張 華 劉 琪 葉遠青 朱懷遠 廖惠云

(江蘇中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，江蘇 南京 210019)

爆珠香精又稱香丸、脆性膠囊、珠子，是一種由高分子聚合物包裹香精料液而形成的密封脆性膠囊，主要被應用于食品、快速消費品等[1-4]。近年來，因其新穎、獨特的加香方式備受消費者喜愛，對加香用爆珠香精的研究亦日益增多[5-7]。爆珠香精主要由內(nèi)含物芯材和壁材組成，其中芯材是由多種香精香料和適量溶劑調和制成的特色香味液體，壁材通常由明膠、改性淀粉、卡拉膠等滴制成型。壁材達到觸發(fā)條件時破裂，芯材成分得以釋放，實現(xiàn)增香目的。爆珠香精內(nèi)含物受原料產(chǎn)地、加工工藝等多種因素影響，產(chǎn)品質量存在一定波動，僅從其物理指標和感官方面判斷無法從本質上準確客觀把握其質量變化[8-9]。

爆珠香精質量穩(wěn)定性的評價主要受限于直徑、膠皮厚度、破碎壓力、外觀、水分以及環(huán)境濕度[10-14]等物理指標，目前有關影響爆珠香精整體香味和內(nèi)在品質的化學指標的研究較少[15]。何媛等[16]采用GC/MS指紋圖譜評價爆珠內(nèi)含物的質量穩(wěn)定性；朱玲等[17]基于紫外光譜和支持向量機回歸算法，建立單值控制圖對爆珠內(nèi)液的穩(wěn)定性進行快速判定。以上多是基于內(nèi)含物成分來判斷爆珠香精的質量穩(wěn)定性，因方法本身局限性，其對數(shù)據(jù)變化不敏感，難以有效監(jiān)控爆珠香精質量實際變化情況。在具體成分分析方面，只選擇單一特征物質或者選擇所有能定性出的物質進行表征分析均欠妥當，前者不能反映整個爆珠香精內(nèi)在成分含量情況，而后者操作煩瑣、效率低下。因此，針對性地篩選合適的特征標志成分顯得較為可行。

考慮到爆珠香精具有化學組成成分復雜等特點，而其指紋圖譜能夠充分提取爆珠香精中的有效化學成分信息，具有整體性和全面性。通過指紋圖譜方法能夠在一定程度上反映物質的內(nèi)在質量[18-19]，而多元統(tǒng)計學既可以對指紋圖譜的信息進行識別、處理，又可以將多個指標進行綜合、降維和分類分析，從而更加客觀、科學地反映爆珠香精的質量信息，最終達到控制該爆珠香精的整體質量的目的[20-21]。研究擬基于組學處理手段[22-25]，以正常爆珠香精樣品和模擬爆珠香精樣品為對象，采用氣相色譜—質譜法對爆珠香精中揮發(fā)性及半揮發(fā)性化合物進行檢測，建立目標樣品色譜指紋圖譜，再結合主成分分析、正交偏最小二乘法判別分析等多元統(tǒng)計分析方法進行統(tǒng)計分析，同時結合t檢驗，以期篩選出爆珠香精特征香味標志成分，旨在為爆珠香精質量變化研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

軟飲料加香用爆珠香精：果香香韻，同時制作用于建模對比分析需要的模擬樣品，具體制作方法參照表1，云南巴菰生物科技有限公司；

表1 爆珠香精模擬樣品制作方法

無水乙醇、乙酸乙酯：色譜純，質量分數(shù)≥99%，比利時Acros公司；

正十七烷標準品：質量分數(shù)≥99%，美國Sigma-Aldrich公司；

氣相色譜—質譜聯(lián)用儀：7890B-5977A型，美國Agilent Technologies公司；

毛細管柱：DB-5MS型，30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent Technologies公司；

毛細管柱：DB-17MS型，30 m×0.32 mm×0.25 μm，美國Agilent Technologies公司；

毛細管柱：DB-Innowax型，30 m×0.32 mm×0.25 μm，美國Agilent Technologies公司；

電子天平：T201型，瑞士Mettler Toledo公司；

振蕩儀：HY-8型，常州國華電器有限公司；

有機相針頭濾膜：0.22 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 準確稱量24顆爆珠香精樣品，全部轉移至50 mL錐形瓶中。用干凈玻璃棒將爆珠香精全部搗破(暫不移出玻璃棒)，依次加入100 μL質量濃度為500 μg/mL的正十七碳烷乙醇溶液和10 mL乙酸乙酯，攪拌均勻，靠壁、拿出玻璃棒，于160 r/min下振蕩萃取40 min，用0.22 μm有機相濾膜過濾，得待測液。

