王松，王雪嬌，鄭森旺，于歡，呂嘉皓，東嬌嬌，張世豪，楊柳

（黑龍江中醫(yī)藥大學北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退化和軟骨下骨改變?yōu)樘卣鞯耐诵行躁P(guān)節(jié)疾病［1］。長時間發(fā)病會導致軟骨組織纖顫、變性和碎片化［2－4］，軟骨下骨硬化、骨小梁結(jié)構(gòu)改變［5－6］，滑膜增生［7－8］，滑膜炎［9］和一系列細胞因子的改變［10－11］，嚴重甚至可能導致殘疾。近年來的研究表明，軟骨細胞的凋亡是骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵因素［4，12］。關(guān)節(jié)軟骨僅僅依靠軟骨細胞維持細胞外基質(zhì)，當軟骨細胞大量凋亡時，將會導致關(guān)節(jié)軟骨的退化［13］。因此，以抑制軟骨細胞凋亡為目的的藥物，是骨關(guān)節(jié)炎治療研究的一個重點。

獨活為傘形科植物重齒毛當歸（Angelica pubes?censMaxim，f.biserrata Shan et Yuan）的干燥根，具有祛風除濕、通痹止痛的作用。研究表明，獨活的主要活性成分包括揮發(fā)油、香豆素、有機酸、萜烯、多糖、甾醇等［14］，具有抗炎［15－16］、抗風濕［17］、抗氧化［18］和抗腫瘤［19］等作用?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載：“獨活，主風寒所擊，金瘡止痛，賁豚，癇痓，女子疝瘕。久服，輕身、耐老。一名羌活，一名羌青，一名擴羌使者。生川谷，被列為上品?！豹毣钚量辔?，善治伏風，除久痹，且性善下行，祛下焦與筋骨間的風寒濕邪。獨活和以獨活為君藥的復方被用于治療骨關(guān)節(jié)炎［20－21］，其對軟骨細胞的作用機制也是重要的研究內(nèi)容［22］，但是獨活對軟骨細胞影響的潛在分子機制還有待進一步研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是在網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)的篩選藥物中對某些特定疾病靶點選擇性高的成分，在理論層面觀察藥物對疾病的干預和影響，為研究藥物對疾病的作用機制提供研究方向。網(wǎng)絡(luò)藥理學的研究方法與中藥及復方多途徑、多靶點的作用機制相得益彰，更符合中醫(yī)整體觀和辨證論治理論的指導［23－24］。因此，本研究將基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接的方法研究獨活活性成分對軟骨細胞的影響機制，為今后獨活的藥理研究和骨關(guān)節(jié)炎的治療，提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

數(shù)據(jù)庫：TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/），SEA（https：//sea.bkslab.org/），Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），Genecards（https：//www.gene?cards.org/）， String（https：//string－db.org/）， Metascape（http：//metascape.org/），PDB（http：//www.rcsb.org/）。

軟件：在線Venn 圖繪制工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），Cytoscape 3.7.2，AutoDock?Tools－1.5.6，PyMOL。

1.2 方法

1.2.1 獨活化學成分的篩選和結(jié)構(gòu)處理

使用TCMSP 檢索獨活的化學成分，得到香豆素、揮發(fā)油、有機酸等成分99 個。篩選出口服利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（Druglikeness，DL）≥0.18 的9 個化學成分作為獨活的主要活性成分，并獲得活性化合物的相關(guān)靶蛋白。在Pubchem 網(wǎng)站上獲得獨活活性成分的2D 化學結(jié)構(gòu)，導入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫，獲得相關(guān)靶蛋白。將獨活活性成分的SMILES 結(jié)構(gòu)導入SEA 數(shù)據(jù)庫，獲得相關(guān)靶點。將獨活活性成分的所有相關(guān)靶點整理并保留唯一項，結(jié)果為獨活活性成分的相關(guān)靶點。

1.2.2 靶蛋白和通路的篩選與處理

以“chondrocyte”為關(guān)鍵詞從Genecards數(shù)據(jù)庫篩選靶蛋白，將得到的結(jié)果與獨活活性成分的相關(guān)靶點繪制Venn圖，獲得獨活影響軟骨細胞的潛在作用靶點。

1.2.3 基因富集分析

使用Metascape數(shù)據(jù)庫，輸入獨活影響軟骨細胞的潛在作用靶點，輸入物種（Input as species）和分析物種（Analysis as species）均選擇“Homo Sapiens”。最小交疊值（Min Overlap）為3，PValue Cutoff 值為0.01，Min Enrichment 值為1.5，對潛在靶點進行GO（Gene ontology）功能富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。

