的影響結(jié)果與乙醇/(NH4)2SO4體系相似。當乙醇體積分數(shù)為27%、K2HPO4質(zhì)量分數(shù)為15%時，蟲草素回收率最高，為93.79%，因此確定雙水相體系中乙醇體積分數(shù)為27%，K2HPO4質(zhì)量分數(shù)為15%。比較表3、表4發(fā)現(xiàn)，在乙醇體積分數(shù)及無機鹽質(zhì)量分數(shù)相同時，乙醇/(NH4)2SO4體系回收率高于乙醇/K2HPO4體系回收率，推測是因為K2HPO4的鹽析能力強于(NH4)2SO4，當乙醇體積分數(shù)及無機鹽質(zhì)量分數(shù)相同時，K2HPO4可爭奪更多水分子，其下相體積更大，使得部分蟲草素隨水分子轉(zhuǎn)移至下相，造成蟲草素的部分損失，因此乙醇/(NH4)2SO4體系回收率略高于乙醇/K2HPO4體系回收率。

表4 乙醇/K2HPO4體系中K2HPO4質(zhì)量分數(shù)對蟲草素回收率的影響

2.5 補料分批發(fā)酵耦合鹽析萃取工藝的建立

在發(fā)酵過程中，以新鮮培養(yǎng)基替換含有高濃度蟲草素的發(fā)酵液，通過鹽析萃取體系對替換出的發(fā)酵液中的蟲草素進行分離提取。通過這種方法可對發(fā)酵液中蟲草素濃度進行稀釋，從而弱化其對菌體自身生長的反饋抑制，添加新的營養(yǎng)物質(zhì)可促進細胞生長及蟲草素積累。探究耦合時間對蟲草素產(chǎn)量及生物量濃度的影響，結(jié)果如表5所示。由表5可知，通過補料方式可有效提高蟲草素產(chǎn)量，在第6天補料，蟲草素產(chǎn)量最高，為793.85 mg/L，較對照組提高了25.83%。同時，通過補料手段對細胞生長也有較好的促進作用，在第6天補料可將生物量提高45.11%，雖然此策略對提高蟲草素產(chǎn)量效果顯著，但同時需要提供更多的營養(yǎng)物質(zhì)。

表5 耦合啟動時間對細胞生長及蟲草素積累的影響Tab.5 Effect of the starting time on cell growth andcordycepin production mg/L

發(fā)酵結(jié)束后，利用乙醇/(NH4)2SO4鹽析萃取體系對蟲草素進行分離提取，結(jié)果表3所示。由表3可知，乙醇/(NH4)2SO4鹽析萃取體系可有效分離蟲草素，回收率均可達98%左右。

3 結(jié) 論

蟲草素是蛹蟲草菌發(fā)酵中的重要次級代謝產(chǎn)物，本研究構(gòu)建了一種補料分批發(fā)酵與鹽析萃取相耦合的體系生產(chǎn)蟲草素。篩選出乙醇/(NH4)2SO4及乙醇/K2HPO4兩種鹽析萃取分離體系，且當無機鹽質(zhì)量分數(shù)、乙醇體積分數(shù)分別為15%和27%時，蟲草素回收率最高，乙醇/(NH4)2SO4體系為98.73%，乙醇/K2HPO4體系為93.79%。在第6天補料效果最好，蟲草素產(chǎn)量可達793.85 mg/L，較對照組提高25.83%，蟲草素回收率可達98.83%。