常香玉 李慧卿 曹葉霞 張馨蕊

(1. 山西大學(xué)分子科學(xué)研究所，山西 太原 030000；2. 忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西 忻州 034000)

檸檬又稱洋檸檬、寧果、益母果等，為雙子葉綱蕓香料柑橘屬植物[1-2]，在全球被廣泛種植[3]。檸檬精油分布于檸檬皮中，是檸檬香味的主要來源[4-5]，具有抗菌、消炎和感官保護(hù)等多種功能[6]。但由于檸檬精油易揮發(fā)、易降解，限制了其應(yīng)用范圍。精油微球化可以克服檸檬精油相關(guān)穩(wěn)定性的限制，延長其保質(zhì)期[7-8]。

微球的制備方法很多，有溶劑揮發(fā)法、乳化交聯(lián)法、凝聚法、微孔淀粉吸附、相分離法等多種方法[9-10]。試驗(yàn)采用兩種最普遍的技術(shù)，溶劑揮發(fā)法和乳化交聯(lián)法制備微球。海藻酸鈉是一類陰離子的水溶性多糖，具有易降解、低毒、生物相容性等特點(diǎn)，在溫和條件下可與二價(jià)陽離子(如鈣離子)發(fā)生凝膠化[11]，非常適合于作為微球壁材包裹各種內(nèi)容物。明膠是一種來源于變性膠原蛋白的蛋白質(zhì)，乳化性好，增稠性好，具有良好的生物相容性和可降解性，也是制備藥物載體或微球壁材的主要原料。但單一壁材的微球，結(jié)構(gòu)相對(duì)疏松、內(nèi)容物容易突釋，難以實(shí)現(xiàn)良好的緩釋。明膠與海藻酸鈉混合，兩者可以通過形成均勻的溶液，再通過共價(jià)交聯(lián)劑形成不溶性凝膠。這種復(fù)合壁材更有利于內(nèi)容物包埋和緩釋，因而試驗(yàn)以海藻酸鈉/明膠作壁材。海藻酸鈉/明膠制備微球，文獻(xiàn)中多采用銳孔懸滴法，其制作的多為膠囊，徑粒在80 μm以上[12-13]，且容易脫水。采用乳化交聯(lián)法，可以制備徑粒更小，且更易于分散的穩(wěn)定微球顆粒。聚乳酸—羥基乙酸共聚物(PLGA)為另一種生物相容性的合成聚合物，在生藥領(lǐng)域已被廣泛作為載體使用，而其作為壁材制備微球，一直以來，主要采用溶劑蒸發(fā)法[14]。但以PLGA壁材制備微球，徑粒也多在50 μm以上[10,14]，而且以其壁材對(duì)疏水性精油的包結(jié)微球目前尚未見報(bào)道，更未發(fā)現(xiàn)針對(duì)兩種微球技術(shù)對(duì)相同精油的包結(jié)行為進(jìn)行的比較研究，對(duì)精油微球的應(yīng)用作參考性指引。故試驗(yàn)擬通過上述方法制備兩種檸檬微球，通過掃描電鏡(SEM)對(duì)其形貌進(jìn)行表征，并基于包封率、產(chǎn)率、負(fù)載率、抗氧化性、熱穩(wěn)定性等參數(shù)對(duì)兩種微球進(jìn)行評(píng)估，以期為利用精油增香、防腐、抗氧化、抗菌等功能開發(fā)新產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

檸檬皮：市售；

海藻酸鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

明膠：生物試劑級(jí)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

聚乳酸—羥基乙酸共聚物(PLGA)：兩種分子數(shù)比為50∶50，MW38 000～54 000，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

聚乙烯醇(PVA)：Mw約27 000，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

吐溫80：生物技術(shù)級(jí)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

司盤80：化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)：UV-2450型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗機(jī)：KQ-400KDZ型，深圳市昌源科技有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：LGJ-10型，深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司；

高壓均質(zhì)機(jī)：APV-1000型，上海順儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

