王松，王雪嬌，鄭森旺，于歡，呂嘉皓，東嬌嬌，張世豪，楊柳

（黑龍江中醫(yī)藥大學北藥基礎與應用研究省部共建教育部重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關節(jié)軟骨退化和軟骨下骨改變?yōu)樘卣鞯耐诵行躁P節(jié)疾?。?］。長時間發(fā)病會導致軟骨組織纖顫、變性和碎片化［2－4］，軟骨下骨硬化、骨小梁結構改變［5－6］，滑膜增生［7－8］，滑膜炎［9］和一系列細胞因子的改變［10－11］，嚴重甚至可能導致殘疾。近年來的研究表明，軟骨細胞的凋亡是骨關節(jié)炎的關鍵因素［4，12］。關節(jié)軟骨僅僅依靠軟骨細胞維持細胞外基質，當軟骨細胞大量凋亡時，將會導致關節(jié)軟骨的退化［13］。因此，以抑制軟骨細胞凋亡為目的的藥物，是骨關節(jié)炎治療研究的一個重點。

獨活為傘形科植物重齒毛當歸（Angelica pubes?censMaxim，f.biserrata Shan et Yuan）的干燥根，具有祛風除濕、通痹止痛的作用。研究表明，獨活的主要活性成分包括揮發(fā)油、香豆素、有機酸、萜烯、多糖、甾醇等［14］，具有抗炎［15－16］、抗風濕［17］、抗氧化［18］和抗腫瘤［19］等作用?！渡褶r本草經》記載：“獨活，主風寒所擊，金瘡止痛，賁豚，癇痓，女子疝瘕。久服，輕身、耐老。一名羌活，一名羌青，一名擴羌使者。生川谷，被列為上品?！豹毣钚量辔?，善治伏風，除久痹，且性善下行，祛下焦與筋骨間的風寒濕邪。獨活和以獨活為君藥的復方被用于治療骨關節(jié)炎［20－21］，其對軟骨細胞的作用機制也是重要的研究內容［22］，但是獨活對軟骨細胞影響的潛在分子機制還有待進一步研究。

網絡藥理學是在網絡的基礎上，系統(tǒng)的篩選藥物中對某些特定疾病靶點選擇性高的成分，在理論層面觀察藥物對疾病的干預和影響，為研究藥物對疾病的作用機制提供研究方向。網絡藥理學的研究方法與中藥及復方多途徑、多靶點的作用機制相得益彰，更符合中醫(yī)整體觀和辨證論治理論的指導［23－24］。因此，本研究將基于網絡藥理學和分子對接的方法研究獨活活性成分對軟骨細胞的影響機制，為今后獨活的藥理研究和骨關節(jié)炎的治療，提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

數(shù)據(jù)庫：TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/），SEA（https：//sea.bkslab.org/），Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），Genecards（https：//www.gene?cards.org/）， String（https：//string－db.org/）， Metascape（http：//metascape.org/），PDB（http：//www.rcsb.org/）。

軟件：在線Venn 圖繪制工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），Cytoscape 3.7.2，AutoDock?Tools－1.5.6，PyMOL。

1.2 方法

1.2.1 獨活化學成分的篩選和結構處理

使用TCMSP 檢索獨活的化學成分，得到香豆素、揮發(fā)油、有機酸等成分99 個。篩選出口服利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（Druglikeness，DL）≥0.18 的9 個化學成分作為獨活的主要活性成分，并獲得活性化合物的相關靶蛋白。在Pubchem 網站上獲得獨活活性成分的2D 化學結構，導入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫，獲得相關靶蛋白。將獨活活性成分的SMILES 結構導入SEA 數(shù)據(jù)庫，獲得相關靶點。將獨活活性成分的所有相關靶點整理并保留唯一項，結果為獨活活性成分的相關靶點。

1.2.2 靶蛋白和通路的篩選與處理

以“chondrocyte”為關鍵詞從Genecards數(shù)據(jù)庫篩選靶蛋白，將得到的結果與獨活活性成分的相關靶點繪制Venn圖，獲得獨活影響軟骨細胞的潛在作用靶點。

1.2.3 基因富集分析

使用Metascape數(shù)據(jù)庫，輸入獨活影響軟骨細胞的潛在作用靶點，輸入物種（Input as species）和分析物種（Analysis as species）均選擇“Homo Sapiens”。最小交疊值（Min Overlap）為3，PValue Cutoff 值為0.01，Min Enrichment 值為1.5，對潛在靶點進行GO（Gene ontology）功能富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。

