王娟梅 方孝美 宋 冰

海鹽縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江嘉興，314300

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponemapallidum, TP)感染引起的以性接觸傳播為主的傳染病，也可通過血液傳播和母嬰傳播[1]。孕婦一旦感染,可導(dǎo)致胎兒早產(chǎn)、死產(chǎn)或娩出先天梅毒患兒。目前對(duì)于梅毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)包括梅毒螺旋體檢查和血清學(xué)檢查，后者包括電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)(TPPA)、免疫印跡實(shí)驗(yàn)(TP-WB)等。TPPA使用TP減毒株制備抗原，與血清中抗體產(chǎn)生凝集反應(yīng)，具有較高的靈敏度、特異性，美國(guó)疾病預(yù)防控制中心推薦TPPA作為確診方法[2]。ECLIA、CLIA、ELISA等檢測(cè)方法具有較高的靈敏度，但均有一定假陽(yáng)性，臨床檢測(cè)常出現(xiàn)幾種方法結(jié)果不一致情況[3]。以往研究大多采用化學(xué)發(fā)光或ELISA篩查陽(yáng)性后，再用TPPA確診[4]，此方式無(wú)法真實(shí)判斷試劑檢測(cè)的靈敏度和特異性，本研究采用TPPA確診標(biāo)本來(lái)進(jìn)行三種方法學(xué)的比較，具體研究如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 分析我院2020年6月至2020年12月間經(jīng)TPPA確診的梅毒特異性抗體陽(yáng)性標(biāo)本60例，陰性標(biāo)本60例，其中男71例，女49例，年齡18～86歲，并收集患者是否有痛風(fēng)、心腦血管、腫瘤、糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等基礎(chǔ)疾病。

1.2 儀器與試劑 ECLIA由羅氏電化學(xué)發(fā)光分析儀(Cobas e602)及其配套試劑檢測(cè)完成(批號(hào)：51677002)，CLIA由萬(wàn)泰生物Caris200及其配套試劑檢測(cè)完成(批號(hào)：20200626)。TPPA檢測(cè)試劑盒由日本富士瑞必歐株式會(huì)社生產(chǎn)(批號(hào)：20200603)，ELISA檢測(cè)試劑盒由萬(wàn)泰生物生產(chǎn)(批號(hào)：N20200216)。

1.3 方法 實(shí)驗(yàn)前將-20℃冷凍保存血清標(biāo)本取出后復(fù)融，以TPPA檢測(cè)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，篩選TPPA陽(yáng)性標(biāo)本60例，陰性標(biāo)本60例，分別通過ECLIA、CLIA、ELISA三種方法對(duì)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，并嚴(yán)格設(shè)立陰性、陽(yáng)性對(duì)照。ECLIA、CLIA從測(cè)試到結(jié)果完成均由儀器自動(dòng)完成，根據(jù)試劑盒說明書，將S/CO≥1樣本判斷為陽(yáng)性，S/CO<1則判斷為陰性。ELISA的檢測(cè)采用雙抗原夾心法，按照試劑盒說明書，采用手工方法操作后酶標(biāo)儀讀取OD值。TPPA的檢測(cè)采用手工操作，按照試劑說明書肉眼判讀結(jié)果，反應(yīng)孔中光滑紐扣樣為陰性，出現(xiàn)凝集和不規(guī)則沉淀為陽(yáng)性。比較三種方法不同S/CO區(qū)段TPPA檢測(cè)結(jié)果，確定不同檢測(cè)方法的靈敏度、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、符合率、Kappa值等。分析不同方法學(xué)間S/CO相關(guān)性，并建立一元回歸方程，通過受試者工作曲線(ROC)判斷不同方法學(xué)對(duì)梅毒的診斷價(jià)值，并確定S/CO最佳截?cái)嘀?，比較不同方法學(xué)AUC面積，了解與金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果不符樣本的臨床特征。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異分析采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)，兩連續(xù)變量相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，通過ROC曲線比較不同方法學(xué)對(duì)梅毒的診斷效果，根據(jù)Youden指數(shù)最大時(shí)S/CO值作為最佳截?cái)嘀?，采用Medcalc軟件進(jìn)行AUC比較，研究采用z檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同方法學(xué)檢測(cè)結(jié)果與TPPA檢測(cè)結(jié)果差異比較 ECLIA、CMI法S/CO<1時(shí)，所有標(biāo)本TPPA檢測(cè)均為陰性，ELISA法S/CO<1時(shí)，其中2例樣本TPPA檢測(cè)為陽(yáng)性。ECLIA法S/CO≥5時(shí)，TPPA檢測(cè)陽(yáng)性率為100.00%，CLIA法S/CO≥7時(shí)，TPPA檢測(cè)陽(yáng)性率為100.00%，ELISA法S/CO≥7時(shí)，TPPA檢測(cè)陽(yáng)性率為100.00%，見表1。

表1 不同方法學(xué)檢測(cè)結(jié)果與TPPA檢測(cè)結(jié)果 例(%)