1.2.2 色譜條件

(1) 氣相色譜條件：樣口溫度260 ℃；載氣為氦氣，恒流條件，流速1.0 mL/min；進樣量1 μL；不分流進樣；DB-17MS色譜柱；程序升溫：初始溫度50 ℃，以8 ℃/min升溫至200 ℃，保持10 min，以20 ℃/min升溫至280 ℃，保持25 min；傳輸線溫度280 ℃。

(2) 質譜條件：電離方式為EI源；電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；溶劑延遲3 min；檢測方式為SCAN；掃描質量范圍30～450 amu。

1.2.3 色譜柱優(yōu)化 依照毛細管色譜柱極性遞增順序，依次考察DB-5MS、DB-17MS和DB-Innowax毛細管色譜柱對爆珠香精樣品組分的分離影響，選擇最佳分離色譜柱。

1.2.4 儀器和方法精密度 取1份爆珠香精正常樣品進行處理后，連續(xù)進行6 次GC/MS分析，計算共有色譜峰相對于內(nèi)標色譜峰面積比值的相對標準偏差(RSD)，考察儀器精密度；取6份爆珠香精樣品處理后連續(xù)進樣，計算共有色譜峰相對于內(nèi)標色譜峰面積比值的RSD，考察日內(nèi)精密度；取同一爆珠香精樣品，隔天測定1次，共測定6次，計算共有色譜峰相對于內(nèi)標色譜峰面積比值的RSD，考察其日間精密度。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 依據(jù)文獻[26]中色譜指紋圖譜提取方法對處理后的色譜數(shù)據(jù)(以目標物峰面積與內(nèi)標峰面積的比值半定量方法計算)導出進行多變量分析；應用SIMCA 14.1軟件對化合物數(shù)據(jù)進行中心化和歸一化處理后進行PCA、OPLS-DA等多元統(tǒng)計分析，其中PCA用于識別正常爆珠香精樣品與模擬爆珠香精樣品之間揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分間的相似性和差異性，OPLS-DA用于差異特征化合物的篩選，并使用SPSS 24.0軟件對差異化合物進行單因素方差分析，篩選出特征香味標志物。

2 結果與分析

2.1 色譜柱條件優(yōu)化及主要成分分析

爆珠香精的香氣成分種類較多、含量相差較大，且極性差異較大[5-6]。由圖1可知，各色譜柱均能有效分離爆珠香精內(nèi)含物和壁材，其中前半部分為輕組分、易揮發(fā)的內(nèi)含香味物質，后半部分為沸點較大、不易揮發(fā)的壁材物質。對于爆珠香精樣品而言，隨著色譜柱鍵合相極性的增大，內(nèi)含香味物質中色譜峰面積較大的組分峰形變得更對稱，且物質組分的整體響應豐度較壁材組分的響應豐度有所提升，但是壁材物質色譜峰峰形變差，且出現(xiàn)旗幟狀色譜峰，同時前半部分與后半部分組分之間出峰時間間距加大。因此，優(yōu)選鍵合相極性居中的DB-17MS毛細管柱為分離色譜柱。

圖1 不同色譜柱條件下爆珠香精GC/MS色譜圖Figure 1 GC/MS chromatogram of breakable capsule flavor under different chromatographic columns

進一步采用NIST庫檢索，依據(jù)色譜峰信噪比≥10且匹配度≥80%的原則進行定性分析，共鑒定出27種化合物，其中前半部分(內(nèi)含物)1#～20#香味物質按照色譜峰保留時間遞增順序依次為2-甲基丁酸、蒎烯、檸檬烯、檜烯、月桂烯、松油烯、芳樟醇、辛酸甲酯、薄荷醇、松油醇、癸酸甲酯、對烯丙基茴香醚、香芹酮、癸酸乙酯、茴香腦、丁香酚、石竹烯、香橙烯、肉桂醛、月桂酸甲酯；后半部分(壁材)物質主要為辛癸酸甘油酯，21#～27#分別為單辛酸單癸酸甘油酯、二辛酸甘油酯、二癸酸甘油酯、單辛酸二癸酸甘油酯、三辛酸甘油酯、二辛酸單癸酸甘油酯)、三癸酸甘油酯等混合酯。研究[27]表明，該混合酯屬于中鏈甘油三酯(MCT)，是一種新型中碳鏈脂肪酸甘油酯，由于其優(yōu)良的溶解性能、低黏度等特點被廣泛用于調配香味料、爆珠香精生產(chǎn)。