1.2.4 拓撲網絡的構建

使用上述分析獲得的數(shù)據(jù)，使用Cytoscape 軟件建立“藥物－活性成分－作用靶點－通路網絡”圖。

1.2.5 獨活影響軟骨細胞關鍵靶點分析

為了進一步研究獨活對軟骨細胞的影響機制，將相關靶點導入到String 數(shù)據(jù)庫中，研究物種選為“Homo Sapiens”，可信度最小值設定為0.900，獲得蛋白互作關系，使用Cytoscape 軟件將相關數(shù)據(jù)構建成蛋白互作網絡圖，得到獨活對軟骨細胞影響的關鍵靶點。

1.2.6 分子對接分析

將網絡藥理學篩選出的獨活活性化合物與軟骨細胞的關鍵靶點進行分子對接分析，獲得其對接親和力并查看相互作用關系。

2 結果

2.1 獨活化學成分的篩選

根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫的篩選，得到符合條件的化學物9 個，包括歐前胡素（Ammidin）、異歐前胡素（Isoimperatorin）、β－谷甾醇（beta－sitosterol）、二氫歐山芹醇乙酯（O－Acetylcolumbianetin）、當歸醇D（Angelol D）、當歸醇G（Angelol G）、當歸素（Angelicone）、［（1R，2R）－2，3－二羥基－1－（7－甲氧基－2－氧代色素－6－基）－3－甲基丁基］3－甲基丁酸酯（［（1R，2R）－2，3－dihydroxy－1－（7－methoxy－2－oxochromen－6－yl）－3－methylbutyl］3－methylbutanoate）和紫花前胡苷（nodakenin）。根據(jù)TCMSP、Swiss Target Prediction和SEA數(shù)據(jù)庫對這9個化合物進行靶標預測，整理并保留唯一項后共獲得胺氧化酶（含黃素）（Amine oxidase［flavin－containing］A，MAOA）、乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，ACHE）、β－分泌脢（Beta－secretase 1，BACE1）、細胞色素 P4501A2（Cytochrome P4501A2，CYP1A2）和芳香化酶（Aromatase，CYP19A1）等342個靶點。

2.2 靶蛋白和通路的篩選與處理

以“chondrocyte”為關鍵詞從Genecards數(shù)據(jù)庫篩選靶蛋白，得到獨活活性成分和軟骨細胞相關靶點的共有基因142個，包括高親和力神經生長因子受體（NTRK1，High affinity nerve growth factor receptor）、誘生型一氧化氮合酶（NOS2，Nitric oxide synthase，inducible）、G 蛋白偶聯(lián)受體激酶－5（GRK5，G protein－coupled receptor kinase 5）、G1/S 特異性Cyclin－E1（CCNE1，G1/Sspecific cyclin－E1）等。Venn圖見圖1。

圖1 獨活-軟骨細胞潛在作用靶點Venn圖

2.3 基因富集分析

使用Metascape數(shù)據(jù)庫，輸入獨活影響軟骨細胞的潛在作用靶點，獲得潛在靶點的GO（Gene ontology）功能富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析結果見圖2，KEGG 通路的詳細信息見表1。得到的生物過程（Biology Process，BP）條目按照P值大小排名，前十名分別為細胞對有機氮化合物的反應（cellular response to organonitrogen compound）、細胞對脂質的反應（cellular response to lipid）、MAPK 級聯(lián)反應的正調控（positive regulation of MAPK cascade）、對受傷的反應（response to wounding）、調節(jié)細胞黏附（regulation of cell adhesion）、節(jié)律過程（rhythmic process）、肽基酪氨酸磷酸化（peptidyl－tyrosine phosphorylation）、對氧氣水平的反應（response to oxygen levels）、對脂多糖的反應（response to lipopolysaccharide）和絲氨酸肽基的改變（peptidyl-serine modification）。細胞組成（cellular component，CC）條目按照P值大小排名，前十名分別為細胞質的核周區(qū)域（perinuclear region of cytoplasm）、膜區(qū)（membrane region）、受體復合體（receptor complex）、轉移酶復合物、轉移含磷基團（transferase complex， transferring phosphorus－containing groups）、溶酶體腔（endolysosome lumen）、核包膜（nuclear envelope）、線粒體膜（mitochondrial membrane）、神經細胞體（neuronal cell body）和磷脂酰肌醇3－激酶復合物（phosphatidylinositol 3－kinase complex）。 分子功能（Molecular Function，MF）條目按照P值大小排名，前十名分別為磷酸轉移酶活性、醇基為受體（phosphotransferase activity，alcohol group as acceptor）、激酶結合（kinase binding）、蛋白質酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）、核受體活性（nuclear receptor activity）、轉錄因子結合（transcription factor binding）、氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）、整聯(lián)蛋白結合（integrin binding）、激素受體結合（hormone receptor binding）和前列腺素受體活性（prostaglandin receptor activity）。KEGG通路分析共得到330個條目，根據(jù)P值大小排名前十名的分別為癌癥通路（Pathways in cancer）、癌癥中的蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer）、Ras信號通路（Ras signaling pathway）、人T細胞白血病病毒1感染（Human T－cell leukemia virus 1 infection）、Th17細胞分化（Th17 cell differentiation）、非酒精性脂肪肝疾?。∟on－alcoholic fatty liver disease）、血清素能性突觸（Serotonergic synapse）、黏附連接（Adherens junction）、鈣信號通路（Calcium signaling pathway）和cGMP－PKG 信號通路（cGMP－PKG signaling pathway）。