2.2 不同檢測(cè)方法S/CO相關(guān)性分析 ECLIA、CLIA法S/CO呈正相關(guān)，兩者間函數(shù)為y=1.1131x-0.0339(R2=0.877)。ELISA、ECLIA法S/CO呈正相關(guān)，兩者間函數(shù)為y=0.4907x+1.1931(R2=0.531)。ELISA、CLIA法S/CO呈正相關(guān)，兩者間函數(shù)為y=0.5978x+1.008(R2=0.558)，均P<0.05。ECLIA、CLIA法S/CO R2值均明顯高于ELISA與ECLIA法、ELISA與CLIA法(圖1～3)。

圖1 ECLIA、CLIA法S/CO散點(diǎn)圖 圖2 ELISA、ECLIA法S/CO散點(diǎn)圖 圖3 ELISA、CLIA法S/CO散點(diǎn)圖

2.3 不同檢測(cè)方法性能比較 ECLIA檢測(cè)梅毒特異性抗體靈敏度為100.00%，特異性為93.33%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為93.75%，陰性預(yù)測(cè)值為100.00%，符合率為96.67%，Kappa值為0.933，ECLIA、TPPA兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.125)。CLIA檢測(cè)梅毒特異性抗體靈敏度為100.00%，特異性為91.67%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為92.31%，陰性預(yù)測(cè)值為100.00%，符合率為95.83%，Kappa值為0.917，CLIA、TPPA兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.062)。ELISA檢測(cè)梅毒特異性抗體靈敏度為96.67%，特異性為86.67%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為87.88%，陰性預(yù)測(cè)值為96.30%，符合率為91.67%，Kappa值為0.833，ELISA、TPPA兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.109)，見表2。

表2 三種檢測(cè)方法性能比較 例

2.4 三種檢測(cè)方法ROC曲線分析 ECLIA檢測(cè)梅毒特異性抗體AUC為0.964(0.926～0.999)，S/CO截?cái)嘀?.90時(shí)，Youden指數(shù)最高。CLIA檢測(cè)梅毒特異性抗體AUC為0.946(0.903～0.989)，S/CO截?cái)嘀?.20時(shí)，Youden指數(shù)最高。ELISA檢測(cè)梅毒特異性抗體AUC為0.898(0.836～0.959)，S/CO截?cái)嘀?.30時(shí)，Youden指數(shù)最高，見圖4、表3。

表3 最佳截?cái)嘀禃r(shí)不同方法檢測(cè)性能

圖4 三種檢測(cè)方法ROC曲線分析

2.5 三種檢測(cè)方法曲線下面積比較 使用Medcalc軟件對(duì)3種方法學(xué)進(jìn)行AUC比較，結(jié)果顯示，ECLIA、CLIA法診斷梅毒的AUC面積均大于ELISA法，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，CLIA、ECLIA診斷梅毒的AUC差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 三種方法學(xué)AUC面積比較

2.6 假陽(yáng)性、假陰性樣本臨床特征 ECLIA、CLIA、ELISA法分別有4例、5例、8例檢測(cè)結(jié)果為假陽(yáng)性，其中3例標(biāo)本三種方法檢測(cè)均為假陽(yáng)性。所有假陽(yáng)性樣本中有基礎(chǔ)疾病占比高于無(wú)基礎(chǔ)疾病，年齡≥50歲占比高于<50歲，見表5。ECLIA、CLIA檢測(cè)樣本均無(wú)假陰性樣本，ELISA法假陰性樣本2例，均為男性，其中一例為再生障礙性貧血，另一例為一期梅毒。

表5 三種方法學(xué)檢測(cè)假陽(yáng)性標(biāo)本臨床特征分析

3 討論

以往研究表明，梅毒螺旋體免疫印跡試驗(yàn)(TP-WB)診斷靈敏度、特異性均較高，早期潛伏期梅毒、Ⅱ期梅毒、神經(jīng)梅毒的陽(yáng)性診斷率達(dá)100%[5]，是梅毒診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于其操作復(fù)雜，影響因素眾多，臨床開展較少，故本次實(shí)驗(yàn)采用TPPA作為梅毒特異性抗體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。Park[2]等對(duì)不同臨床分期的梅毒患者分別采用5種檢測(cè)方法進(jìn)行梅毒特異性抗體檢測(cè)，證實(shí)除熒光螺旋體抗體吸收實(shí)驗(yàn)(FTA-ABS)外，其余4種檢測(cè)方法敏感性均高于95.00%，F(xiàn)TA-ABS敏感性顯著低于TPPA。Ji[6]采用多中心研究比較CLIA、ELISA法檢測(cè)梅毒特異性抗體差異，認(rèn)為CLIA特異性較高，萬(wàn)泰ELISA檢測(cè)試劑盒敏感性最高。但暫未發(fā)現(xiàn)不同方法學(xué)S/CO相關(guān)性和檢測(cè)梅毒特異性抗體最佳截?cái)嘀档南嚓P(guān)報(bào)道。