1.2.4 拓撲網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用上述分析獲得的數(shù)據(jù)，使用Cytoscape 軟件建立“藥物－活性成分－作用靶點－通路網(wǎng)絡(luò)”圖。

1.2.5 獨活影響軟骨細胞關(guān)鍵靶點分析

為了進一步研究獨活對軟骨細胞的影響機制，將相關(guān)靶點導入到String 數(shù)據(jù)庫中，研究物種選為“Homo Sapiens”，可信度最小值設(shè)定為0.900，獲得蛋白互作關(guān)系，使用Cytoscape 軟件將相關(guān)數(shù)據(jù)構(gòu)建成蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，得到獨活對軟骨細胞影響的關(guān)鍵靶點。

1.2.6 分子對接分析

將網(wǎng)絡(luò)藥理學篩選出的獨活活性化合物與軟骨細胞的關(guān)鍵靶點進行分子對接分析，獲得其對接親和力并查看相互作用關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 獨活化學成分的篩選

根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫的篩選，得到符合條件的化學物9 個，包括歐前胡素（Ammidin）、異歐前胡素（Isoimperatorin）、β－谷甾醇（beta－sitosterol）、二氫歐山芹醇乙酯（O－Acetylcolumbianetin）、當歸醇D（Angelol D）、當歸醇G（Angelol G）、當歸素（Angelicone）、［（1R，2R）－2，3－二羥基－1－（7－甲氧基－2－氧代色素－6－基）－3－甲基丁基］3－甲基丁酸酯（［（1R，2R）－2，3－dihydroxy－1－（7－methoxy－2－oxochromen－6－yl）－3－methylbutyl］3－methylbutanoate）和紫花前胡苷（nodakenin）。根據(jù)TCMSP、Swiss Target Prediction和SEA數(shù)據(jù)庫對這9個化合物進行靶標預測，整理并保留唯一項后共獲得胺氧化酶（含黃素）（Amine oxidase［flavin－containing］A，MAOA）、乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，ACHE）、β－分泌脢（Beta－secretase 1，BACE1）、細胞色素 P4501A2（Cytochrome P4501A2，CYP1A2）和芳香化酶（Aromatase，CYP19A1）等342個靶點。

2.2 靶蛋白和通路的篩選與處理

以“chondrocyte”為關(guān)鍵詞從Genecards數(shù)據(jù)庫篩選靶蛋白，得到獨活活性成分和軟骨細胞相關(guān)靶點的共有基因142個，包括高親和力神經(jīng)生長因子受體（NTRK1，High affinity nerve growth factor receptor）、誘生型一氧化氮合酶（NOS2，Nitric oxide synthase，inducible）、G 蛋白偶聯(lián)受體激酶－5（GRK5，G protein－coupled receptor kinase 5）、G1/S 特異性Cyclin－E1（CCNE1，G1/Sspecific cyclin－E1）等。Venn圖見圖1。

圖1 獨活-軟骨細胞潛在作用靶點Venn圖

2.3 基因富集分析

使用Metascape數(shù)據(jù)庫，輸入獨活影響軟骨細胞的潛在作用靶點，獲得潛在靶點的GO（Gene ontology）功能富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析結(jié)果見圖2，KEGG 通路的詳細信息見表1。得到的生物過程（Biology Process，BP）條目按照P值大小排名，前十名分別為細胞對有機氮化合物的反應(yīng)（cellular response to organonitrogen compound）、細胞對脂質(zhì)的反應(yīng)（cellular response to lipid）、MAPK 級聯(lián)反應(yīng)的正調(diào)控（positive regulation of MAPK cascade）、對受傷的反應(yīng)（response to wounding）、調(diào)節(jié)細胞黏附（regulation of cell adhesion）、節(jié)律過程（rhythmic process）、肽基酪氨酸磷酸化（peptidyl－tyrosine phosphorylation）、對氧氣水平的反應(yīng)（response to oxygen levels）、對脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）和絲氨酸肽基的改變（peptidyl-serine modification）。細胞組成（cellular component，CC）條目按照P值大小排名，前十名分別為細胞質(zhì)的核周區(qū)域（perinuclear region of cytoplasm）、膜區(qū)（membrane region）、受體復合體（receptor complex）、轉(zhuǎn)移酶復合物、轉(zhuǎn)移含磷基團（transferase complex， transferring phosphorus－containing groups）、溶酶體腔（endolysosome lumen）、核包膜（nuclear envelope）、線粒體膜（mitochondrial membrane）、神經(jīng)細胞體（neuronal cell body）和磷脂酰肌醇3－激酶復合物（phosphatidylinositol 3－kinase complex）。 分子功能（Molecular Function，MF）條目按照P值大小排名，前十名分別為磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、醇基為受體（phosphotransferase activity，alcohol group as acceptor）、激酶結(jié)合（kinase binding）、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）、核受體活性（nuclear receptor activity）、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（transcription factor binding）、氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）、整聯(lián)蛋白結(jié)合（integrin binding）、激素受體結(jié)合（hormone receptor binding）和前列腺素受體活性（prostaglandin receptor activity）。KEGG通路分析共得到330個條目，根據(jù)P值大小排名前十名的分別為癌癥通路（Pathways in cancer）、癌癥中的蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer）、Ras信號通路（Ras signaling pathway）、人T細胞白血病病毒1感染（Human T－cell leukemia virus 1 infection）、Th17細胞分化（Th17 cell differentiation）、非酒精性脂肪肝疾?。∟on－alcoholic fatty liver disease）、血清素能性突觸（Serotonergic synapse）、黏附連接（Adherens junction）、鈣信號通路（Calcium signaling pathway）和cGMP－PKG 信號通路（cGMP－PKG signaling pathway）。

