張寧，李自輝，葉濤，龐牧，劉樹民*，李玲

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001）

四性（氣）是中藥藥性理論的重要組成部分，是說明藥物作用的主要理論依據(jù)之一［1］。課題組前期嚴(yán)格按照首席科學(xué)家匡海學(xué)教授提出的中藥性（氣）味科學(xué)內(nèi)涵新假說內(nèi)容，建立與冰水浴誘導(dǎo)的寒凝血瘀證病理相關(guān)的動(dòng)物寒證模型，基于“寒者熱之，熱者寒之”理論，用于中藥藥性（氣）關(guān)鍵科學(xué)問題研究［2］。而代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，其研究思想與中醫(yī)藥研究思想的整體觀相似，已廣泛應(yīng)用于中藥藥性理論研究，這對(duì)推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化具有重要作用［3］。近年來研究表明，代謝組學(xué)技術(shù)可較好探討寒證的科學(xué)本質(zhì)［4－7］。

《靈樞·邪氣藏府病形》中說：“有所墮墜，惡血留內(nèi)，……積于脅下，則傷肝”。瘀血停于體內(nèi)，當(dāng)“惡血?dú)w肝”超越肝本身的“去瘀生新”，即新陳代謝功能的最大限度時(shí)，會(huì)阻滯氣機(jī)，產(chǎn)生傷肝的病理變化。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝既藏有形之血，又疏泄無形之氣，其中疏泄調(diào)暢氣機(jī)是其基本功能，貫穿其他功能之中。古人又有“肝主血?！敝f，可見肝與瘀血的形成關(guān)系密切。且課題組前期已初步驗(yàn)證建立的寒凝血瘀大鼠模型具有一定的科學(xué)性［2］。故本研究運(yùn)用肝臟代謝組學(xué)技術(shù)，探討寒凝成瘀的可能機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD 大鼠，雄性，20 只，體質(zhì)量180～220 g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（遼）2015－0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的代謝籠中，室內(nèi)溫度20～25℃，相對(duì)濕度40%～60%，12 h避光，12 h光照，自由飲食。經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)審核，符合科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)章程》的相關(guān)規(guī)定，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查批準(zhǔn)編號(hào)為DWLL20151108001。

1.2 藥物與試劑

乙腈（色譜級(jí)，F(xiàn)isher 技術(shù)有限公司，美國(guó)）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料公司）；甲酸和亮氨酸腦啡肽（Sig－ma－Aldrich，美國(guó)）；細(xì)胞色素C 氧化酶（COX）、ATP 合酶（ATPase）、腺苷激酶（ADK）和Na＋－K＋－ATP 酶酶聯(lián)免疫試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20160320）。

1.3 主要儀器

AcquityTMUPLC 液相色譜與Q－TOF－MS 質(zhì)譜儀（Waters 集團(tuán)公司，美國(guó)）；MassLynxV4.1 工作站（Waters集團(tuán)公司，美國(guó)）；KDC－160HR型高速低溫離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份公司）；Milli－Q超純水系統(tǒng)（Milli－Q公司）；超低溫冰箱（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司）；AL204電子天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）；MS3 digital 渦旋儀（德國(guó)IKA公司）；Anthos2010酶標(biāo)儀（奧地利安圖斯公司）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

大鼠隨機(jī)分為空白組和寒凝血瘀模型組兩組，每組10只。除空白組外，模型組大鼠置于0～1 ℃冰水中15 min，每日1次，連續(xù)15 d，造成寒凝血瘀模型。

2.2 能量代謝相關(guān)指標(biāo)含量的測(cè)定

末次冰水浴24 h 后，將大鼠麻醉，取相同部位肝臟加入9 倍體積4 ℃生理鹽水制備成10%組織勻漿，于4 ℃3 500 r/min 離心10 min，取上清液，根據(jù)酶聯(lián)免疫檢測(cè)法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作檢測(cè)肝臟組織上清液中COX、ATPase、ADK 和Na+－K+－ATP含量。