掃描電鏡：TESCAN型，泰思肯(中國)有限公司；

熱分析儀：STA 449 F5 Jupiter型，德國耐馳公司；

高效液相色譜儀：LC610型，北京普瑞分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檸檬精油的提取

(1) 水蒸氣蒸餾法：取新鮮檸檬手工剝皮，去除皮內(nèi)白色纖維物，粉碎，過80目塞，備用。精密稱取40.0 g檸檬果皮碎粒置于250 mL的圓底燒瓶中，加50 mL蒸餾水，超聲30 min，采用精油蒸餾裝置提取2 h，收集餾出液上層，重復(fù)兩次，計(jì)算提取率[13]。所得精油于冰箱貯存。

(2) 檸檬精油提取率的計(jì)算：

(1)

式中：

Y——提取率，%；

m1——檸檬精油質(zhì)量，g；

m2——檸檬皮質(zhì)量，g。

1.2.2 檸檬精油微球制備

(1) 海藻酸鈉/明膠微球：利用乳化法制備微球，然后與氯化鈣交聯(lián)[14-16]。檸檬精油(對(duì)照空白微球不加精油)溶于1.5 mL吐溫80中，明膠加熱融溶于10 mL水中，混勻，加入5%海藻酸鈉水溶液(10 mL)中，然后將混合液傾入含有司盤80的液體石蠟(V司盤∶V石蠟=1∶10)中，在1 500～2 000 r/min轉(zhuǎn)速下攪拌60 min。氯化鈣溶解于甲醇和異丙醇(V甲醇∶V異丙醇=2∶3)的混合溶劑中配成濃度為0.2 mol/L溶液，取10 mL加入乳化液中，繼續(xù)攪拌1 h以確保有效交聯(lián)。真空過濾收集微球，異丙醇洗滌3次，脫水處理。將脫水后的濕微球鋪平在表面皿中，將表面皿放入50 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中，干燥1.5 h后取出。

(2) PLGA微球：采用溶劑蒸發(fā)技術(shù)制備微球。檸檬精油(對(duì)照空白微球不加精油)，PLGA溶于二氯甲烷，高速攪拌混合均勻?；旌先芤郝D(zhuǎn)入1 g/100 mL的PVA溶液中，均化。再將乳液加入0.3 g/100 mL PVA水溶液中，高速攪拌均勻。繼續(xù)以適當(dāng)速度攪拌12 h，蒸發(fā)有機(jī)溶劑。得到的微球過濾，用水洗滌3次，真空干燥(40 ℃，1 h)。

1.2.3 檸檬微球載油率、包封率和產(chǎn)率 準(zhǔn)確稱量檸檬精油微球溶解在適量的二氯甲烷中，加入一定量體積的含0.1 g/100 mL的吐溫80的雙蒸餾水，磁力攪拌器攪拌過夜，以去除有機(jī)相。溶液過濾，用分光光度分析測(cè)定253 nm處吸光度(檸檬烯特征吸收)。用含0.1 g/100 mL吐溫80的雙蒸餾水配制不同濃度的檸檬精油，測(cè)定253 nm處吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定包封精油含量[17]。根據(jù)式(2)～式(4)計(jì)算載油率、包封率和產(chǎn)率[18]。

(2)

(3)

(4)

式中：

EE——包封率，%；

mO——包封入微球的精油的質(zhì)量，g；

mTO——投放精油的質(zhì)量，g；

LE——負(fù)載率，%；

mM——微球的質(zhì)量，g；

Y——產(chǎn)率，%；

mTW——投放壁材的質(zhì)量，g。

1.2.4 檸檬微球緩釋性能測(cè)定 將定量的精油微球懸浮在已知體積的含0.1 g/100 mL Tween 80的雙蒸餾水中，用磁力攪拌器以200 r/min恒轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)，溫度設(shè)定在25 ℃。每隔一定時(shí)間間隔，提取5 mL等量樣品，離心(4 000 r/min，3 min)，取上清液測(cè)定253 nm處檸檬烯特征吸收，并補(bǔ)充同體積新鮮溶液于母液中。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，從吸光度值確定釋放精油量。根據(jù)精油負(fù)載率，計(jì)算定量微球中精油總量，釋放精油量與微球負(fù)載量的比值為釋放百分率。重復(fù)以上操作，平行對(duì)照3組試驗(yàn)，取平均值。

