劉 曉， 蘭 圖， 劉芳靜， 蹇京宴， 甘榆訊

自貢市第一人民醫(yī)院 眼科，四川 自貢 643000

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一，其病變基礎是人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞(human retinal endothelial cells，hRECs)功能障礙[1]。在高糖(high glucose，HG)作用下，hRECs啟動氧化應激，產(chǎn)生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)；而硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)可抑制硫氧還蛋白的抗氧化功能，導致HG作用下的hRECs產(chǎn)生ROS積累和氧化應激損傷[2]。TXNIP是細胞氧化應激和含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLR family pyrin domain containing protein 3，NLRP3)炎癥小體之間的橋梁[3]。NLRP3炎癥小體是細胞內(nèi)固有免疫蛋白，被認為是病原體和損傷相關分子模式的傳感器。而葡萄糖異常被認為是無菌炎癥反應的重要觸發(fā)因素，這種炎癥反應主要由NLRP3炎癥小體介導[4]。因此，ROS/TXNIP/NLRP3通路可能是治療因HG引起的微血管病變的有效作用靶點。維生素D(vitamin D，VD)是一種可溶于脂肪的甾體類藥物，其活性代謝產(chǎn)物1,25-(OH)2D3與內(nèi)源性細胞因子類似，可參與多種信號通路的調(diào)節(jié)，包括抑制凋亡、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等[5]。蘇嬌等[6]研究發(fā)現(xiàn)，血清1,25-(OH)2D3水平降低是2型糖尿病患者DR的獨立預測因子。本研究旨在探討VD3在介導HG誘導的hRECs凋亡及NLRP3炎癥小體活性中的作用，并分析ROS/TXNIP/NLRP3通路在VD3抑制hRECs凋亡過程中的作用。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞 hRECs(貨號：ACBRI 181)由美國Kirkland細胞實驗室提供。

1.2 主要試劑與儀器 Lonza EGM-2 BulletKit內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基購自瑞士Lonza公司；N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)購自美國Sigma公司；Ultrapure RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA合成試劑盒、SYBR Green Master Mix試劑盒購自北京CWBIO公司。CCK-8試劑盒、ROS檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測試劑盒、白細胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、白細胞介素18(interleukin 18，IL-18)試劑盒購自南京建成生物研究所；Annexin V-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)流式細胞檢測試劑盒、BD FACS Canto Ⅱ流式細胞儀購自美國BD公司；蛋白定量試劑盒購自美國Pierce；LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒購自美國Invitrogen公司；小鼠抗人NLRP3多克隆抗體、兔抗人凋亡相關斑點樣蛋白包含caspase結(jié)構域(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)單克隆抗體、兔抗人半胱天冬氨酸酶1前體(pro-caspase-1)多克隆抗體、cleaved caspase-1多克隆抗體、大鼠抗人TXNIP多克隆抗體購自美國Adipogen公司；免疫印跡二抗免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)購自Abcam公司。SpectraMax M4多功能酶標儀購自美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與分組 將hRECS培養(yǎng)在EGM-2 BulletKit內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素，細胞培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5% CO2。P3～P7代細胞被用于本研究。取饑餓培養(yǎng)24 h后的hRECs分為正常濃度(normal glucose，NG)組、高滲組、HG組、HG+陰性對照(negative control，NC)組、HG+小干擾RNA靶向的硫氧還蛋白相互作用蛋白(small interfering RNA targeting TNXNIP，siTXNIP)組、VD3+HG組、VD3+HG+NC組、VD3+HG+TXNIP組、NAC+HG組。NG組采用含有5.0 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)；高滲組采用含有50.0 mmol/L甘露醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)；其余7組用含有50.0 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)。其中，HG+NC組、VD3+HG+NC組轉(zhuǎn)染陰性對照無序序列(pcDNA3.1-scramble)；HG+siTXNIP組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-siTXNIP；VD3+HG+TXNIP組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TXNIP質(zhì)粒；VD3+HG組、VD3+HG+NC組、VD3+HG+TXNIP組在培養(yǎng)基中加入50.0 nmol/L濃度的VD3；NAC+HG組加入ROS清除劑NAC，濃度為10.0 mmol/L。各組hRECs均培養(yǎng)48 h。

