高 稅， 劉 平， 陳建鋒， 余紀(jì)會

1.重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 401220；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 健康管理中心，重慶 400016

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratry distress syndrme，ARDS)是一種嚴(yán)重威脅生命的復(fù)雜、異質(zhì)性綜合征[1]。重癥社區(qū)獲得性肺炎(severe community-acquired pneumonia，sCAP)是ARDS較常見病因。由于ARDS患者病因不同或病理復(fù)雜性，因此，對治療干預(yù)的反應(yīng)也存在較大差異。在肺疾病和感染的發(fā)病機(jī)制中，微小RNAs(microRNAs，miRNAs)在基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控中起重要作用。循環(huán)外泌體是由多種血液或內(nèi)皮細(xì)胞脫落的雙層膜囊泡，含有大量miRNAs，是細(xì)胞間通訊和微環(huán)境的重要介質(zhì)。miRNA在循環(huán)外泌體中可穩(wěn)定存在，且具有較大潛力成為可靠的診斷生物標(biāo)志分子[2]。有研究表明，血清miR-146a、miR-92a可通過信號通路參與機(jī)體免疫，與sCAP患者的院內(nèi)死亡有關(guān)[3]；然而，這些外泌體miRNAs用于早期預(yù)測某些疾病結(jié)局的生物學(xué)意義尚處于探索階段。因此，本研究旨在探討血清外泌體miR-146a、miR-92a sCAP患者發(fā)生ARDS的評估價值。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2019年1月至12月重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院收治的72例sCAP患者為研究對象，其中，合并ARDS患者35例(合并ARDS組)，未合并ARDS患者37例(sCAP組)。合并ARDS組：男性26例，女性9例；年齡范圍39～86歲。sCAP組：男性30例，女性7例；年齡范圍41～89歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲；胸部X線檢查出現(xiàn)肺部浸潤，且至少出現(xiàn)以下一種體征和癥狀：咳嗽、咳痰、呼吸困難、腋下體溫>38.0℃、聽診陽性；符合《社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南(2016)》[4]社區(qū)獲得性肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)；根據(jù)肺炎嚴(yán)重指數(shù)(pneumonia severity index，PSI)評估其肺炎嚴(yán)重程度，所有患者均屬于CAP Ⅳ～Ⅴ級(PSI>90分)。排除標(biāo)準(zhǔn)：入院時，患有嚴(yán)重全身性或呼吸系統(tǒng)疾病者(包括肺結(jié)核、哮喘、慢性阻塞性肺病、特發(fā)性肺纖維化、泌尿道感染)；晚期疾病者(任何類型的惡性腫瘤、終末期肝病或腎病)；嚴(yán)重免疫抑制和拒絕知情同意者。住院期間，根據(jù)柏林定義[5]診斷ARDS的發(fā)生；并且按照患者入院28 d內(nèi)的存活情況，將合并ARDS組患者進(jìn)一步分為存活亞組(n=23)與死亡亞組(n=12)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均在入院后24 h內(nèi)簽署書面知情同意書。