1.2.5 檸檬精油抗氧化能力測(cè)定

(1) 清除DPPH自由基能力：配制質(zhì)量濃度為0.1 mmol/mL 的DPPH乙醇溶液，備用。另取2 mL無水乙醇溶液和DPPH溶液，混合均勻，在517 nm處測(cè)定其吸光度值(A1)；分別取質(zhì)量濃度為1，2，4，6，8 mg/mL檸檬精油乙醇溶液2 mL于5支比色管中，各加入DPPH乙醇溶液2 mL，混合均勻后放置于暗處反應(yīng)20 min，測(cè)定517 nm處吸光度值(A2)；分別取質(zhì)量濃度為1，2，4，6，8 mg/mL檸檬精油乙醇溶液2 mL于5支比色管中，各加入2 mL乙醇溶液，測(cè)定其517 nm處吸光度值(A3)。根據(jù)式(5)計(jì)算檸檬精油對(duì)DPPH自由基的清除率。

(5)

式中：

K——DPPH自由基清除率，%；

A1——DPPH自由基517 nm處吸光度；

A2——加樣后DPPH自由基吸光度；

A3——樣品517 nm處吸光度。

(2) 海藻酸鈉/明膠微球和PLGA微球清除DPPH自由基能力：燒杯中加入定量檸檬精油微球，用10 mL無水乙醇浸泡，于100 ℃超聲1 h，每隔一定時(shí)間取上清液0.1 mL并加入0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液3.9 mL，混合均勻后于暗處反應(yīng)20 min，于517 nm處測(cè)其吸光度值(A1)。另取一試管用0.1 mL無水乙醇代替試樣，所測(cè)吸光度為A2；取0.1 mL微球乙醇溶液并加入3.9 mL無水乙醇溶液，測(cè)定其吸光度值(A3)。每間隔測(cè)定上述的吸光度值。根據(jù)式(5)分別計(jì)算出兩種微球?qū)PPH自由基的清除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 檸檬精油的提取

提取檸檬精油經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的方法主要是冷榨和水蒸氣蒸餾法。傳統(tǒng)的冷榨雖然便捷，但冷榨會(huì)使香芹醇、萜等含量下降[13]，而且容易溶入其他非芳香組分。而水蒸氣蒸餾得到的餾分為揮發(fā)性芳香組分，少有其他非香味成分，因而被采用。精油的揮發(fā)性成分由碳?xì)浠衔锖捅栋胼埔约昂跹苌铮喝⒋?、酯和氧化物組成。它也包括醇、醛和脂族酯。檸檬果皮精油主要成分為檸檬烯，占72.5%～76.4%，其次為β-蒎烯，占11.6%～18.7%。其他幾種單萜類化合物含量也較高，分別為松油烯(2.88%～8.26%)、α-蒎烯(1.4%～1.5%)和月桂烯(0.95%～1.12%)[19]。水蒸氣蒸餾方法獲得檸檬精油與超臨界萃取、壓榨法等相比，單萜、倍半萜、含氧化合物等主要成分的含量差別不大[20]。試驗(yàn)所得精油為無色透明的油狀物，密度為0.857～0.862，有香濃的檸檬味道，產(chǎn)率為6.79%，檸檬烯為其主要成分。