圖2 富集分析結果

表1 KEGG通路分析結果

2.4 拓撲網絡的構建

整理上述信息，使用Cytoscape 軟件構建“獨活－化學成分－靶點－通路－軟骨細胞網絡”圖，結果見圖3。圖中共包含163 個節(jié)點，574 條邊，表示活性成分、靶點和通路的相互作用關系。度值（degree）可以反映節(jié)點的重要性。圖中的化合物按度值排名，最高的是二氫歐山芹醇乙酯，度值為56。其次重要的有當歸素、歐前胡素、β－谷甾醇、異歐前胡素、紫花前胡苷、當歸醇D、當歸醇G 和［（1R，2R）－2，3－二羥基－1－（7－甲氧基－2－氧代色素－6－基）－3－甲基丁基］3－甲基丁酸酯，度值分別為53、37、21、17、16、8、8和8?；衔锏脑敿毿畔⒁姳?。

表2 獨活化合物度值信息

圖3 獨活－化學成分－靶點－通路－軟骨細胞網絡圖

2.5 獨活影響軟骨細胞關鍵靶點

將獨活對軟骨細胞相關作用靶點導入到String 數(shù)據(jù)庫中，使用Cytoscape 軟件將相關數(shù)據(jù)構建成蛋白互作網絡圖，見圖4。度值越大，節(jié)點的半徑越大，其中三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，Glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase）、血管內皮生長因子A（VEGFA，Vascular endothelial growth factor A）、表皮生長因子受體（EGFR，Epidermal growth factor receptor）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC，Proto－oncogene tyrosine－protein kinase Src）、絲裂原激活的蛋白激酶1（MAPK1，Mitogen－activated protein kinase 1）、半胱氨酸蛋白酶－3（CASP3，Caspase－3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白 激 酶（MTOR，Serine/threonine－protein kinase mTOR）、促分裂原活化蛋白激酶激酶－8（MAPK8，Mitogen－activated protein kinase 8）、促分裂原活化蛋白激酶激酶－14（MAPK8，Mitogen－activated protein kinase 14）和前列腺素 G/H 合酶 2（PTGS2，Prostaglandin G/H synthase 2）為排名前十名的關鍵靶點，是獨活對軟骨細胞影響的重要靶點。

圖4 蛋白互作網絡圖

2.6 分子對接

獨活活性化合物為二氫歐山芹醇乙酯，度值為56；其次重要的有當歸素、歐前胡素與對軟骨細胞影響的重要靶點GAPDH、VEGFA、EGFR 進行分子對接。在PDB 網站上，分別以GAPDH、VEGFA 和EGFR 為關鍵詞，最終分別選取PDB 編號為1ihy、6t9d 和6duk 的3 個晶體蛋白。使用Pymol 軟件將晶體蛋白進行去掉多余配體，去水處理，使用AutoDockTools－1.5.6 軟件進行加氫，加電荷處理。