賀鋒等[7]研究認(rèn)為雅培化學(xué)發(fā)光磁微粒免疫分析(CMIA)法S/CO>6.01或科美CLIA法S/CO>9.01時(shí)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均為100.00%。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著S/CO增加，三種方法檢測(cè)的真陽(yáng)性率逐漸增加，當(dāng)ECLIA法S/CO≥5或CLIA法S/CO≥7或ELISA法S/CO≥7時(shí)，不同方法學(xué)檢測(cè)的樣本均為真陽(yáng)性。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，ECLIA法、CLIA法S/CO R2值均明顯高于ELISA與ECLIA法、ELISA與CLIA法，結(jié)果產(chǎn)生的原因可能與ECLIA、CLIA法均為自動(dòng)化儀器，批間檢測(cè)變異度較小，而本研究ELISA為手工法，不同檢測(cè)批次間變異度偏大有關(guān)。在梅毒篩查實(shí)驗(yàn)中，診斷試劑特異性偏低可導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，可能會(huì)由于錯(cuò)誤的梅毒診斷而給患者帶來(lái)精神負(fù)擔(dān)。而診斷試劑靈敏度偏低則可導(dǎo)致假陰性結(jié)果，造成一定程度的漏診，影響患者的早期診斷和早期治療[2]。Chen等[8]比較了兩種化學(xué)發(fā)光儀器檢測(cè)梅毒螺旋體特異性抗體效能，發(fā)現(xiàn)兩種化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法均存在一定程度的漏診和誤診。Xia等[9]研究發(fā)現(xiàn)，羅氏ECLIA、雅培CMIA、邁瑞CLIA檢測(cè)梅毒特異性抗體敏感度均為100.00%，與本研究相符。本研究亦發(fā)現(xiàn)三種方法與TPPA檢測(cè)結(jié)果均為高度一致，ECLIA法、CLIA法、ELISA法Kappa值分別為0.933、0.917、0.833，ECLIA法、CLIA檢測(cè)靈敏度較高，所有TP樣本均成功檢出，ELISA法有2例樣本漏檢，患者均為男性，其中一例為再生障礙性貧血，另一例為一期梅毒。再生障礙性貧血患者存在一定程度的體液免疫抑制和細(xì)胞免疫亢進(jìn)，加上臨床常采用免疫抑制的治療手段，導(dǎo)致ELISA檢測(cè)假陰性。三種檢測(cè)方法均存在一定的假陽(yáng)性，后續(xù)通過病歷資料的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，此類患者大部分有基礎(chǔ)性疾病，如痛風(fēng)、惡性腫瘤等。王欣俞等[10]研究認(rèn)為可能與患者血清中一些干擾因素，如類風(fēng)濕因子、異嗜性抗體、補(bǔ)體、自身抗體等有關(guān)。高楠等[11]通過ROC曲線分析比較了8種ELISA試劑檢測(cè)梅毒特異性抗體的差異，發(fā)現(xiàn)所有試劑S/CO最佳截?cái)嘀稻哂趶S家推薦值，更高于實(shí)驗(yàn)室設(shè)定工作S/CO值。本研究亦證實(shí)，ECLIA、CLIA、ELISA最佳S/CO截?cái)嘀捣謩e為1.90、2.20、2.30，均高于廠商推薦值，可能因廠商通過降低S/CO值提高試劑檢測(cè)的靈敏度，減少漏檢。ECLIA法、CLIA法診斷梅毒的AUC均大于ELISA法，說明其診斷效能高于ELISA法。在梅毒臨床診斷中，可以優(yōu)化檢測(cè)流程，對(duì)于ECLIA法S/CO≥5或CLIA法S/CO≥7或ELISA法S/CO≥7標(biāo)本無(wú)需進(jìn)一步進(jìn)行TPPA的檢測(cè)，以節(jié)約醫(yī)療資源，對(duì)于ECLIA法S/CO<5或CLIA法S/CO<7或ELISA法S/CO<7標(biāo)本必須經(jīng)TPPA復(fù)檢，結(jié)合臨床疾病特征后予以確診。本研究納入樣本數(shù)偏少，可能導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)結(jié)果出現(xiàn)偏差，ROC曲線分析時(shí)折點(diǎn)明顯，另本研究中ELISA法均為手工操作，可能會(huì)導(dǎo)致不同檢測(cè)批次間對(duì)照孔OD值出現(xiàn)一定波動(dòng)。

綜上所述，三種梅毒特異性抗體檢測(cè)方法均有較高的靈敏度和特異性，與TPPA檢測(cè)結(jié)果具有高度一致性，ECLIA、CLIA法診斷效能高于ELISA法。所有的檢測(cè)方法都具有其特殊的應(yīng)用范圍，只運(yùn)用單一的試劑診斷有很大的局限性，存在一定誤診和漏診。臨床工作中，梅毒的診斷需綜合血清學(xué)、病史、臨床表現(xiàn)等加以判斷，盡可能減少誤診、漏診。