符方旭， 李慶志， 王 棟

1.文昌市人民醫(yī)院 全科醫(yī)學(xué)科，海南 文昌 571300；2.海南省人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，海南 ?？?570311

腦膜瘤是較常見(jiàn)的顱腦腫瘤，在各類(lèi)顱腦腫瘤中，腦膜瘤占比高達(dá)30%，臨床針對(duì)惡性腦膜瘤患者主要采用立體定向放療、手術(shù)等治療方式，但約50%的患者因病理級(jí)別高、腫瘤部位特殊、手術(shù)并發(fā)癥等因素導(dǎo)致預(yù)后欠佳[1]。因此，臨床需篩選可靠的腫瘤標(biāo)記物，進(jìn)一步掌握腦膜瘤發(fā)病機(jī)制，以便早期診斷與治療，及時(shí)對(duì)腫瘤進(jìn)展進(jìn)行預(yù)測(cè)，改善預(yù)后。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白E作為細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，但二者對(duì)腫瘤預(yù)后評(píng)估的效果尚不夠理想[2]。轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白4(GATA-binding protein 4，GATA4)與腫瘤疾病的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)，可通過(guò)結(jié)合下游靶基因，抑制或激活轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控蛋白表達(dá)水平，參與疾病進(jìn)程[3]。微小RNA(microRNA，miR)與腫瘤疾病發(fā)生、轉(zhuǎn)移、增殖有關(guān)，特異性的miR能通過(guò)調(diào)控靶基因，發(fā)揮抑癌或癌基因作用[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-195能下調(diào)胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體，抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移與增殖，提示miR-195在腫瘤疾病中可能發(fā)揮重要作用[6]。本研究旨在探討惡性腦膜瘤組織中GATA-4、miR-195表達(dá)水平，分析其與患者預(yù)后的關(guān)系，旨在為該病治療提供新思路與新靶點(diǎn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取文昌市人民醫(yī)院自2015年5月至2019年5月收治的110例惡性腦膜瘤患者為研究對(duì)象，取腦膜瘤組織、瘤旁組織進(jìn)行檢測(cè)。其中，男性43例，女性67例；年齡范圍43～69歲，年齡(56.49±11.25)歲；世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)病理分級(jí)，Ⅱ級(jí)41例，Ⅲ級(jí)69例；腦膜瘤直徑范圍1～6 cm，腦膜瘤直徑(3.43±1.25)cm；腫瘤部位，額部49例，蝶骨嵴36例，巖骨斜坡15例，其他10例；上皮型53例，纖維型19例，過(guò)渡型27例，其他11例；顱外轉(zhuǎn)移47例。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲；患者均行手術(shù)治療，通過(guò)手術(shù)病理確診為惡性腦膜瘤；意識(shí)清醒，認(rèn)知功能正常；術(shù)前及術(shù)后CT、MRI資料保存完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前有化療、放療史；術(shù)前有顱腦外傷史；既往有顱腦手術(shù)史；有肝、腎、心等重要臟器損害；患有艾滋病、病毒性肝炎等傳染性疾?。粺o(wú)法獲取病理組織與癌旁組織。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 GATA4檢測(cè) 采用免疫組化法檢測(cè)GATA4表達(dá)水平。(1)分別取腦膜瘤組織、瘤旁組織制備切片，存放在5℃環(huán)境中備用。(2)切片染色：脫蠟，將切片置于二甲苯溶液浸泡20 min；蘇木精浸泡染色至少5 min；酸性液、堿性液分別浸泡；清水沖洗1～2 h，置于蒸餾水5 min；行伊紅染色3～5 min；二甲苯透明；封片，干燥后備用。(3)鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)染色：脫蠟，依次在無(wú)水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇內(nèi)浸泡，并經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗20 min；行抗原修復(fù)，在高壓、高溫狀態(tài)下反應(yīng)20 min，水溫≥98℃，然后冷卻，經(jīng)PBS液沖洗10 min；取5%雙氧水加入，40℃反應(yīng)20 min；經(jīng)羊血清封閉液將非特異性抗體封閉，37℃反應(yīng)10 min；加入50 μl一抗，4℃反應(yīng)24 h，經(jīng)PBS液沖洗15 min；滴加二抗，在室溫下放置30 min，經(jīng)PBS液沖洗20 min；在顯微鏡下，按照所需染色程度選擇性二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzine，DAB)染色；行蘇木精染色5 min；經(jīng)稀鹽酸、無(wú)水乙醇分別浸泡1 min，清水沖洗5 min；干燥后進(jìn)行封片。(4)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[7]：利用顯微鏡觀察細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)結(jié)果圖像均隨機(jī)選取5個(gè)視野，分析100個(gè)細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，胞質(zhì)顏色為棕褐色、棕黃色、淡黃色則為陽(yáng)性。染色強(qiáng)度計(jì)分，無(wú)染色、淡黃、棕黃或褐色、深褐色分別計(jì)0、1、2、3分。陽(yáng)性細(xì)胞占比計(jì)分，陽(yáng)性細(xì)胞<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、陽(yáng)性細(xì)胞>75%分別計(jì)0、1、2、3、4分。二者積分乘積為0分提示陰性，1～2分、3～5分、積分乘積>5分則分別為弱陽(yáng)性、陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性。

