◎ 賈寶珠，馬斐然，邱芷靖，袁鈺佩，楊金易，羅 林

（1.廣東第二師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，廣東 廣州 510303；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

組胺是一種肉類、高蛋白食品腐敗產(chǎn)生的生物胺，超量攝入組胺會(huì)引起組胺中毒，威脅人們的身體健康[1]。美國(guó)FDA限定進(jìn)口水產(chǎn)品中的組胺殘留不能超過(guò)50 mg·kg-1[2]。因此加強(qiáng)對(duì)食品中組胺的檢測(cè)非常有必要。以抗原-抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫檢測(cè)技術(shù)具有分析時(shí)間短、操作便捷、靈敏性高、特異性好、通量高、檢測(cè)成本低等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已被廣泛用于食品安全檢測(cè)[3]。采用免疫分析法檢測(cè)食品中組胺時(shí)，由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，加之組胺分子極性較大，水溶性較好，難以與水溶性雜質(zhì)分離，通常需要對(duì)樣品提取液進(jìn)行高倍數(shù)的稀釋，降低實(shí)際樣品的檢測(cè)靈敏度及準(zhǔn)確度[4-5]。

本研究采用本體聚合法，以組胺為模板分子，二乙烯基苯為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，甲基丙烯酸與二烯丙基胺為混合功能單體，制備了適用于水相體系對(duì)組胺特異性吸附的分子印跡聚合物。并將其作為固相萃取材料對(duì)肉類樣品中的組胺進(jìn)行富集與凈化，并結(jié)合酶聯(lián)免疫分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)肉類食品中組胺的快速檢測(cè)，該方法快速、便捷、成本低、靈敏度低、準(zhǔn)確性好。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

組胺二鹽酸鹽，組氨酸，酪胺，苯乙胺，購(gòu)自于天津西恩思生化科技有限公司；二乙烯基苯（DVB）、偶氮二異丁腈（AIBN）、甲基丙烯酸（MAA）、二烯丙基胺，購(gòu)自于阿拉丁試劑。VERTEX 70傅里葉紅外光譜，德國(guó) BRUKER公司；Multiskan MK3酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 組胺分子印跡聚合物的制備

稱取0.111 g（1 mmol）組胺溶于4 mL甲醇中，加入2 mmol甲基丙烯酸和2 mmol二烯丙基胺，20 mmol DVB，磁力攪拌30 min，再加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈120 mg，在超聲波振蕩器中振蕩15 min，密封體系，60 ℃水浴加熱聚合反應(yīng)12 h，得到白色聚合物，去除表面未反應(yīng)的粘稠物。在50 ℃下鼓風(fēng)烘0.5 h。將干燥的疏松聚合物破碎，用150 目的不銹鋼篩網(wǎng)篩分，使用甲醇-乙酸（v∶v/1∶9）溶液，索氏提取48 h，除去組胺。將聚合物粉末移至甲醇中除去乙酸，再測(cè)定殘留組胺的濃度，直至模板被完全洗脫，得到分子印跡聚合物（dMIPP）。制備非分子印跡聚合物（dNIPP），除不添加模版分子外，其余的制備方法同上。

1.2.2 分子印跡聚合物的表征

分別取一定量的分子印跡聚合物粉末，60 ℃干燥12 h，將MIP粉末進(jìn)行真空干燥，取少量該粉末于研缽中，與氯化鎂一起研磨，壓片處理，使用VERTEX 70（BRUKER）儀器進(jìn)行紅外吸收光譜掃描，測(cè)定分子印跡聚合物表面基團(tuán)分布情況。

1.2.3 材料吸附性能研究

（1）靜態(tài)吸附。將一定量的分子印跡材料放入一定體積系列濃度目標(biāo)分子的水溶液中，用緩沖溶液調(diào)整溶液的pH值至某一數(shù)值，在常溫下吸附24 h，用高效液相法測(cè)定吸附前后溶液中化合物的濃度，按式1計(jì)算分子印跡材料的吸附容量。

式中：C0為吸附前溶液濃度，μg·L-1；Ce為吸附后平衡溶液的濃度，μg·L-1；W為分子印跡材料的質(zhì)量，mg；V為溶液的體積，mL；Q為分子印跡材料的吸附容量，mg·g-1。

（2）選擇性性能測(cè)試。選取組胺、酪胺、苯乙胺、色胺，各自分別配成0.01 mg·mL-1、0.001 mg·mL-1兩個(gè)濃度的溶液，再向每種溶液中分別加入40 mg的MIPP和NIPP，并置于振蕩器37 ℃恒溫條件下振蕩24 h。隨后，將上述溶液離心（3 000 r·min-1，10 min），取上層清液，測(cè)定其中對(duì)應(yīng)目標(biāo)成分的濃度。

1.2.4 固相萃取的預(yù)處理

（1）MISPE柱的制備。向固相萃取空柱中填入70 mg dMIPP，并確保聚合物外泄。同時(shí)將70 mg NIPP填入空柱中制備非印跡固相萃取柱（NISPE）以作為對(duì)照。

（2）MISPE柱洗脫液的優(yōu)化。取2 mg·L-1的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液作為MISPE的上樣液，以體積比為3∶1的乙腈-甲醇混合溶液為淋洗液，分別以純甲醇、體積比9∶1的甲醇-甲酸混合溶液、體積比8∶2的甲醇-甲酸混合溶液為洗脫液。同時(shí)在NISPE上樣相同濃度的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，以相同3∶1的乙腈-甲醇混合溶液為淋洗液，純甲醇為洗脫液進(jìn)行洗脫。收集的洗脫液在50 ℃條件下用氮?dú)獯蹈?，隨后以PBS緩沖液復(fù)溶，并用之前建立的ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)[4]。