1.2 研究方法 收集兩組患者的臨床資料，包括基線臨床變量、實驗室數(shù)據(jù)、急性生理和慢性健康狀況評分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHEⅡ)、序貫器官衰竭估計評分(sequential organ failure assessment，SOFA)、住院時間、住院期間的并發(fā)癥、機(jī)械通氣參數(shù)、治療情況等。同時對患者28 d病死率進(jìn)行隨訪以評估預(yù)后。在入住ICU 24 h內(nèi)，采集患者靜脈血樣，4℃下3 500 r/min離心15 min，制備血清樣本，將樣本一式兩份，一部分保存在-80℃，用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒檢測(解凍后的)血清中白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、IL-10水平。另外取0.5 ml血清樣本在4℃下3 500 r/min離心15 min，然后在12 000 r/min下第二次離心10 min，以去除殘留的細(xì)胞碎片，用全血清外泌體分離試劑盒(美國Invitrogen公司)分離純化血清外泌體，并重懸于磷酸鹽緩沖液中，-80℃保存。為了防止外泌體降解和丟失，在采血后30 min內(nèi)處理樣本。取外泌體固定在formvar涂層的銅-鈀網(wǎng)格上，用3%磷鎢酸染色，烘干后通過HT7700 Exalens透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)檢查了外泌體的大小和形態(tài)特征。并用NanoSight納米粒子追蹤分析儀追蹤外泌體顆粒粒徑分布和相對濃度，采用免疫印跡法檢測外泌體樣本中CD9、CD63表達(dá)情況。用ExoQuick?外泌體提取和RNA純化試劑盒(美國Invitrogen公司)提取外泌體總RNA。采用Bulge-loopTMmirna qRT-PCR起始試劑盒(廣州銳博)進(jìn)行反向轉(zhuǎn)錄和定量。加入cel-miR-39-3p被用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化控制。PCR的熱循環(huán)條件為：95℃初始變性20 s，隨后進(jìn)行40個循環(huán)(95℃變性10 s，60℃退火20 s，70℃延伸10 s)，熔融曲線階段確認(rèn)引物的特異性。平行進(jìn)行3次，將每個miRNA的循環(huán)閾值(Ct)標(biāo)準(zhǔn)化為cel-miR-39-3p，用2-ΔΔCt法分析miR-92a、miR-146a的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的一般資料比較 兩組患者年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、SOFA分?jǐn)?shù)、PSI、共病、并發(fā)癥等比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；合并ARDS組患者APACHEⅡ分?jǐn)?shù)以及血清CRP、PCT、IL-6、IL-10水平高于sCAP組，住院時間也長于sCAP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者的一般資料比較/例(百分率/%)

2.2 血清外泌體獲取及鑒定 用超速離心法從sCAP患者血清中提取并純化得到雙層膜結(jié)構(gòu)的球型或橢球型的囊泡，用透射電鏡觀察，顆粒分布均勻，粒徑大小約為50～150 nm。根據(jù)納米粒徑追蹤技術(shù)，顯示外泌體粒徑主要分布在75～117 nm。同時，經(jīng)Western blot法檢測，這些顆粒高表達(dá)CD9、CD63，顯示外泌體的主要特征，證實從血清樣本中成功分離得到外泌體樣本。見圖1。

圖1 從血清樣本中分離的外泌體的特性(a.透射電鏡觀察;b.納米粒徑追蹤分析;c.免疫印跡法檢測外泌體標(biāo)志物)

2.3 兩組患者血清外泌體miR-146a、miR-92a水平比較 合并ARDS組患者miR-146a、miR-92a水平均明顯高于sCAP組，兩組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者血清外泌體miR-146a、miR-92a水平比較

2.4 ROC曲線分析血清外泌體miR-146a、miR-92a預(yù)測sCAP患者發(fā)生ARDS的臨床價值 血清外泌體miR-146a、miR-92a水平預(yù)測sCAP患者發(fā)生ARDS的ROC曲線下面積(area under curve，AUC)分別為0.817(95%可信區(qū)間0.717～0.918)、0.801(95%可信區(qū)間0.688～0.913)，均超過血清CRP、PCT及APACHE Ⅱ評分預(yù)測ARDS的AUC。見表3、圖2。

表3 血清外泌體miR-146a、miR-92a水平預(yù)測sCAP患者發(fā)生ARDS的價值

圖2 miR-146a、miR-92a預(yù)測sCAP患者發(fā)生ARDS的ROC曲線

2.5 ARDS組患者血清外泌體miR-146a、miR-92a水平 入院28 d，死亡亞組患者miR-146a、miR-92a水平均高于與存活亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 死亡亞組和存活亞組ARDS組患者血清外泌體miR-146a、miR-92a水平比較

2.6 血清外泌體miR-146a、miR-92a預(yù)測ARDS患者28 d死亡的臨床價值 血清外泌體miR-146a、miR-92a水平預(yù)測ARDS患者28 d死亡的AUC分別為0.832(95%可信區(qū)間0.680～0.984)、0.859(95%可信區(qū)間0.734～0.983)。miR-92a預(yù)測ARDS患者28 d死亡的效能較高，其AUC均超過血清CRP、PCT、IL-6、IL-10及APACHE Ⅱ評分。見表5、圖3。

