劉 誠石 嵩陳 文關(guān)建民

1.菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東菏澤 274000；2.菏澤市立醫(yī)院，山東菏澤 274000

GATA5是調(diào)控器官發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子，含有2個典型鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合氨基酸序列（Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys），胚胎時表達并調(diào)控內(nèi)胚層調(diào)控來源 的器 官發(fā) 育［1?4］。研 究發(fā) 現(xiàn) 在消 化道 腫 瘤 中GATA5作為抑癌基因發(fā)揮抑制癌癥進展的作用［5］；同樣在肝癌中發(fā)現(xiàn)GATA5能抑制肝癌細胞生長，促進肝癌細胞凋亡［6］。EpCAM作為癌干細胞因子在癌形成和進展中發(fā)揮重要作用［7?10］。GATA5是否在腎癌中發(fā)揮相應(yīng)的作用還是未知，GATA5與EpCAM是否存在作用關(guān)系同樣未知，我們選取腎癌HEK-293細胞，通過構(gòu)建pTT5-GATA5研究過表達GATA5后對HEK-293細胞生長調(diào)控作用及觀察GATA5對EpCAM表達調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)

將HEK-293細胞系（購自武漢細胞庫）培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和5%青霉素/鏈霉素DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細胞在37℃并含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)［11］。

1.2 實驗方法

1.2.1 表達載體的構(gòu)建 通過NCBI：NM_080473.4獲取GATA5的cDNA（從63號堿基到1256堿基）。我們在N端添加了KozaK序列GCCACC。限制性位點HindIII（5'-A^AGCTT-3'）和NotI（5'-GC^GGCCGC3'）。通過PCR儀擴增合成cDNA-GATA5。用HindIII和NotI限制酶（Takara Bio Inc.Inc）酶切PCR產(chǎn)物，并通過T4DNA連接酶（Takara Bio Inc.Inc）連接到相同酶切的表達載體pTT5-vector（Biovector，Inc.USA）中。將重組pTT5-GATA5標(biāo)簽載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（DH5-α）中用于擴增［12］。

1.2.2 構(gòu)建表達載體驗證 將構(gòu)建好的pTT5-GATA5載體，用HindIII和NotII限制酶（Takara Bio Inc）按照說明書進行酶切后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行大小驗證。

將構(gòu)建好的pTT5-GATA5質(zhì)粒送往天一輝遠公司進行堿基測序，使用測序引物5'-GCCATACACTTGA GTGACAA-3'和5'-GGGATCTCGACCAAATGATT-3'。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 待細胞長至80%狀態(tài)時，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑參照說明書將pTT5-vector，pTT5-GATA5轉(zhuǎn)入細胞中，參考實驗方法［13］。

1.2.4 MTT檢測細胞增殖 將HEK-293細胞（1.5×104個/孔）鋪在96孔細胞培養(yǎng)板上，每孔補充含10%胎牛血清DMEM至500μl，培養(yǎng)12 h后，將培養(yǎng)基替換為不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)6 h，進行pTT5-vector、pTT5-GATA5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，每孔質(zhì)粒用量為0.25μg，LipofectamineTM 2000用量0.5μl。轉(zhuǎn)染24 h，48 h，72 h后，通過甲基噻唑基二苯基溴化四唑（MTT）測定細胞增殖。

1.2.5 細胞劃痕實驗 將HEK-293細胞（1.5×105個/孔）鋪在6孔細胞培養(yǎng)板上，每孔補充含10%胎牛血清DMEM至500μl，培養(yǎng)12h后，將培養(yǎng)基替換為不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)6 h，進行pTT5-vector、pTT5-GATA5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，每孔質(zhì)粒用量為0.25μg，LipofectamineTM 2000用量0.5μl。轉(zhuǎn)染24h后進行細胞劃痕實驗，分別在24h，48h，72h進行觀察記錄。

1.2.6 實時定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）將HEK-293細胞（1.2×105個/孔）平鋪于6孔板中，每孔質(zhì)粒用量為1μg，LipofectamineTM 2000用量1.2μl。參考1.2.4進行細胞轉(zhuǎn)染，分別培養(yǎng)24 h，48 h，72 h后收集細胞，通過RNA提取試劑盒提取總mRNA，通過RT-PCR試劑盒進行轉(zhuǎn)錄。