2.3 肝臟代謝組學(xué)樣本的處理

末次冰水浴24 h后，將大鼠麻醉，取相同部位肝臟加入10倍體積4 ℃甲醇，制備成勻漿，渦旋混勻3 min，于4 ℃12 000 r/min 離心15 min，取上清液存于離心管，重復(fù)上述條件離心一次，用于代謝組學(xué)分析。

2.4 UPLC－MS條件

色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（2.1 mm × 50 mm，i.d.1.7 μm）；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.4 mL/min；流動(dòng)相：0.05%甲酸乙腈（A）－0.05%甲酸水溶液（B）；洗脫梯度：2%～40%A（0～8 min），40%～98% A（8～10 min），98%～100% A（10～13 min），100%～2% A（13～14 min），2%A（14～17 min）；柱溫：40 ℃。電噴霧離子源（ESI），源溫度110 ℃，脫溶劑氣流量750 L/h，脫溶劑氣溫度350 ℃。正離子模式下，毛細(xì)管電壓1 300 V，樣品錐孔電壓60 V，離子能量35 V；負(fù)離子模式下毛細(xì)管電壓1 500 V，樣品錐孔電壓70 V，離子能量34 V，質(zhì)量掃描范圍100～1 500 Da。

2.5 大鼠肝臟樣本潛在標(biāo)志物的代謝組學(xué)分析

MS 數(shù)據(jù)首先導(dǎo)入到Progenesis QI 3.0.3 軟件進(jìn)行色譜峰匹配、提取、標(biāo)準(zhǔn)化、歸一化等，將正、負(fù)離子模式下每個(gè)代謝物的m/z、保留時(shí)間和離子強(qiáng)度，導(dǎo)入到EZinfo3.0.3 軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）用于觀察每組樣本代謝輪廓是否能夠顯著分開，然后用正交偏最小二乘判別分析（orthogonal to partial least squares－discriminate analysis，OPLS－DA）表征冰水浴誘導(dǎo)的代謝擾動(dòng)［8］。通過與EZinfo3.0.3的無縫集成來利用高級(jí)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（Umetrics，V 2.0 版）得到展現(xiàn)貢獻(xiàn)度最大變量的S－plots 圖和變量權(quán)重值（VIP）。根據(jù)VIP > 1、S－plot 和P< 0.05 選擇冰水浴誘導(dǎo)的寒凝血瘀證的潛在生物標(biāo)志物。應(yīng)用HMDB（http：//www.hmdb.ca/）、KEGG（https：//www.kegg.jp/）以及MetPA（https：//www.metaboanalyst.ca/）數(shù)據(jù)庫對(duì)潛在差異代謝標(biāo)記物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定及代謝通路拓?fù)浞治觯U釋其生物學(xué)意義，評(píng)價(jià)冰水浴對(duì)大鼠物質(zhì)能量代謝的影響。

2.6 數(shù)據(jù)處理

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS22.0 軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以±s表示，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，組間比較用最小顯著差異（LSD）進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 冰水浴對(duì)正常大鼠能量代謝相關(guān)指標(biāo)的影響

與空白組相比較，模型組大鼠肝臟中COX和Na＋－K＋－ATP 酶的含量顯著性降低（P< 0.05），ATPase 和ADK的含量極顯著性降低（P<0.01）。見表1。

表1 冰水浴對(duì)正常大鼠COX、ATPase、ADK、Na+－K+－ATP酶的影響（±s，n=10）

表1 冰水浴對(duì)正常大鼠COX、ATPase、ADK、Na+－K+－ATP酶的影響（±s，n=10）

注：與空白組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

組別空白組模型組COX（ng/mL）1.49±0.12 1.26±0.20▲ATPase（ng/mL）5.19±0.35 4.55±0.33▲▲ADK（ng/mL）2.31±0.33 1.89±0.19▲▲Na+－K+－ATP（gprot/L）7.82±1.94 6.00±1.22▲