表5 血清外泌體miR-146a、miR-92a水平預(yù)測ARDS患者28 d死亡的價值

圖3 miR-146a、miR-92a預(yù)測ARDS患者28 d死亡的ROC曲線

3 討論

目前，ARDS的病死率為25%～40%[6]。sCAP是發(fā)生ARDS的重要原因[7]。近年來，外泌體作為miRNA載體，為新型生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供了更多啟示。本研究發(fā)現(xiàn)，合并ARDS組患者血清外泌體miR-146a、miR-92a水平顯著高于sCAP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。有研究顯示，支氣管上皮細(xì)胞來源的外泌體可調(diào)節(jié)炎癥和纖維化過程，是維持肺內(nèi)穩(wěn)態(tài)的主要因素[8]。Ismail等[9]的研究亦證明，肺泡巨噬細(xì)胞衍生的外泌體能通過轉(zhuǎn)移miRNAs到各種呼吸細(xì)胞，包括肺上皮細(xì)胞和單核細(xì)胞，以調(diào)節(jié)氣道炎癥，從而在氣道生物學(xué)和上皮重建中發(fā)揮重要作用。因此，血清外泌體miR-146a、miR-92a為檢測和監(jiān)測sCAP患者發(fā)生ARDS提供可能性。ARDS是一種病死率較高的呼吸系統(tǒng)疾病，以肺泡組織通透性增加、纖維蛋白沉積為主要特征。有研究表明，巨噬細(xì)胞是ARDS發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素[10]。Lee等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠吸入酸性物質(zhì)會引起上皮細(xì)胞衍生的外泌體囊泡的大量釋放，且這些外泌體中富含大量miRNAs，可在血清中檢測到。使用外泌體miRNA作為ARDS生物標(biāo)志物具有潛在的優(yōu)勢，首先，上皮源性或巨噬細(xì)胞源性外泌體包含的miRNAs可影響ARDS/急性肺損傷的疾病進(jìn)程；其次，外泌體的脂質(zhì)雙層膜可保護(hù)miRNA免受降解，并保證其更好的長期保存穩(wěn)定性；第三，外泌體降低了生物流體的復(fù)雜性，有助于更具體、更靈敏地檢測低豐度分子[12]。miR-146a可通過靶向白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶1和TNF受體相關(guān)因子6來調(diào)節(jié)Toll樣受體和細(xì)胞因子，參與動脈粥樣硬化的炎癥過程[13]。此外，miR-146a的異位表達(dá)可能影響原代人成纖維細(xì)胞中IL-6的分泌。有研究表明，重度膿毒癥和膿毒癥誘發(fā)的急性肺損傷患者miRNA-146a水平顯著升高，且可能是預(yù)測膿毒癥誘發(fā)急性肺損傷病死率和療效的生物標(biāo)志物[14]。此外，血清高水平miR-92a表達(dá)亦與ARDS炎癥進(jìn)展有關(guān)，可作為急性肺損傷/ARDS的潛在生物標(biāo)志[16]。余岳芬等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，ARDS患者病情越嚴(yán)重，miR-92a、miR-146a表達(dá)水平越高，miR-92a、miR-146a表達(dá)水平是ARDS患者死亡的獨立危險因素，這與本研究中外泌體miR-92a、miR146a的表達(dá)升高相似。本研究中，合并ARDS組患者血清外泌體miR-146a、miR-92a表達(dá)水平明顯高于sCAP組，提示血清miR-92a、miR-146a 表達(dá)水平可能參與了ARDS的疾病進(jìn)展。經(jīng)ROC曲線分析，血清外泌體miR-146a、miR-92a水平對sCAP患者ARDS發(fā)生風(fēng)險有一定的預(yù)測價值，靈敏度和特異度較高，且與其他指標(biāo)相比較，血清外泌體miR-92a、miR-146a 預(yù)測sCAP患者發(fā)生ARDS的AUC相對較優(yōu)，提示血清外泌體miR-92a、miR-146a預(yù)測sCAP患者發(fā)生ARDS具有更高的臨床應(yīng)用價值。另外，死亡亞組患者血清miR-92a、miR146a水平亦高于存活亞組，且檢測血清外泌體miR-92a、miR-146a對于預(yù)測sCAP合并ARDS患者28 d死亡也具有一定的臨床效能，AUC>0.700，說明血清外泌體miR-92a、miR-146a是預(yù)測sCAP合并ARDS患者28 d死亡的較佳指標(biāo)，具有較高的應(yīng)用價值。

綜上所述，血清外泌體miR-92a、miR-146a水平對預(yù)測sCAP患者ARDS發(fā)生風(fēng)險有一定的臨床價值。但本研究仍處于初步探索階段，仍需要更多的臨床研究來進(jìn)一步證實。