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        短時間吸入不同濃度七氟醚對幼鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及海馬神經(jīng)細胞凋亡的影響

        2021-10-12 07:34:36蕭治恒吳論彭學(xué)強趙立梅劉鑒梁鴻韜
        關(guān)鍵詞:幼鼠七氟醚海馬

        蕭治恒,吳論,彭學(xué)強,趙立梅,劉鑒,梁鴻韜

        (中山市中醫(yī)院,廣東 中山528400)

        現(xiàn)階段,麻醉藥物神經(jīng)毒性是國際麻醉界的主要研究熱點之一,相關(guān)研究指出,相較于其他麻醉藥物,七氟醚效果更優(yōu)越,患者不良反應(yīng)更少,已在嬰幼兒手術(shù)麻醉中得到廣泛使用[1-4]。亦有報道表明,七氟醚可能提高嬰幼兒術(shù)后認(rèn)知異常發(fā)生率[5-6]。選擇何種濃度七氟醚開展嬰幼兒手術(shù)麻醉依然有待進一步探討。本文以80 只SD 幼鼠作為實驗對象,探討短時間吸入不同濃度七氟醚對幼鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及海馬神經(jīng)細胞凋亡的影響,以期為嬰幼兒患者七氟醚的應(yīng)用提供有效指導(dǎo)。現(xiàn)報道如下。

        1 材料與方法

        1.1 動物

        選取無特異病原體(specific-pathogen free,SPF)級雄性SD 幼鼠80 只[生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2013-0002,使用許可證號:SYXK(粵)2013-00011],均為1 個月齡,體重100~110 g,平均(105±5)g,均購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。選擇實驗室平衡飼料喂養(yǎng),使其自由進食、飲水,控制光照與黑暗各12 h,濕度55%~58%,室溫22~25℃,確保飼養(yǎng)環(huán)境安靜。

        1.2 試劑與儀器

        七氟醚(上海恒瑞醫(yī)藥有限公司),麻醉氣體監(jiān)測儀(美國Datex-Ohmeda 公司),Morris 水迷宮實驗裝置(上海海軟隆科技發(fā)展公司),F(xiàn)luo3-AM 熒光指示劑、Pluronic F-127(日本同仁化學(xué)研究所),激光共聚焦顯微鏡(型號:FV10i,日本奧林巴斯公司),流式細胞分析儀(型號:BD FACSAria,美國Bection Dickinson 公司)。

        1.3 方法

        1.3.1 幼鼠分組與模型復(fù)制實驗開始前,所有幼鼠開展4 d 水迷宮學(xué)習(xí)訓(xùn)練,然后采取隨機數(shù)字表法將其分為4 組,每組20 只。對照組單純吸氧2 h,控制氧流量2.0 L/min;在和對照組幼鼠相同吸氧條件下,1%七氟醚組吸入1%七氟醚2 h,2%七氟醚組吸入2%七氟醚2 h,3%七氟醚組吸入3%七氟醚2 h,采用麻醉氣體監(jiān)測儀進行氣體濃度監(jiān)測,并使用揮發(fā)罐合理調(diào)控七氟醚具體吸入濃度。

        1.3.2 Morris 水迷宮實驗幼鼠吸入結(jié)束后12 h,各組取5 只幼鼠開展Morris 水迷宮實驗,讓其在水池里自由游泳60 s,詳細記錄其平臺象限停留時間及穿臺次數(shù)。

        1.3.3 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色幼鼠吸入結(jié)束后12 h,各組取5 只幼鼠,采用多聚甲醛進行心臟灌注,然后取出全腦制作石蠟切片,HE 染色后詳細觀察幼鼠海馬組織神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變情況;每只幼鼠選擇10 張切片,并對海馬神經(jīng)元凋亡詳細數(shù)目進行計數(shù),計算平均值。

        1.3.4 細胞凋亡幼鼠吸入結(jié)束后12 h,各組取5只幼鼠斷頭處死,采取無菌手術(shù)器械將其大腦取出,于放置磷酸鹽緩沖液冰盤上進行雙側(cè)海馬分離(3 min內(nèi)完成),然后制備單細胞懸液。采取錐蟲藍進行細胞活力檢測,確?;罴毎?95%。用2.5 ml 含有血清培養(yǎng)基進行細胞重懸,獲得5×105個/ml的細胞濃度。在流式管里面加入100 μl 細胞懸液,再放入5 μl Annexin V 及10 μl 碘化丙啶溶液。置于室溫條件下避光反應(yīng)20 min,并于1 h 內(nèi)用流式細胞分析儀進行凋亡測定。通過BD FACSDria Softwa 完成結(jié)果分析。