使用Autodock 軟件產生格點文件，GAPDH 蛋白的格點（grid）文件坐標為：x= 45.681，y= 13.827，z=45.208；VEGFA 蛋白的格點（grid）文件坐標為：x=－6.938，y=25.5，z=10.058；EGFR蛋白的格點（grid）文件坐標為：x=35.203，y=91.559，z=－63.753。分別將3個化合物與3個受體蛋白進行分子對接，對接親和力見表3，結果顯示，對接親和力均小于－5 kcal/moL，表明均具有良好的結合效果，對接圖見圖5～7。對接親和力最優(yōu)的為二氫歐山芹醇乙酯與EGFR的對接，二氫歐山芹醇乙酯與THR854A 產生H 鍵作用，與LEU788A 產生Pi－sigma 作用，與PHE856A、LEU777A、ALA763A 和LEU858A產生烷基作用。

表3 GAPDH、VEGFA和EGFR與3個化合物的對接親和力（kcal/moL）

3 結論

OA是老年人最常見的慢性關節(jié)炎，其特點是關節(jié)軟骨逐漸退化，滑膜炎癥和疼痛，嚴重者可導致殘疾。關節(jié)軟骨是一種高度特化的組織，由細胞外基質組成，細胞外基質僅由稀疏分布的常駐細胞軟骨細胞合成。軟骨細胞的存活對于適當?shù)能浌腔|的維持非常重要，軟骨細胞功能和存活的損害將導致關節(jié)軟骨失效［13］。因此，探究藥物對軟骨細胞的影響是研究OA治療的重要方向。獨活具有養(yǎng)血舒筋、祛風祛濕、滋補肝腎的作用，以獨活為主藥的復方如獨活寄生湯、加味獨活寄生合劑對OA具有良好的治療作用［25－26］。

本文通過網絡藥理學的方法，構建了獨活化學成分－靶點網絡－通路圖，得到度值最高的化合物為二氫歐山芹醇乙酯、當歸素和歐前胡素。3 種化合物均屬于香豆素類，香豆素是一類以苯并α－吡喃酮為母核的化合物［27］。據(jù)研究，香豆素類化合物具有通過抑制破骨細胞的形成而減少骨質的丟失，促進成骨細胞的增殖而促進骨膠原的合成，有效防治類固醇性骨質疏松的作用，同時具有明顯的抗炎效果［28－29］。香豆素具有鈣離子拮抗劑的作用，可抑制鈣離子經鈣通道進入細胞，維持胞質內的鈣離子濃度在合適的水平，進而抑制細胞凋亡［25］。這說明二氫歐山芹醇乙酯，當歸素和歐前胡素可能是獨活治療OA 的標志化合物。

圖6 VEGFA 與二氫歐山芹醇乙酯（A）、當歸素（B）和歐前胡素（C）的分子對接

圖7 EGFR 與二氫歐山芹醇乙酯（A）、當歸素（B）和歐前胡素（C）的分子對接

GAPDH在細胞內含量豐富［30］。當細胞受到NO刺激后，GAPDH 將會被亞硝基化，與E3 泛素連接酶Siah1結合，發(fā)生核異位和凋亡［31］。分子對接的結果表明，獨活可能通過與GAPDH 結合，抑制GAPDH 的亞硝基化，從而影響軟骨細胞的凋亡，達到治療OA 的目的。VEGFA 是一種特異性很高，起著血管再生作用的促血管內皮細胞生長因子。李雪峰［32］等對骨關節(jié)炎患者血清和關節(jié)液中的VEGF 進行了檢測，結果表明VEGF 在骨關節(jié)炎軟骨退變的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。VEGF 可以上調抑制細胞凋亡因子的表達，從而保證軟骨細胞的存活［33］。獨活可能通過對VEGF 的影響，抑制軟骨細胞的凋亡，達到治療OA 的目的。EGFR 信號系統(tǒng)是骨骼系統(tǒng)病理、生理學的重要成員［34］。EGFR 與配體結合后激活Ras，活化的Ras 進一步激活Raf，Raf 磷酸化后激活MEK1/MEK2，進而活化ERK1 和ERK2，其下游的轉錄因子Ets、Elkh 和c－Fos進入細胞核，參與調控軟骨細胞增殖過程［35］。因此，獨活可能通過影響EGFR 的結合，調控軟骨細胞的增殖，進而治療OA。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學發(fā)現(xiàn)獨活可能通過直接或間接參與軟骨細胞的增殖、凋亡，還通過調節(jié)炎癥反應干預軟骨細胞的功能。分子對接驗證結果表明，度值前三名的化合物二氫歐山芹醇乙酯、當歸素和歐前胡素與軟骨細胞的關鍵靶點GAPDH、VEGFA和EGFR 均具有良好的結合。本研究闡述了獨活可能通過干預軟骨細胞治療OA 的作用機制，但是所得結論仍需進一步實驗證實。