2.2 儀器和方法精密度考察

由圖2可知，所有組分的精密度RSD介于0.56%～9.94%，平均值為2.83%，14#色譜峰RSD異常；日內(nèi)精密度RSD介于3.07%～9.81%，平均值為5.93%，1#和19#兩個色譜峰RSD異常；日間精密度RSD介于2.81%～11.95%，平均值為6.71%，11#、14#、17#和26# 4個色譜峰RSD異常。綜上，只有個別組分RSD稍>10%，對于微量目標組分的量化分析而言，儀器及方法的日內(nèi)及日間精密度較好，能夠用于后續(xù)樣品指紋圖譜采集。

圖2 爆珠香精目標組分分析精密度Figure 2 Analysis precision of breakable capsule flavortarget component

2.3 樣品指紋圖譜提取

圖3為保留時間校正前后樣品色譜峰局部組分匹配示例圖，圖4為經(jīng)預處理后爆珠香精樣品的GC/MS指紋圖譜。由圖4可知，經(jīng)處理調整后能夠有效排除色譜峰的保留時間飄移和重疊峰的干擾。建立好目標樣品的GC/MS指紋圖譜后，從軟件中將色譜峰保留時間校正對齊后的色譜數(shù)據(jù)(半定量方法，以目標物峰面積與內(nèi)標峰面積的比值計)導出進行后續(xù)多變量分析。

圖3 保留時間校正前、后樣品局部組分色譜峰匹配圖Figure 3 Peak matching diagram of local components by retention time calibration before and after

圖4 爆珠香精GC/MS指紋圖譜Figure 4 GC/MS fingerprinting of breakablecapsule flavor

2.4 特征標志物篩選

2.4.1 主成分分析 由表2可知，當主成分數(shù)為4時，累計貢獻率為87.1%；當主成分數(shù)為5時，累計貢獻率僅增加為90.8%，對提升預測精度貢獻不顯著，所以適宜的主成分數(shù)應為4，基本上可以反映整體樣本信息。

表2 爆珠香精PCA類模型的相關統(tǒng)計量

由圖5可知，正常樣品A與模擬樣品B、C和D在95%置信橢圓內(nèi)，并未有效分開，模擬樣品B、C和D之間更是交叉在一起，個別模擬樣品位于95%置信橢圓外，無法反映樣品檢測結果的差異性。由圖6可知，所有正常樣品和大部分模擬樣品均在95% HotellingT2置信區(qū)間內(nèi)，其中有3個模擬樣品在99% HotellingT2置信區(qū)間內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)超出該置信區(qū)間的樣本，有必要進一步對爆珠香精樣品中揮發(fā)性、半揮發(fā)性組分進行OPLS-DA篩選研究。

A為正常樣品，B、C、D均為模擬樣品圖5 爆珠香精主成分得分圖Figure 5 PCA score plot of breakable capsule flavor

圖6 爆珠香精PCA分析Hotelling T2分布圖Figure 6 Hotelling T2 distribution of breakable capsule flavor

2.4.2 OPLS-DA篩選差異化合物 為確定爆珠香精樣品特征香味標志物，使用OPLS-DA模型對樣品進行分類，R2X、R2Y、Q2用于評估OPLS-DA模型的有效性，R2X、R2Y、Q2值越接近1，說明所構建的模型越好。由圖7可知，R2X、R2Y和Q2值分別為0.986，0.890和0.675，正常樣品A與模擬樣品B、C和D在95%置信橢圓內(nèi)分別處于第1主成分正負軸兩側，說明正常樣品與模擬樣品的揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分得到了有效區(qū)分，在種類和相對含量上存在差異。進一步將建立OPLA-DA模型時定義分類Y的變量順序隨機排列200次以驗證該OPLS-DA模型的可靠性[28]。由圖8可知，R2和Q2回歸線的斜率均>0，且截距分別小于0.5和0.05，表明該OPLS-DA模型具有良好的預測能力，可用于后續(xù)的特征標志成分尋找。

A為正常樣品，B、C、D均為模擬樣品圖7 爆珠香精OPLS-DA得分圖Figure 7 OPLS-DA score plot of breakable capsule flavor