3.2 大鼠肝臟代謝總離子色譜圖

應(yīng)用Marker Lynx XS 對(duì)大鼠肝臟樣品的離子峰進(jìn)行識(shí)別與匹配，得到空白組和模型組總離子流色譜圖（TIC）。結(jié)果兩組數(shù)據(jù)代謝產(chǎn)物分離，輪廓清晰。見圖1。

圖1 正、負(fù)離子模式下空白組和寒凝血瘀證模型組大鼠肝臟代謝TIC圖

3.3 大鼠肝臟數(shù)據(jù)的分析

應(yīng)用監(jiān)督性3D－PCA 表現(xiàn)大鼠肝臟樣本代謝輪廓的狀態(tài)。結(jié)果表明空白組與模型組明顯分開，提示兩組之間存在顯著性差異且造模成功。由S－Plot 圖可知，大多數(shù)代謝產(chǎn)物離子在原點(diǎn)周圍聚集，偏離原點(diǎn)的離子占少數(shù)，說明兩組之間存在差異；經(jīng)VIP> 1 篩選得到VIP－Plot 圖并預(yù)選出潛在生物標(biāo)志物。見圖2。

圖2 正、負(fù)離子模式下冰水浴前后各組大鼠肝臟代謝輪廓3D－PCA、S－Plot和VIP－Plot模式識(shí)別圖

3.4 大鼠肝臟數(shù)據(jù)的潛在生物標(biāo)志物

篩選符合VIP > 1 及Fold Change > 1.0 的代謝產(chǎn)物，對(duì)空白組與模型組進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)25 個(gè)差異代謝產(chǎn)物（見表2）；經(jīng)過離子強(qiáng)度的比較發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，模型組16 個(gè)生物標(biāo)志物顯著上調(diào)（P<0.05），9 個(gè)生物標(biāo)志物顯著下調(diào)（P<0.05），見圖3。

圖3 冰水浴對(duì)正常大鼠肝臟中潛在生物標(biāo)志物離子強(qiáng)度的影響

3.5 肝臟中潛在生物標(biāo)志物的分類

針對(duì)被篩選出的潛在生物標(biāo)志物，根據(jù)HMDB 數(shù)據(jù)庫中所描述的細(xì)胞位置、生物功能、生物進(jìn)程和化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類。在細(xì)胞位置上，大約53%位于細(xì)胞外，41%位于細(xì)胞膜，3%位于細(xì)胞漿，3%位于溶酶體上；在生物功能上，用于能源、膜穩(wěn)定劑和儲(chǔ)能的各占29%，用于炎癥的占5%，用于藥物代謝物和廢品的各占6%；在生物進(jìn)程方面，參與脂代謝的占25%，參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的占22%，參與磷脂代謝的占10%；在化學(xué)結(jié)構(gòu)上，大約68%的屬于脂肪族無環(huán)化合物，大約16%屬于脂肪族雜環(huán)化合物，大約8%屬于脂肪族同多環(huán)化合物，見圖4。

3.6 肝臟中潛在生物標(biāo)志物的通路分析

將表2 中被篩選出來的生物標(biāo)志物通過Meta PA分析，得到8 條相關(guān)代謝途徑，見表3。將代謝通路影響值的臨界值> 0.10 確定與所分析物組相關(guān)性最強(qiáng)的代謝通路。冰水浴對(duì)正常大鼠代謝道路分析圖見圖5，冰水浴主要影響甘油磷脂代謝。