1.3.2 質(zhì)粒構建與轉(zhuǎn)染 無序siRNA正義序列為5′-GAA CUG AUG ACA GGG AGG CTT-3′，反義序列為5′-GAA GAA GUC GUG CUG CCU UTT-3′；TXNIP siRNA正義序列為5′-UGG UCA CGU CGA AAU GAA UTT-3′，反義序列為5′-TTG ACA CGU GCU CCC UAC GUG-3′。通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法擴增正常hRECs的cDNA，獲得TXNIP全長編碼區(qū)，然后，亞克隆到pcDNA3.1載體上。轉(zhuǎn)染方法：將hRECs細胞培養(yǎng)至80%融合，用LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染4 μg pcDNA3.1-siTXNIP或pcDNA3.1-TXNIP質(zhì)粒。用pcDNA3.1-scramble質(zhì)粒作為陰性對照。培養(yǎng)48 h后收集細胞。

1.3.3 細胞增殖情況 采用CCK-8法檢測。取對數(shù)生長期hRECs接種于96孔板上(2×104個/ml，100 μl/孔)，分別于NG環(huán)境與HG環(huán)境下經(jīng)不同濃度(5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 mmol/L)VD3處理48 h后，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，輕微混勻，繼續(xù)孵育2 h后，用SpectraMax M4多功能酶標儀于450 nm波長下測光密度值(optical density，OD)。

1.3.4 細胞RNA提取與RT-PCR法檢測TXNIP mRNA表達 收集細胞，用Ultrapure RNA提取試劑盒提取細胞總RNA。利用HiFi-MMLV cDNA合成試劑盒將2 μg總RNA合成cDNA。應用StepOnePlus Real-Time PCR生物系統(tǒng)，采用SYBR Green Master Mix試劑盒進行qRT-PCR，擴增4.4 μl cDNA片段，總體積為20.0 μl。95℃下進行30 min初始變性步驟，然后，進行40個循環(huán)(95℃變性30 s，60℃退火10 s)。通過熔融曲線分析確定擴增產(chǎn)物的特異性。通過連續(xù)稀釋已知數(shù)量的相應基因模板，生成每個基因的標準曲線。采用2-ΔΔCt法計算TXNIP mRNA的相對表達量。目的基因的擴增被歸一化為肌動蛋白(β-Actin)表達。TXNIP引物：正向為5′-TTG GGT GGC ATG CAA GGT AT-3′；反向為5′-GCA GTG CAA ACA GAC TTC GG-3′，534 bp；β-Actin引物：正向為5′-TCC TGC GTC TGG ACC TGG-3′；反向為5′-TGA TGT CAC GGA CGA TTT CC-3′，114 bp。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 收集NG組、高滲組、HG組、VD3+HG組細胞各104個，用500 μl結(jié)合緩沖液重懸。加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI在4℃黑暗條件下孵育15 min后，用流式細胞儀分析細胞增殖情況，并計算Q2和Q3象限細胞凋亡率之和。

1.3.6 免疫熒光法檢測細胞內(nèi)ROS含量 以2′,7′-二氯二氫熒光素乙酸酯(2′,7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)熒光探針檢測細胞內(nèi)ROS水平。收集NG組、高滲組、HG組、VD3+HG組、NAC+HG組細胞爬片，用4%多聚甲醛固定后，滴加10 μmol/L DCFH-DA熒光探針37℃避光培養(yǎng)30 min，用熒光顯微鏡攝取圖像并用Image-pro plus 6.0軟件進行量化。

1.3.7 酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測氧化應激及炎癥反應相關指標 將NG組、高滲組、HG組、VD3+HG組、NAC+HG組細胞培養(yǎng)48 h后，收集上清液，采用蛋白定量試劑盒定量蛋白濃度。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒測定細胞上清液中SOD活性及MDA、GSH-Px、IL-1β、IL-18含量。

1.3.8 蛋白印跡法檢測蛋白相對表達量 細胞培養(yǎng)48 h后，收集細胞，加入細胞裂解緩沖液裂解5 min。采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。在Tris/甘氨酸/SDS緩沖液中，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白(30～30 mg)，并在聚偏二氟乙烯膜上進行電印跡。在含5%脫脂牛奶的Tween-20磷酸鹽緩沖鹽水中封閉1～2 h后，用初級抗體在4℃的溫度下過夜孵育。隨后將膜與辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗鼠或山羊抗兔IgG次級抗體孵育1 h，使用ECL蛋白質(zhì)印跡檢測試劑對蛋白條帶進行顯色，對蛋白條帶進行灰度掃描分析并以β-tubulin為內(nèi)參計算蛋白的相對表達量。主要抗體包括NLRP3(1∶1 000)、ASC(1∶1 500)、pro-caspase-1(1∶2 000)、cleaved caspase-1(1∶2 000)、TXNIP(1∶1 500)。