1.2.2 miR-195檢測(cè) 利用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)法檢測(cè)miR-195表達(dá)水平。根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取RNA，測(cè)定RNA濃度、純度后，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，存放至-30℃冰箱備用。擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)如下：miR-195上游序列為5′-CGTAGCAGCACAGAAAT-3′， miR-195下游序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；以U6作為內(nèi)參基因，上游序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游序列為3′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-5′。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃延伸15 s，72℃退火15 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt值表示miR-195的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 觀察指標(biāo) 分析不同GATA4、miR-195表達(dá)情況患者臨床病理特征?；颊咝g(shù)后隨訪24個(gè)月，通過(guò)電話(huà)或微信方式進(jìn)行，每間隔3個(gè)月隨訪1次，在此期間，患者根據(jù)醫(yī)囑入院復(fù)查，觀察病情變化，分析影響惡性腦膜瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

2 結(jié)果

2.1 GATA4、miR-195表達(dá)情況比較 免疫組化結(jié)果顯示，腦膜瘤組織可見(jiàn)明顯的棕黃、棕褐色染色，表明陽(yáng)性細(xì)胞較多，見(jiàn)圖1；瘤旁組織中染色不明顯，表明陽(yáng)性細(xì)胞較少，見(jiàn)圖2。腦膜瘤組織中GATA4陽(yáng)性表達(dá)率高于瘤旁組織，miR-195表達(dá)量低于瘤旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

圖1 GATA4在腦膜瘤組織中表達(dá)(蘇木精-伊紅染色法×400)

圖2 GATA4在瘤旁組織中表達(dá)(蘇木精-伊紅染色法×400)

表1 GATA4、miR-195表達(dá)情況/例(百分率/%)

2.2 GATA4表達(dá)與惡性腦膜瘤患者病理特征關(guān)系 GATA4陽(yáng)性患者WHO病理Ⅲ級(jí)、顱外轉(zhuǎn)移占比高于GATA4陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 GATA4表達(dá)與惡性腦膜瘤患者病理特征關(guān)系/例(百分率/%)

2.3 miR-195表達(dá)與惡性腦膜瘤患者病理特征關(guān)系 根據(jù)惡性腦膜瘤患者瘤體組織中miR-195表達(dá)均值(0.69±0.14)分為miR-195低表達(dá)(n=51，miR-195<0.69)與miR-195高表達(dá)(n=59，miR-195≥0.69)。miR-195高表達(dá)患者WHO病理Ⅲ級(jí)、顱外轉(zhuǎn)移占比低于miR-195低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 miR-195表達(dá)與惡性腦膜瘤患者病理特征關(guān)系/例(百分率/%)

表4 惡性腦膜瘤患者預(yù)后影響因素的COX單因素分析

2.4 惡性腦膜瘤患者預(yù)后影響因素分析 COX單因素分析顯示，WHO病理Ⅲ級(jí)、腦膜瘤直徑≥3 cm、顱外轉(zhuǎn)移、GATA4陽(yáng)性、miR-195高表達(dá)可能與預(yù)后有關(guān)(P<0.05)。COX多因素分析顯示，WHO病理Ⅲ級(jí)、顱外轉(zhuǎn)移、GATA4陽(yáng)性是患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，miR-195高表達(dá)是患者預(yù)后的保護(hù)性因素(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 惡性腦膜瘤患者預(yù)后影響因素的COX多因素分析

3 討論

腦膜瘤多以良性為主，惡性腦膜瘤即病理學(xué)上出現(xiàn)明顯類(lèi)高級(jí)別肉瘤、類(lèi)黑色素瘤、類(lèi)癌等惡性表型特征的腦膜瘤，其發(fā)生原因較復(fù)雜，可能與抑癌基因突變、染色體缺失等有關(guān)[8]。在惡性腦膜瘤中，顱底腫瘤的手術(shù)難度大，復(fù)發(fā)率達(dá)15.5%，甚至有患者出現(xiàn)術(shù)后永久性神經(jīng)功能障礙[9]。為改善患者預(yù)后，臨床需尋求可靠的腫瘤標(biāo)記物，以便提供針對(duì)性干預(yù)方案。有研究報(bào)道，GATA4與腫瘤疾病發(fā)生有關(guān)且作用機(jī)制復(fù)雜，其在部分腫瘤中起抑癌作用，如肝癌、肺癌等，但在肝母細(xì)胞瘤中具有癌基因作用，促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)[10-11]。miR-195在結(jié)直腸癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，可能通過(guò)阻斷Notch通路，參與結(jié)直腸癌進(jìn)展[12]。