圖5 冰水浴對(duì)正常大鼠代謝通路分析圖

表3 利用Meta PA分析冰水浴對(duì)正常大鼠的代謝指紋通路

4 討論

4.1 氧化磷酸化過程

在細(xì)胞呼吸中處于細(xì)胞色素系統(tǒng)末端的細(xì)胞色素C 氧化酶（Cytochrome C Oxidase），亦稱細(xì)胞色素氧化酶，此酶是通過自動(dòng)氧化作用把呼吸底物的電子經(jīng)過細(xì)胞色素系統(tǒng)直接傳遞給分子態(tài)氧［9］。ATP 合酶（ATPase）又稱為三磷酸腺苷酶，可將三磷酸腺苷（ATP）催化水解為二磷酸腺苷（ADP）和磷酸根離子，同時(shí)釋放能量［10］。在大多數(shù)情況下，能量通過傳遞而被用于驅(qū)動(dòng)另一個(gè)需要能量的化學(xué)反應(yīng)，此過程被所有已知的生命形式廣泛利用［11］。鑲嵌于線粒體內(nèi)膜上的鈉鉀泵又稱鈉泵、鈉鉀ATP 酶（Na＋－K＋－ATP 酶），是維持線粒體膜流動(dòng)性正常的關(guān)鍵酶，若該酶活性下降，損傷線粒體膜正常的流動(dòng)性，從而造成線粒體功能障礙，導(dǎo)致ATP 合成不足，繼而又使Na＋－K＋－ATP 酶的活性降低，二者相互影響［12］。腺苷參與調(diào)控機(jī)體的心肌能量代謝、脂肪代謝、免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)等一系列生理過程，而腺苷激酶（Adenosine kinase，ADK）在腺苷代謝中起到至關(guān)重要的作用，其催化腺苷生成AMP，進(jìn)而調(diào)節(jié)腺苷的濃度，最終參與調(diào)控機(jī)體的不同生理過程。ADK 可以催化ADP 合成ATP［13］。本研究中，冰水浴抑制COX、ATPase、ADK 和Na＋－K＋－ATP酶的表達(dá)，說明冰水浴對(duì)于正常大鼠機(jī)體的呼吸鏈表現(xiàn)出抑制作用，其抑制氧化磷酸化反應(yīng)中ATP 生成的機(jī)制可能與抑制COX 和ATPase 活性、抑制線粒體Na＋－K＋－ATP酶的功能有關(guān)。

4.2 甘油磷脂代謝

脂質(zhì)是生物膜的骨架成分，既參與生物的生命活動(dòng)又為生物提供能量的重要物質(zhì)［14］。磷脂是生物膜的主要結(jié)構(gòu)成分，包括一系列的脂肪?；皖^部親水性成分，如磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿［15］。本研究中溶血磷脂酸LPA［0：0/18：1（9Z）］、磷脂酰乙醇胺PE（P－18：0/22：6（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z））和PC（15：0/18：0）參與甘油磷脂代謝。

迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小、結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的磷脂是溶血磷脂酸（LPA），主要是由凝血過程中的血小板受到凝血酶活化而釋放入血的，是凝血和血栓形成過程中的重要分子產(chǎn)物［16］。LPA 的含量在一定程度上反映了血瘀證的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸，據(jù)報(bào)道LPA與凝血過程密切相關(guān)［17］。本研究中，模型組大鼠LPA（0：0/18：1（9Z））水平較正常對(duì)照組明顯增加（P<0.05），提示采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法，冰水浴誘導(dǎo)的寒凝血瘀證大鼠模型，顯示模型復(fù)制成功。

膽堿通過膽堿激酶催化生成的PC（又稱膽堿磷酸甘油酯）是一種至關(guān)重要的生物分子，是磷脂合成的前體。在生物界分布很廣，且有重要的生物功能，有控制動(dòng)物機(jī)體脂肪代謝作用［18］。據(jù)報(bào)道，磷脂酰膽堿通過直接影響膜結(jié)構(gòu)使受損的肝功能和酶活力恢復(fù)正常，維持肝臟的能量平衡，進(jìn)而促進(jìn)肝組織再生，將中性脂肪和膽固醇轉(zhuǎn)化成容易代謝的形式，穩(wěn)定機(jī)體膽汁水平［19］。本研究，模型組大鼠PC（15：0/18：0）水平較正常對(duì)照組明顯降低（P<0.05），說明冰水浴通過下調(diào)磷脂酰膽堿水平進(jìn)而降低寒凝血瘀大鼠機(jī)體能量代謝。