1.3.9 免疫共沉淀法檢測TXNIP和NLRP3的相互作用 收集NG組、HG組、VD3+HG組、NAC+HG組蛋白，加入抗TXNIP或NLRP3的抗體，4℃孵育2 h。再加入蛋白A/G磁珠孵育過夜。10 000 r/min高速離心1 min,棄上清。洗滌后進行蛋白印跡法檢測。

2 結(jié)果

2.1 VD3對hRECs細胞存活率的影響 經(jīng)不同濃度(5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 mmol·L-1)VD3處理48 h后，NG環(huán)境下hRECs細胞存活率均>95%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。HG環(huán)境下，隨著VD3濃度的升高，hRECs細胞存活率逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。當VD3濃度≥50.0 mmol/L時，HG環(huán)境下hRECs細胞存活率>80%，但VD3濃度為50.0、100.0 mmol/L時，HG環(huán)境下hRECs細胞存活率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。因此，選擇50.0 mmol/L濃度的VD3用于后續(xù)實驗。

表1 NG環(huán)境、HG環(huán)境下hRECs細胞經(jīng)不同濃度VD3處理后的存活率

2.2 VD3對HG誘導hRECs細胞凋亡的作用 經(jīng)流式細胞術檢測結(jié)果顯示，HG組hRECs細胞凋亡率為(38.65%±4.79%)、VD3+HG組hRECs細胞凋亡率為(17.50%±3.69%)，均顯著高于NG組的(2.70%±0.78%)、高滲組的(3.65%±0.84%)，但VD3+HG組hRECs細胞凋亡率顯著低于HG組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 流式細胞術檢測hRECs細胞凋亡情況(a.NG組；b.高滲組；c.HG組；d.VD3+HG組)

2.3 VD3抑制HG誘導的hRECs細胞ROS生成 免疫熒光染色法檢測結(jié)果顯示，與NG組、高滲組比較，HG組細胞ROS熒光表達量升高；與HG組比較，VD3+HG組、NAC+HG組細胞ROS熒光表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。VD3+HG組與NAC+HG組細胞ROS熒光表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 免疫熒光染色法檢測ROS熒光表達情況(400倍；a.NG組；b.高滲組；c.HG組；d.VD3+HG組；e.NAC+HG組)

2.4 VD3抑制HG誘導的hRECs細胞氧化應激反應及炎癥因子分泌 HG組細胞培養(yǎng)上清中SOD、GSH-Px含量顯著低于NG組、高滲組，MDA、IL-1β、IL-18含量顯著高于NG組、高滲組；VD3+HG組、NAC+HG組細胞培養(yǎng)上清中SOD、GSH-Px含量顯著高于HG組， MDA、IL-1β、IL-18含量顯著低于HG組；NAC+HG組細胞培養(yǎng)上清中GSH-Px含量高于VD3+HG組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。VD3+HG組、NAC+HG組細胞培養(yǎng)上清中SOD、MDA、IL-1β、IL-18含量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 hRECs細胞氧化應激因子及炎癥因子水平比較

2.5 VD3抑制HG誘導的hRECs細胞NLRP3炎癥小體激活 經(jīng)蛋白印跡法檢測，HG組細胞NLRP3、ASC、pro-caspase-1蛋白表達量高于NG組、高滲組；VD3+HG組細胞NLRP3、ASC、pro-caspase-1蛋白表達量低于HG組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 蛋白印跡法檢測NLRP3炎癥小體相關蛋白表達量

2.6 TXNIP參與調(diào)節(jié)VD3對NLRP3炎癥小體激活的抑制 與HG組、HG+NC組比較，HG+siTXNIP組、VD3+HG組細胞NLRP3、ASC、pro-caspase-1蛋白表達量降低；與VD3+HG組、VD3+HG+NC組比較，VD3+HG+TXNIP組細胞NLRP3、ASC、pro-caspase-1蛋白表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 蛋白印跡法檢測TXNIP蛋白與NLRP3炎癥小體相關蛋白表達量

2.7 免疫共沉淀法檢測TXNIP與NLRP3蛋白相互作用 與NG組比較，HG環(huán)境下TXNIP和NLRP3蛋白間相互作用增加，而VD3+HG組則抑制這種相互作用。見圖5。