        1.3.5 鈣離子濃度幼鼠吸入結(jié)束后12 h,各組取5 只幼鼠,斷頭取其海馬組織,制備單細胞懸液,制備細胞圖片,確保細胞貼壁。采取Hank 平衡鹽溶液對1 mmol/L Fluo3-AM 母液進行稀釋,獲得5 μmol/L 工作液。加入該工作液5 μmol/L 及0.05%Pluronic F-127,有效覆蓋細胞。持續(xù)孵育45 min后用Hank 平衡鹽溶液洗滌細胞3 次,有效去除工作液。然后于培養(yǎng)箱里避光孵育10 min。采用75%酒精持續(xù)浸泡5 min,使用處理過的蓋玻片將其輕輕蓋上,防止產(chǎn)生氣泡。在激光共聚焦顯微鏡相應(yīng)樣品小槽里放置上述負(fù)載完成后的細胞涂片??刂萍ぐl(fā)光488 nm 及發(fā)射光530 nm。于低倍鏡下發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細胞(見圖1),再于×40 高倍物鏡下完成掃描拍照。通過熒光強度變化間接反映鈣離子水平的變化(見圖2)。

        圖1 海馬神經(jīng)元選定圖 (×10)

        1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組比較用單因素方差分析,進一步兩兩比較用SNK-q檢驗法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組Morris水迷宮實驗結(jié)果比較

        各組平臺象限停留時間、穿臺次數(shù)比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),2%七氟醚組、3%七氟醚組平臺象限停留時間較對照組縮短(P<0.05),穿臺次數(shù)較對照組減少(P<0.05)。見表1。

        表1 各組Morris水迷宮實驗結(jié)果比較 (n=5,±s)

        表1 各組Morris水迷宮實驗結(jié)果比較 (n=5,±s)

        注:①與對照組比較,P <0.05;②與1%七氟醚組比較,P <0.05。

        組別對照組1%七氟醚組2%七氟醚組3%七氟醚組F 值P 值平臺象限停留時間/s 26.54±2.87 24.07±2.68 12.50±1.49①②12.38±1.46①②56.839 0.000穿臺次數(shù)1.85±0.21 1.69±0.20 0.75±0.08①②0.67±0.07①②79.637 0.000

        2.2 各組HE染色結(jié)果比較

        對照組、1%七氟醚組、2%七氟醚組及3%七氟醚組的凋亡神經(jīng)元數(shù)目分別為(1.92±0.22)個/視野、(2.14±0.25) 個/視 野、(38.57±4.16) 個/視 野 及(40.35±4.38)個/視野,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=56.839,P=0.000),2%七氟醚組、3%七氟醚組較對照組增加(P<0.05)。見圖3。

        2.3 各組海馬神經(jīng)元凋亡率比較

        各組早期凋亡率、晚期凋亡率比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);2%七氟醚組、3%七氟醚組較對照組增加(P<0.05)。見表3。

        2.4 各組細胞熒光強度、鈣離子濃度比較

        各組熒光強度、鈣離子濃度比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);2%七氟醚組、3%七氟醚組熒光強度較對照組增加(P<0.05),鈣離子濃度較對照組升高(P<0.05)。見表4。

        3 討論

        圖2 實時監(jiān)測熒光強度圖

        圖3 各組海馬組織神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變 (HE×400)

        表3 各組海馬神經(jīng)元凋亡率比較 (n=5,%,±s)

        表3 各組海馬神經(jīng)元凋亡率比較 (n=5,%,±s)

        注:①與對照組比較,P <0.05;②與1%七氟醚組比較,P <0.05。

        組別對照組1%七氟醚組2%七氟醚組3%七氟醚組F 值P 值早期凋亡率11.23±1.28 12.58±1.30 24.36±3.78①②26.85±3.81①②39.773 0.000晚期凋亡率8.12±0.93 9.26±1.05 17.38±1.87①②19.36±2.14①②63.928 0.000

        表4 各組細胞熒光強度、鈣離子濃度比較 (n=5,±s)

        表4 各組細胞熒光強度、鈣離子濃度比較 (n=5,±s)