PE，磷脂質(zhì)的一種。在動(dòng)物中，經(jīng)過CDP 乙醇胺和1，2－甘油二酯的反應(yīng)生成PE。后者經(jīng)磷脂酶A 作用生成溶血磷脂酰乙醇胺［20］。據(jù)報(bào)道，在老鼠肝臟中，它與卵磷脂一起在微粒體和線粒體間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，影響肝細(xì)胞膜Na+－Ca2+轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響能量代謝［21］。另外，PE與血液凝固有關(guān)，可能是凝血酶激活酶的輔基［16］。本研究中，模型組大鼠PE（P－18：0/22：6（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z））水平較正常對(duì)照組明顯降低（P<0.05），說明冰水浴可能通過下調(diào)PE 水平進(jìn)一步催化凝血酶產(chǎn)生血瘀反應(yīng)，同時(shí)抑制寒凝血瘀大鼠機(jī)體的能量代謝。

4.3 動(dòng)物模型寒凝血瘀證代謝組學(xué)研究

建立相應(yīng)的寒凝血瘀證動(dòng)物模型，分析生物樣本，有助于進(jìn)一步探討寒凝血瘀證科學(xué)本質(zhì)，為臨床診斷和治療奠定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。孟憲生等［22］注射大劑量腎上腺素和冰浴誘導(dǎo)氣滯寒凝血瘀模型，基于血漿代謝組學(xué)找到其潛在生物標(biāo)志物及機(jī)制。MA等［23］運(yùn)用冰水浴和注射腎上腺素誘導(dǎo)急性血瘀證，發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)有助于評(píng)價(jià)急性血瘀證機(jī)制。課題組前期研究［2］發(fā)現(xiàn)，16S rRNA 的高通量基因測(cè)序技術(shù)與糞便上清代謝組學(xué)技術(shù)的聯(lián)用可用于評(píng)價(jià)冰水浴誘導(dǎo)的寒凝血瘀證的病理機(jī)制。WU等［24］用冰水浴聯(lián)合皮下注射鹽酸腎上腺素誘導(dǎo)大鼠血瘀證，發(fā)現(xiàn)血清代謝組學(xué)可較好的評(píng)價(jià)血瘀證的病理機(jī)制。然而，尚未發(fā)現(xiàn)肝臟代謝組學(xué)技術(shù)與寒凝血瘀證的相關(guān)研究。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝乃藏血之臟，肝失疏泄則肝氣郁結(jié)，氣滯血瘀可能為寒凝血瘀證病因之一。故從肝臟代謝組學(xué)角度出發(fā)，闡明寒凝血瘀證的病理機(jī)制為本研究的特色和創(chuàng)新之處。

綜上所述，本研究在傳統(tǒng)生理、生化基礎(chǔ)上，通過肝臟代謝組學(xué)分析技術(shù)，尋找出25 個(gè)具有生物學(xué)意義的顯著差異潛在生物標(biāo)志物，闡明寒凝血瘀的主要代謝通路為甘油磷脂代謝。冰水浴通過影響正常大鼠的能量代謝過程相關(guān)指標(biāo)、肝臟代謝產(chǎn)物和相關(guān)潛在代謝通路，抑制機(jī)體能量代謝和功能活動(dòng)，符合寒證特點(diǎn)，為從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)角度驗(yàn)證匡海學(xué)教授中藥性（氣）味科學(xué)內(nèi)涵新假說奠定扎實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，這對(duì)中藥藥性理論研究以及推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化具有重要作用。