2.2 檸檬精油微球的電鏡分析

從圖1可以看出，無論是空白還是載油，海藻酸鈉/明膠微球都是徑粒均勻的球體或類球體，直徑約為2～4 μm，載油微球無明顯增大。PLGA微球徑?；驹?～10 μm，其載油微球比空白微球也無明顯增大，但表面明顯比海藻酸鈉/明膠光滑(圖2)。PLGA與海藻酸鈉雖分別為合成材料與天然材料，但都是易與生物體相容的高分子材料，其微球產(chǎn)品適宜于食品、藥品等相關(guān)行業(yè)應(yīng)用。徑粒微小的微球由于分散性更好，更易于投放及保存，更適宜于上述行業(yè)。海藻酸鹽液體的黏度很高，采用銳孔滴定等形成液滴的方法會(huì)產(chǎn)生大尺寸的微粒，試驗(yàn)所用的兩種方法制備的微球，徑粒相對(duì)較小，滿足其作為精油負(fù)載體的需求。

圖1 海藻酸鈉/明膠微球Figure 1 SEM photograph of sodium alginate/gelatinmicrospheres

圖2 PLGA微球掃描電鏡圖Figure 2 SEM photograph of PLGA microspheres

2.3 兩種微球的載油率效果比較

海藻酸鈉/明膠精油微球的包封率為(57.83±1.35)%，微球產(chǎn)品產(chǎn)率(62.16±1.80)%。PLGA微球包封率和產(chǎn)率都有所下降，分別為(13.07±1.62)%和(40.37±1.57)%(表1)。說明試驗(yàn)條件下，海藻酸鈉/明膠微球較PLGA微球?qū)幟示偷某休d效果好。在PLGA微球形成過程中，伴隨著溶劑蒸發(fā)，可能存在精油的揮發(fā)，從而引起包封率的變化。除了方法的差異之外，海藻酸鈉/明膠復(fù)合壁材組合，存在氨基、羥基、羰基等多種官能團(tuán)，對(duì)包結(jié)行為較為有利，但微球表面相對(duì)而言不是特別光滑，使其更容易附著精油，可能也是其包封率較高的原因。

表1 兩種微球的載油率效果比較

2.4 兩種微球的緩釋性能分析

如圖3所示，海藻酸鈉/明膠微球和PLGA微球中精油釋放過程，幾乎都可以概括為3個(gè)階段：快速釋放階段(前5 h)、持續(xù)穩(wěn)定釋放階段(5～16 h)和衰減階段(16 h后)。第一階段雖然釋放較快，但兩種微球均未出現(xiàn)爆發(fā)式的突釋，可能是受制備過程中初始水相溶劑的影響[21]。兩種微球在16 h時(shí)累計(jì)釋放率分別為39.9%和22.5%。而在16 h后兩種微球的釋放曲線趨勢(shì)較為平緩，24 h內(nèi)均未超過40%，出現(xiàn)了緩慢釋放階段，實(shí)現(xiàn)了持續(xù)的釋放。

圖3 兩種微球的緩釋曲線Figure 3 Cumulative release curves from two kindsof microspheres

2.5 檸檬精油微球的抗氧化能力

據(jù)報(bào)道[19]，約34種柑桔類精油及其組分對(duì)DPPH自由基都具有清除活性，并且所有成分的清除活性均在17.7%～64.0%。試驗(yàn)所提取的檸檬精油對(duì)DPPH自由基有明顯的清除作用，清除率隨著檸檬精油濃度的增加而增大，最高達(dá)到72.36%，具有很強(qiáng)的抗氧化能力。精油之所以能清除自由基，在于其組分中具有共軛雙鍵的次生物質(zhì)或酚類、多羥基類物質(zhì)，比如香芹醇、檸檬烯、大茴香醇等，它們通過轉(zhuǎn)移電子或氫給自由基從而實(shí)現(xiàn)清除目的。精油微球化使用，無法定量與精油抗氧化性比較，但其自由基清除能力與其緩釋行為應(yīng)存在相關(guān)性。圖4是兩種微球?qū)PPH自由基的清除率隨著浸泡時(shí)間的變化曲線，隨著時(shí)間的延長，兩者對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸增高。0～6 h兩種微球的DPPH自由基清除率呈迅速增加趨勢(shì)，但在6 h之后兩種微球?qū)PPH自由基的清除率呈緩慢增加趨勢(shì)。由于包封的精油含量不同，雖然等量的海藻酸鈉/明膠微球在同樣的時(shí)間內(nèi)釋放百分率相同，但釋放的凈質(zhì)量不同。海藻酸鈉/明膠微球釋放的精油多于PLGA微球的，因而清除效果優(yōu)于PLGA微球。雖然兩者清除效果有差別，但兩者對(duì)DPPH自由基的清除率與其精油緩釋行為一致。與未包封的檸檬精油相比，微球中檸檬精油，由于高分子量的壁材在水化后形成了一層厚厚的凝膠層，起到了屏障作用，使精油逐漸緩緩溶出逐步發(fā)揮作用。這種釋放速率較慢，需要延續(xù)時(shí)間逐漸累積清除效果，但可以控制釋放行為。