圖8 爆珠香精OPLS-DA模型置換驗證圖Figure 8 Permutation test of OPLS-DA model forbreakable capsule flavor

S-plot圖中S形的位于左下方和右上方2個角上的變量是區(qū)分兩組樣品的主要香味物質，可反映每一個變量對已構建分析模型的貢獻大小，即離中心原點和主要化合物團越遠的變量說明其所代表的揮發(fā)性、半揮發(fā)性物質對已構建模型貢獻越大；也就是說，離中心原點和主要化合物團越遠，其對正常爆珠香精樣品和模擬爆珠香精樣品的差異判別貢獻越大。由圖9可知，8#(辛酸甲酯)、11#(癸酸甲酯)與正常爆珠香精樣品距離更近，且遠離中心原點和主要化合物團，對構建模型貢獻顯著(P<0.05)；3#(檸檬烯)、16#(丁香酚)、25#(三辛酸甘油酯)與模擬爆珠香精樣品距離更近，且遠離中心原點和主要化合物團。

圖9 爆珠香精OPLS-DA的S-plot圖Figure 9 S-plot of OPLS-DA model for breakablecapsule flavor

變量重要性投影值(VIP值)越大，說明其在判別過程中貢獻越大，在樣品之間的差異越顯著(通常認為VIP>1的變量是模型的重要特征標志物)。由圖10可知，有7個香氣組分VIP>1.0，分別是3#(檸檬烯)、25#(三辛酸甘油酯)、16#(丁香酚)、26#(二辛酸一癸酸甘油酯)、8#(辛酸甲酯)、22#(1,3-二辛酸甘油酯)和11#(癸酸甲酯)，可作為區(qū)分正常爆珠香精樣品和模擬爆珠香精樣品的潛在重要特征標志成分。

圖10 爆珠香精揮發(fā)性、半揮發(fā)性組分變量權重重要性排序圖Figure 10 Variable importance for the projection of breakable capsule flavor

2.4.3 差異化合物顯著性分析 對于以上遠離原點和主要化合物團及VIP值>1的變量，采用SPSS軟件進行單因素方差分析來篩選特征揮發(fā)性物質，以P<0.01表示具有極顯著差異的物質，結果見表3。由表3可知，3#(檸檬烯)、8#(辛酸甲酯)、11#(癸酸甲酯)及16#(丁香酚)4種物質對應的P值均<0.01，可作為區(qū)分正常爆珠香精與模擬爆珠香精之間的特征標志物，其中就各標志成分的特征香味而言，檸檬烯具有青酸帶甜的新鮮的橘子—檸檬果香，香氣輕飄、不持久，口味是甜、新鮮柑橘樣香味；辛酸甲酯具有強烈的酒香、果香和甜橙香氣，持久性好，味呈油膩—果香，有些甜橙味；癸酸甲酯具有酒香氣息，濃郁強烈；丁香酚具有溫和的新甜花香，濃且非常持久，有甜的丁香香味，主要用來調和花香、果香、辛香風味?？傮w來說，該系列標志物能夠反映爆珠香精果香香韻的特點。

表3 潛在重要特征標志物單因素方差分析結果

3 結論

采用GC/MS對爆珠香精中揮發(fā)性及半揮發(fā)性化合物進行檢測，共鑒定出27種化合物，其中前半部分是包埋的香味物質，后半部分為壁材物質，兩部分成分在色譜柱上區(qū)分明顯；兼顧內(nèi)含物和壁材的色譜峰響應，優(yōu)選鍵合相極性居中的DB-17MS毛細管柱為分離色譜柱，儀器精密度、日內(nèi)精密度和日間精密度總體較好，能夠滿足微量目標組分的量化分析，結合ChemPattern軟件近鄰算法對圖譜數(shù)據(jù)進行對齊，適合于建立爆珠香精樣品GC/MS指紋圖譜；主成分分析對不同狀態(tài)爆珠香精樣品區(qū)分不明顯，而正交偏最小二乘法—判別分析結果較好，結合單因素統(tǒng)計分析篩選出檸檬烯、辛酸甲酯、癸酸甲酯和丁香酚4種化合物為特征標志成分，系列成分可反映香精樣品果香香韻特點，可為爆珠香精質量控制提供參考依據(jù)。后續(xù)將對不同年份、廠家爆珠香精進行檢測，并建立該類爆珠香精質量控制體系，以便實現(xiàn)該方法對更多年份、更多品牌的爆珠香精進行鑒別，從而使該方法在實際生產(chǎn)中得到應用。