        注:①與對照組比較,P <0.05;②與1%七氟醚組比較,P <0.05。

        組別對照組1%七氟醚組2%七氟醚組3%七氟醚組F 值P 值熒光強度104.36±18.67 108.79±19.98 287.53±35.12①②296.37±36.54①②69.178 0.000鈣離子濃度/(nmol/L)79.50±11.28 82.36±11.94 185.37±26.85①②193.58±27.62①②44.936 0.000

        有研究指出,幼鼠七氟醚最低肺泡的有效濃度為2.3%左右,吸入大約2.3%~3.5%七氟醚不會對其心血管功能與體內(nèi)重要器官組織血流灌注產(chǎn)生影響[7-8]。故筆者選擇吸入1%、2%與3%濃度的七氟醚開展研究。有報道認(rèn)為,吸入七氟醚能夠影響認(rèn)知功能,同時雄性幼鼠敏感性較雌性幼鼠更高[9-10]。故本研究全部選擇雄性幼鼠作為實驗對象。Morris 水迷宮實驗?zāi)芸陀^評價幼鼠認(rèn)知功能,具有操作簡單、數(shù)據(jù)誤差較小等優(yōu)點。Morris 水迷宮實驗還能夠檢測實驗動物運動功能、學(xué)習(xí)記憶能力及感覺障礙等,客觀反映動物認(rèn)知功能[11-12]。本研究中2%七氟醚組、3%七氟醚組平臺象限停留時間、穿臺次數(shù)明顯少于其余兩組,且2%七氟醚組與3%七氟醚組、對照組與1%七氟醚組比較無顯著差異,表明短時間吸入高濃度七氟醚可降低幼鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。HE 染色顯示,對照組與1%七氟醚組幼鼠神經(jīng)元細胞核體積較其他兩組大,同時具有規(guī)整性,短時間吸入高濃度七氟醚組幼鼠細胞皺縮,并且形態(tài)不規(guī)整,海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)明顯高于低濃度七氟醚組與對照組,提示高濃度七氟醚能夠?qū)е潞qR神經(jīng)元產(chǎn)生形態(tài)學(xué)改變,加快海馬神經(jīng)元凋亡。本研究結(jié)果顯示,2%七氟醚組、3%七氟醚組海馬神經(jīng)元早期凋亡率及晚期凋亡率明顯高于其余兩組,與徐桂萍等[13]研究結(jié)論相符。說明短時間吸入2%或者3%七氟醚可提高幼鼠海馬神經(jīng)細胞早期與晚期凋亡率。細胞之中鈣離子水平升高屬于細胞凋亡的重要條件,為進一步明確短時間吸入不同濃度七氟醚是否會對細胞之中鈣穩(wěn)態(tài)造成影響,繼而導(dǎo)致其凋亡。本實驗制備了幼鼠海馬神經(jīng)細胞涂片,并進行鈣熒光試劑負(fù)載,通過激光共聚焦顯微鏡了解鈣離子變化。若實驗培養(yǎng)黏附細胞,則其將牢固黏附于相應(yīng)培養(yǎng)皿表面或者載玻片表面,而新鮮海馬組織獲得的單細胞懸液,其神經(jīng)元貼壁具有一定難度[14]。為有效解決該問題,需要處理載玻片。一般通過聚乙烯醇、多聚賴氨酸或者蛋清等作為相應(yīng)粘貼劑,實驗過程中需結(jié)合細胞特性合理選擇處理手段[15]。本研究通過多聚賴氨酸進行載玻片,最終海馬神經(jīng)細胞貼壁??紤]各種細胞特性以及活性,確保實驗染色成功具有較強技術(shù)性[16]。本研究最終確定所用Fluo 3-AM 濃度應(yīng)該為5 μmol/L,且持續(xù)孵育45 min。本研究顯示,2%七氟醚組、3%七氟醚組熒光強度、鈣離子濃度顯著高于1%七氟醚組與對照組,提示高濃度七氟醚導(dǎo)致海馬神經(jīng)細胞凋亡的同時,細胞之中鈣離子增加,并由于鈣失衡導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),短時間吸入低濃度七氟醚麻醉不會對幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生嚴(yán)重影響,不代表幼鼠隨時間逐漸延長,不會產(chǎn)生神經(jīng)行為改變,該觀點有待后續(xù)研究進一步論證。

        綜上所述,短時間吸入低濃度七氟醚并不會嚴(yán)重影響幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力,但是短時間吸入高濃度七氟醚能夠降低其認(rèn)知能力,提高海馬神經(jīng)細胞凋亡率,增加細胞之中鈣離子濃度,導(dǎo)致觸發(fā)凋亡。

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