圖4 包被海藻酸鈉/明膠與PLGA的精油微球的DPPH清除率

2.6 精油微球的熱穩(wěn)定性分析

由圖5可知，海藻酸鈉/明膠微球分解為4個(gè)階段，而PLGA微球分解近似分為3個(gè)階段。海藻酸鈉/明膠微球升溫到180 ℃時(shí)失重可分為兩個(gè)階段，初始在達(dá)到50 ℃前，失重和緩，失重較少，為表面攜帶少量精油或少部分水分子揮發(fā)[22]；從50～180 ℃失重曲線變陡，失重量明顯增大，到拐點(diǎn)超過20%，主要對(duì)應(yīng)于精油及結(jié)合水損失[23]。階段三對(duì)應(yīng)180～210 ℃的升溫過程中，失重約為30%～80%，應(yīng)為主要壁材分解階段。最后階段，海藻酸鈉/明膠微球在210～500 ℃時(shí)恒重，表明還有些許材料殘余，這應(yīng)該與無機(jī)鈣通過配位與材料交聯(lián)有關(guān)。

圖5 兩種微球的熱穩(wěn)定性曲線Figure 5 Thermal stability curves of two kindsof microspheres

而PLGA微球在第一階段升溫至200 ℃時(shí)，PLGA微球的整體熱失重趨勢(shì)比較平穩(wěn)，失重不足10%，應(yīng)為芯材揮發(fā)過程。在階段二，對(duì)應(yīng)200～270 ℃的升溫過程中，包含了20%～90%的失重，這意味著壁材的分解[24]。最后，由250 ℃升溫至500 ℃的過程中，PLGA微球的壁材和芯材已經(jīng)完全分解揮發(fā)殆盡。

微球不同的失重曲線主要來自壁材材質(zhì)結(jié)構(gòu)的差異，PLGA聚合分子本身比海藻酸鈉有較高的分解溫度，從而也表現(xiàn)在微球特點(diǎn)上。鈣離子交聯(lián)海藻酸鈉/明膠，并未給微球主體分解帶來額外明顯的穩(wěn)定作用。雖然兩種微球在180 ℃以下，幾乎可以穩(wěn)定存在，但PLGA微球表現(xiàn)出了更好的對(duì)熱穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

水蒸氣蒸餾方法提取得到檸檬精油，產(chǎn)率為6.79%；然后以海藻酸鈉/明膠和PLGA壁材，分別采用乳化交聯(lián)法和溶劑蒸發(fā)方法制備微球。兩者均得到了徑粒在10 μm以內(nèi)的微球，海藻酸鈉/明膠微球包封率和產(chǎn)量均高于PLGA微球的；比較緩釋行為，海藻酸鈉/明膠微球，24 h內(nèi)累積釋放率微高于PLGA微球，但PLGA微球的熱穩(wěn)定性強(qiáng)于前者，可以在200 ℃下穩(wěn)定存在。如應(yīng)用于冷飲類食品，海藻酸鈉/明膠微球具有優(yōu)勢(shì)，但PLGA微球可能更適用于需要高溫烘培的食品。相比文獻(xiàn)[13-14,22,24]記錄的同壁材微球，試驗(yàn)制備的兩類微球徑粒更小，使之能很好地分散在食品基質(zhì)中，而不影響食品本身的特性。