圖5 免疫共沉淀法檢測TXNIP與NLRP3蛋白表達(IB:免疫印跡；IP：免疫共沉淀)

3 討論

DR是一種糖尿病相關的并發(fā)癥，其特征是視網(wǎng)膜微血管不可逆轉(zhuǎn)的惡化，導致嚴重的視網(wǎng)膜損傷和視力下降[7]。目前,DR的治療嚴重依賴于控制高血糖。然而，由于代謝記憶效應，盡管許多糖尿病患者嚴格控制血糖，仍會發(fā)展成視網(wǎng)膜病變[8]。因此，需要通過對DR的病理和生理機制深入了解，探索新的治療途徑。VD3除在鈣吸收和骨代謝方面的作用外，還被證明具有自分泌或旁分泌的免疫調(diào)節(jié)作用[9]。王曉紅等[10]研究報道，VD3缺乏與DR的發(fā)生和進展有關，排除年齡、性別等混雜因素的影響后，VD3是2型糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的重要保護因素。本研究通過建立HG誘導的hRECs細胞模型證實，VD3對DR有顯著的保護作用，可減少HG誘導的hRECs細胞凋亡；TXNIP/NLRP3通路是由于HG誘導ROS大量產(chǎn)生而被激活，VD3可通過降低細胞內(nèi)ROS水平，阻斷TXNIP/NLRP3信號通路激活，并抑制細胞炎癥因子IL-1β、IL-18等分泌，對HG環(huán)境下的hRECs發(fā)揮一定的保護作用。這可能是VD3減輕視網(wǎng)膜炎癥，保護視網(wǎng)膜免受高血糖引起的功能障礙的主要分子機制。

DR是一種涉及視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞氧化應激損傷和細胞過度凋亡的慢性炎癥性疾病[11]。有研究報道，IL-1β在DR發(fā)展中起重要作用，而IL-1β的分泌是受稱為“炎癥體”的蛋白質(zhì)復合體調(diào)節(jié)[12]。NLRP3炎性小體復合體包含轉(zhuǎn)錄因子NLRP3、ASC、pro-caspase-1。NLRP3可介導caspase-1的激活，導致pro-IL-1β和pro-IL-18分裂成活性形式[13]。Loukovaara等[14]研究證實，氧化應激可上調(diào)NLRP3炎癥小體表達，并參與DR的發(fā)病過程。Liu等[15]研究證實，過氧化物酶體增殖物激活受體α激動劑非諾貝特通過上調(diào)核因子促紅細胞生成素2相關因子2信號通路和下調(diào)NLRP3炎癥小體激活，進而改善DR。Trotta等[16]研究證實，3-羥基丁酸通過激活視網(wǎng)膜羥基羧酸受體2受體減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，阻斷NLRP3炎癥小體合成，抑制糖尿病視網(wǎng)膜損傷。上述研究可說明NLRP3炎癥體是DR的重要治療靶點。本研究證實，HG環(huán)境下可通過誘導細胞產(chǎn)生大量ROS，激活hRECs細胞NLRP3炎癥小體，促使IL-1β、IL-18等炎癥因子合成泌增加，進而導致hRECs細胞發(fā)生氧化應激損傷和凋亡，而HG環(huán)境誘導NLRP3炎癥小體的激活可被VD3所抑制。

TXNIP最初被認為是一種與硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)相互作用，降低其功能，清除ROS的蛋白質(zhì)[17]。有研究報道，TXNIP在糖尿病和其他氧化應激患者中，通過激活NLRP3炎癥小體和釋放IL-1β促進機體的固有免疫應答[18]。本研究證實，HG會誘導hRECs細胞產(chǎn)生大量ROS，這是糖尿病微血管病變的多種典型分子機制途徑中的共同上游事件。通過上調(diào)ROS敏感TXNIP蛋白表達，激活NLRP3炎癥小體，導致hRECs細胞發(fā)生氧化應激損傷，并生成IL-1β、IL-18等炎癥因子，促使細胞凋亡。而VD3可通過降解HG誘導的hRECs細胞ROS合成，抑制TXNIP/NLRP3通路活化。

綜上所述，VD3對于HG作用下視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞損傷具有一定的保護作用，并抑制hRECs細胞凋亡。其作用機制是由于VD3可抑制高糖誘導的hRECs細胞中ROS產(chǎn)生，進而抑制TXNIP/NLRP3炎癥通路激活。VD3在DR的治療方面有較大潛力，但需要大樣本臨床研究以及更深入的分子機制研究以證實VD3的臨床效果。