1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）檢測蛋白表達 將HEK-293細胞（1.2×105個/孔）平鋪于6孔板中，每孔質(zhì)粒用量為1μg，LipofectamineTM 2000用量1.2μl。參考1.2.4進行細胞轉(zhuǎn)染，分別培養(yǎng)24 h，48 h，72 h后收集細胞，收集細胞提取總蛋白，通過Western Blot進行蛋白表達分析，一抗為GAPDH（鼠抗1∶1500）、GATA5（兔抗1∶1500）、EpCAM（兔抗1∶1500），4℃過夜；二抗為帶有辣根脫氧化物酶的山羊抗兔（鼠抗1∶1500）、山羊抗鼠（鼠抗1∶1500），室溫2 h。具體實驗步驟參考文獻［14］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，兩樣本間比較采用t檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義［16］。

2 結(jié) 果

2.1 表達載體的構(gòu)建及其驗證

將帶有酶切位點的GATA5基因片段和pTT5-vector質(zhì)粒經(jīng)過酶切、重新聚合和提純后得到構(gòu)建好的pTT5-GATA5質(zhì)粒后（圖1.A所示），將構(gòu)建好的表達載體pTT5-GATA5質(zhì)粒再次酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳驗證相應(yīng)目的基因和載體基因的位置準(zhǔn)確性（圖1.B所示），將構(gòu)建好的質(zhì)粒進行測序后發(fā)現(xiàn)其具有完整的GATA5-cDNA堿基序列（圖1.C所示）。每次實驗至少重復(fù)三次。

2.2 GATA5蛋白在HEK-293細胞中表達

設(shè)計mRNA-GATA5的RTPCR引物，將pTT5-GATA5質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK-293細胞培養(yǎng)48h后，通過RT-PCR實驗檢測發(fā)現(xiàn)GATA5的mRNA表達增高（圖2），提示GATA5在HEK-293細胞中過表達成功。將pTT5-GATA5質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK-293細胞48 h后，設(shè)計GATA5-mRNA引物，通過RT-PCR檢測GATA5mRNA表達。每次實驗至少重復(fù)三次。

2.3 GATA5抑制HEK-293細胞的生長

將pTT5-GATA5質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK-293細胞中分別培養(yǎng)24h、48h、72 h后，通過MTT方法測定細胞增殖率，發(fā)現(xiàn)隨著時間延長，GATA5對細胞增殖抑制逐漸明顯（圖3），表明GATA5具有抑制腎癌細胞HEK-293增殖的生物活性。每次實驗至少重復(fù)三次。

2.4 在HEK-293細胞中GATA5抑制EpCAM表達

構(gòu)建設(shè)計好EpCAM的RT-PCR引物，將pTT5-GATA5質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK-293培養(yǎng)48 h后，發(fā)現(xiàn)EpCAM mRNA表達降低（圖4.A），細胞劃痕實驗發(fā)現(xiàn)表達GATA5后可以抑制細胞劃痕的愈合（圖4.B）。提示GATA5在HEK-293細胞中可以抑制EpCAM表達。每次實驗至少重復(fù)三次。

圖1 表達載體的構(gòu)建及其驗證

圖2 GATA5蛋白在HEK-293細胞中表達

3 ?討 論

GATA5具有調(diào)控細胞基因重編程，誘導(dǎo)干細胞分化成功能細胞的功能［17-18］，在不同器官中也被證實可以抑制癌細胞生長［19-20］，但GATA5在腎癌中的作用機制尚不清楚。本次實驗中，我們通過構(gòu)建pTT5-GATA5質(zhì)粒過表達GATA5后，發(fā)現(xiàn)GATA5可以抑制HEK-293細胞增殖，表明GATA5可能具有潛在抑制腎癌增殖的作用。我們發(fā)現(xiàn)腎癌細胞系HEK-293中細胞重編程因子EpCAM的表達減少，而EpCAM作為細胞重編程因子在癌癥進展中促進癌細胞惡性轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移，同時也與干細胞形成密切相關(guān)［21］，細胞劃痕實驗表明，GATA5可以抑制細胞的劃痕修復(fù)愈合，而細胞劃痕愈合與EpCAM的表達密切相關(guān)，這提示GATA5可以通過抑制EpCAM的表達起到抑制腎癌細胞生長的作用。

圖3 GATA5對HEK-293細胞的生長影響

圖4 在HEK-293細胞中GATA5對EPCAM表達影響

綜合上述，EpCAM可能是GATA5發(fā)揮抑癌作用的下游靶點，在腎癌發(fā)生過程中靶向激活表達GATA5可能成為腎癌生物治療方法，本研究為深入研究GATA5參與抑癌分子通路提供了思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突