圖2 富集分析結(jié)果

表1 KEGG通路分析結(jié)果

2.4 拓撲網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

整理上述信息，使用Cytoscape 軟件構(gòu)建“獨活－化學成分－靶點－通路－軟骨細胞網(wǎng)絡(luò)”圖，結(jié)果見圖3。圖中共包含163 個節(jié)點，574 條邊，表示活性成分、靶點和通路的相互作用關(guān)系。度值（degree）可以反映節(jié)點的重要性。圖中的化合物按度值排名，最高的是二氫歐山芹醇乙酯，度值為56。其次重要的有當歸素、歐前胡素、β－谷甾醇、異歐前胡素、紫花前胡苷、當歸醇D、當歸醇G 和［（1R，2R）－2，3－二羥基－1－（7－甲氧基－2－氧代色素－6－基）－3－甲基丁基］3－甲基丁酸酯，度值分別為53、37、21、17、16、8、8和8?；衔锏脑敿毿畔⒁姳?。

表2 獨活化合物度值信息

圖3 獨活－化學成分－靶點－通路－軟骨細胞網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 獨活影響軟骨細胞關(guān)鍵靶點

將獨活對軟骨細胞相關(guān)作用靶點導入到String 數(shù)據(jù)庫中，使用Cytoscape 軟件將相關(guān)數(shù)據(jù)構(gòu)建成蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。度值越大，節(jié)點的半徑越大，其中三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，Glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA，Vascular endothelial growth factor A）、表皮生長因子受體（EGFR，Epidermal growth factor receptor）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC，Proto－oncogene tyrosine－protein kinase Src）、絲裂原激活的蛋白激酶1（MAPK1，Mitogen－activated protein kinase 1）、半胱氨酸蛋白酶－3（CASP3，Caspase－3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白 激 酶（MTOR，Serine/threonine－protein kinase mTOR）、促分裂原活化蛋白激酶激酶－8（MAPK8，Mitogen－activated protein kinase 8）、促分裂原活化蛋白激酶激酶－14（MAPK8，Mitogen－activated protein kinase 14）和前列腺素 G/H 合酶 2（PTGS2，Prostaglandin G/H synthase 2）為排名前十名的關(guān)鍵靶點，是獨活對軟骨細胞影響的重要靶點。

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 分子對接

獨活活性化合物為二氫歐山芹醇乙酯，度值為56；其次重要的有當歸素、歐前胡素與對軟骨細胞影響的重要靶點GAPDH、VEGFA、EGFR 進行分子對接。在PDB 網(wǎng)站上，分別以GAPDH、VEGFA 和EGFR 為關(guān)鍵詞，最終分別選取PDB 編號為1ihy、6t9d 和6duk 的3 個晶體蛋白。使用Pymol 軟件將晶體蛋白進行去掉多余配體，去水處理，使用AutoDockTools－1.5.6 軟件進行加氫，加電荷處理。

使用Autodock 軟件產(chǎn)生格點文件，GAPDH 蛋白的格點（grid）文件坐標為：x= 45.681，y= 13.827，z=45.208；VEGFA 蛋白的格點（grid）文件坐標為：x=－6.938，y=25.5，z=10.058；EGFR蛋白的格點（grid）文件坐標為：x=35.203，y=91.559，z=－63.753。分別將3個化合物與3個受體蛋白進行分子對接，對接親和力見表3，結(jié)果顯示，對接親和力均小于－5 kcal/moL，表明均具有良好的結(jié)合效果，對接圖見圖5～7。對接親和力最優(yōu)的為二氫歐山芹醇乙酯與EGFR的對接，二氫歐山芹醇乙酯與THR854A 產(chǎn)生H 鍵作用，與LEU788A 產(chǎn)生Pi－sigma 作用，與PHE856A、LEU777A、ALA763A 和LEU858A產(chǎn)生烷基作用。