1.2.5 實(shí)際樣品的處理

準(zhǔn)確稱取2 g魚肉樣品于50 mL離心管，向其中加入10 mL乙腈，渦旋振蕩1 min后，超聲20 min，隨后在離心（10 000 r·min-1，20 min），取上層清液為上樣液，體積比9∶1的乙腈-甲醇混合溶液為淋洗液進(jìn)行淋洗，體積比為8∶2的甲醇-甲酸混合溶液為洗脫液進(jìn)行洗脫。收集洗脫液并在50 ℃條件下用氮?dú)獯蹈桑肞BS緩沖溶液復(fù)溶后進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子印跡聚合物的表征

紅外光譜顯示見圖1，MIPP與NIPP具有一些相同的特征吸收峰，這是由于MIPP和NIPP本身具有共同的化學(xué)組成基團(tuán)，1 664 cm-1（C＝C），1 465 cm-1表明MIPP和NIPP均含芳香環(huán)，2 925 cm-1和2 855 cm-1（C-H），1 394 cm-1（C-O），1 111 cm-1（C-N），1 664 cm-1（C＝O），這表明DVB已經(jīng)成功地將印跡聚合物進(jìn)行了交聯(lián)。

圖1 dMIPP和dNIPP傅里葉紅外光譜圖

2.2 分子印跡材料的吸附性能分析

2.2.1 dMIPP的靜態(tài)吸附分析

由圖2可知，隨著組胺初始濃度的上升，dMIPP和dNIPP對(duì)組胺的吸附性逐漸增加。在0.001～0.100 mg·mL-1的組胺初始濃度范圍內(nèi)，聚合物對(duì)組胺吸附量的增長(zhǎng)速率基本穩(wěn)定，而當(dāng)初始濃度高于0.1 mg·mL-1后聚合物對(duì)組胺吸附量的增長(zhǎng)速率開始下降，吸附量也逐漸趨于平衡。由此可知在濃度0.1 mg·mL-1左右聚合物基本吸附完成。

圖2 dMIPP與dNIPP對(duì)組胺的靜態(tài)吸附曲線圖

2.2.2 分子印跡材料的選擇性

為了考查印跡聚合物的特異性，選擇組胺結(jié)構(gòu)類似物酪胺、苯乙胺和色胺進(jìn)行研究。選擇0.010 mg·mL-1和0.001 mg·mL-1兩個(gè)濃度，結(jié)果dMIPP在兩個(gè)濃度下對(duì)組胺均表現(xiàn)出良好的選擇性，對(duì)其吸附性能力均優(yōu)于其結(jié)構(gòu)類似物。如表1所示，兩種質(zhì)量濃度下組胺的選擇性因子均大于1.7。表明所制備的dMIPP對(duì)于組胺具有較好的吸附效果。dNIPP在兩個(gè)濃度下對(duì)組胺的吸附能力較dMIPP顯著下降，且對(duì)其余競(jìng)爭(zhēng)物的吸附同樣不明顯，通過(guò)計(jì)算，其印跡因子均達(dá)到2.0以上，表明dMIPP對(duì)組胺的吸附性能遠(yuǎn)優(yōu)于NIPP，可用于組胺的富集與分離。

表1 不同質(zhì)量濃度下的dMIPP的印跡因子與選擇性因子表

2.3 MISPE柱洗脫液的優(yōu)化

相同濃度下以體積比9∶1的甲醇-甲酸為洗脫液的MISPE，所測(cè)得的回收率為73%；而以純甲醇為洗脫液的MISPE所測(cè)得的回收率為44.5%，以體積比8∶2的甲醇-甲酸為洗脫液的MISPE所測(cè)得的回收率為92%。由此可知，以體積比8∶2的甲醇-甲酸為洗脫液的洗脫效果最好。而以純甲醇為洗脫液的NISPE所測(cè)得的回收率僅為2%。上述結(jié)果表明以MIPP為填料的MISPE萃取柱萃取，以體積比8∶2的甲醇-甲酸洗脫液進(jìn)行洗脫對(duì)樣品的凈化效果最好。

2.4 魚肉樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

為了驗(yàn)證所建立方法的準(zhǔn)確性，進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn)。由表2可知，添加量分別為10.0 mg·kg-1、2.0 mg·kg-1和0.5 mg·kg-1，每個(gè)添加水平重復(fù)3次。平均回收率在84%～106%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在7.4%～12.2%，表明MISPE充當(dāng)吸附柱料對(duì)組胺的特異選擇性較好，所開發(fā)的方法可以用于實(shí)際樣品中組胺的檢測(cè)研究。

表2 魚肉中組胺的加標(biāo)回收率表（n=3）

3 結(jié)論

本研究以對(duì)組胺特異性吸附的印跡材料作為固相萃取吸附劑用于魚肉樣品前處理，結(jié)合前期所建立的酶聯(lián)免疫分析方法，建立了快速檢測(cè)組胺方法。對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)樣品-魚肉的檢測(cè)具有滿意的回收率和精確性，可用于實(shí)際樣品中對(duì)組胺殘留的測(cè)定。