GATA4是GATA家族的一員，能引起上皮特異性標(biāo)志物失表達(dá)，在不同惡性腫瘤中表達(dá)水平存在差異。GATA4在多種癌細(xì)胞中具有抑癌作用，其能抑制乳腺癌患者的核轉(zhuǎn)錄因子-kB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而抑制癌細(xì)胞增殖，是預(yù)后的保護(hù)性因素，且乳腺癌組織中GATA4表達(dá)水平低于鄰近組織[13]。而GATA4在鼻咽癌組織中的甲基化頻率非常低，在鼻咽癌組織中呈高表達(dá)[14]。由此可見(jiàn)，GATA4具有抑癌、促癌兩種作用。本研究結(jié)果顯示，腦膜瘤組織中GATA4以陽(yáng)性表達(dá)為主，提示GATA4在腦膜瘤中發(fā)揮促癌作用，其可能通過(guò)調(diào)控特異性基因，發(fā)揮癌基因作用，對(duì)癌細(xì)胞分化、增殖進(jìn)行誘導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生與進(jìn)展。

張玉虹等[15]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌患者血漿miR-195表達(dá)量下調(diào)，且其在瘤體組織內(nèi)表達(dá)較瘤旁組織降低，提示其可能具備某種抑癌基因活性。郭芳等[16]研究提示，miR-195能通過(guò)靶向調(diào)節(jié)Raf1抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這可能是miR-195抑癌的機(jī)制之一。本研究結(jié)果顯示，腦膜瘤組織中miR-195表達(dá)量低于瘤旁組織，提示miR-195具有抑癌作用。

惡性腦膜瘤患者GATA4、miR-195表達(dá)可能與多種因素有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，GATA4陽(yáng)性及miR-195低表達(dá)患者的WHO Ⅲ級(jí)、顱外轉(zhuǎn)移占比明顯增高。WHO分級(jí)越高，顱外轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)越大，腫瘤侵襲性越強(qiáng)，而GATA4在惡性腦膜瘤中呈特異性高表達(dá)，miR-195則呈低表達(dá)，過(guò)表達(dá)的GATA4以及低表達(dá)的miR-195在惡性腦膜瘤病理進(jìn)展、顱外轉(zhuǎn)移中均發(fā)揮了作用，二者異常表達(dá)越明顯，越能促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展，增加顱外轉(zhuǎn)移的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，GATA4陽(yáng)性是預(yù)后危險(xiǎn)因素，而miR-195高表達(dá)是預(yù)后的保護(hù)因素。GATA4高表達(dá)能抑制miR15b表達(dá)，加速腫瘤細(xì)胞的分化、增殖，提高腫瘤侵襲性；GATA4過(guò)表達(dá)的患者腫瘤細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，GATA4可能將miR15家族轉(zhuǎn)錄激活，調(diào)節(jié)下游靶基因信號(hào)傳導(dǎo)，從而下調(diào)抑癌基因表達(dá)，導(dǎo)致機(jī)體促癌細(xì)胞凋亡作用減低，促進(jìn)腫瘤發(fā)生、進(jìn)展[17]。miR195能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1、E水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，而當(dāng)其呈低表達(dá)時(shí)，促癌細(xì)胞凋亡作用削弱或喪失，導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖，當(dāng)miR-195表達(dá)增高時(shí)，能抑制癌細(xì)胞活性[18]。胥琳琳等[19]研究提示，miR-195在宮頸癌中呈低表達(dá)，且對(duì)宮頸癌預(yù)后有一定評(píng)估價(jià)值。因此，臨床可考慮將調(diào)節(jié)GATA4、miR-195表達(dá)作為治療惡性腦膜瘤的一種新型靶向指標(biāo)，為該病治療提供新方向。本研究還存在一定局限性，未能發(fā)掘GATA4對(duì)基因進(jìn)行調(diào)控的結(jié)合位點(diǎn)，且對(duì)于GATA4的研究處于初步探索階段，還需進(jìn)一步深入探討。

綜上所述，惡性腦膜瘤組織中轉(zhuǎn)錄因子GATA4以陽(yáng)性表達(dá)為主，miR-195表達(dá)則明顯下調(diào)，WHO病理Ⅲ級(jí)、顱外轉(zhuǎn)移、GATA4陽(yáng)性是患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，miR-195高表達(dá)是患者預(yù)后的保護(hù)性因素。