表3 GAPDH、VEGFA和EGFR與3個化合物的對接親和力（kcal/moL）

3 結(jié)論

OA是老年人最常見的慢性關(guān)節(jié)炎，其特點是關(guān)節(jié)軟骨逐漸退化，滑膜炎癥和疼痛，嚴重者可導致殘疾。關(guān)節(jié)軟骨是一種高度特化的組織，由細胞外基質(zhì)組成，細胞外基質(zhì)僅由稀疏分布的常駐細胞軟骨細胞合成。軟骨細胞的存活對于適當?shù)能浌腔|(zhì)的維持非常重要，軟骨細胞功能和存活的損害將導致關(guān)節(jié)軟骨失效［13］。因此，探究藥物對軟骨細胞的影響是研究OA治療的重要方向。獨活具有養(yǎng)血舒筋、祛風祛濕、滋補肝腎的作用，以獨活為主藥的復方如獨活寄生湯、加味獨活寄生合劑對OA具有良好的治療作用［25－26］。

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，構(gòu)建了獨活化學成分－靶點網(wǎng)絡(luò)－通路圖，得到度值最高的化合物為二氫歐山芹醇乙酯、當歸素和歐前胡素。3 種化合物均屬于香豆素類，香豆素是一類以苯并α－吡喃酮為母核的化合物［27］。據(jù)研究，香豆素類化合物具有通過抑制破骨細胞的形成而減少骨質(zhì)的丟失，促進成骨細胞的增殖而促進骨膠原的合成，有效防治類固醇性骨質(zhì)疏松的作用，同時具有明顯的抗炎效果［28－29］。香豆素具有鈣離子拮抗劑的作用，可抑制鈣離子經(jīng)鈣通道進入細胞，維持胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子濃度在合適的水平，進而抑制細胞凋亡［25］。這說明二氫歐山芹醇乙酯，當歸素和歐前胡素可能是獨活治療OA 的標志化合物。

圖6 VEGFA 與二氫歐山芹醇乙酯（A）、當歸素（B）和歐前胡素（C）的分子對接

圖7 EGFR 與二氫歐山芹醇乙酯（A）、當歸素（B）和歐前胡素（C）的分子對接

GAPDH在細胞內(nèi)含量豐富［30］。當細胞受到NO刺激后，GAPDH 將會被亞硝基化，與E3 泛素連接酶Siah1結(jié)合，發(fā)生核異位和凋亡［31］。分子對接的結(jié)果表明，獨活可能通過與GAPDH 結(jié)合，抑制GAPDH 的亞硝基化，從而影響軟骨細胞的凋亡，達到治療OA 的目的。VEGFA 是一種特異性很高，起著血管再生作用的促血管內(nèi)皮細胞生長因子。李雪峰［32］等對骨關(guān)節(jié)炎患者血清和關(guān)節(jié)液中的VEGF 進行了檢測，結(jié)果表明VEGF 在骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。VEGF 可以上調(diào)抑制細胞凋亡因子的表達，從而保證軟骨細胞的存活［33］。獨活可能通過對VEGF 的影響，抑制軟骨細胞的凋亡，達到治療OA 的目的。EGFR 信號系統(tǒng)是骨骼系統(tǒng)病理、生理學的重要成員［34］。EGFR 與配體結(jié)合后激活Ras，活化的Ras 進一步激活Raf，Raf 磷酸化后激活MEK1/MEK2，進而活化ERK1 和ERK2，其下游的轉(zhuǎn)錄因子Ets、Elkh 和c－Fos進入細胞核，參與調(diào)控軟骨細胞增殖過程［35］。因此，獨活可能通過影響EGFR 的結(jié)合，調(diào)控軟骨細胞的增殖，進而治療OA。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學發(fā)現(xiàn)獨活可能通過直接或間接參與軟骨細胞的增殖、凋亡，還通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)干預軟骨細胞的功能。分子對接驗證結(jié)果表明，度值前三名的化合物二氫歐山芹醇乙酯、當歸素和歐前胡素與軟骨細胞的關(guān)鍵靶點GAPDH、VEGFA和EGFR 均具有良好的結(jié)合。本研究闡述了獨活可能通過干預軟骨細胞治療OA 的作用機制，但是所得結(jié)論仍需進一步實驗證實。