馮亞輝 李仁哲 嚴(yán)紅霞 史冬梅，4

1 濟寧醫(yī)學(xué)院，山東濟寧，272001；2 濟寧市第一人民醫(yī)院檢驗科，山東濟寧，272001；3 濟寧市第一人民醫(yī)院皮膚科，山東濟寧，272001；4 濟寧市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)真菌實驗室，山東濟寧，272001

海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)屬于非典型分枝桿菌又稱為非結(jié)核分枝桿菌(Nontuberculousmycobacteria，NTM)，在自然界中主要分布于水中，依據(jù)其生長速度劃分為緩慢生長組，光照產(chǎn)色，最適生長溫度為30～32℃，機會性人體感染中多表現(xiàn)為淺部感染，深部感染少見，但亦可引發(fā)諸如關(guān)節(jié)炎、骨髓炎等深部感染，加重多與原發(fā)皮損診斷不明使用類固醇激素有關(guān)。其臨床表現(xiàn)可有局限斑塊，沿淋巴管走行的皮下結(jié)節(jié)等，常與孢子絲菌病、皮膚腫瘤等難以鑒別[1]。外傷后接觸史、臨床表現(xiàn)、病理活檢、組織培養(yǎng)、PCR檢測等均有助于診斷。本文對既往經(jīng)病原學(xué)診斷成功治療的9例魚刺傷或外傷后感染海分枝桿菌的病例進行分析報道，以期提高臨床對本病的認(rèn)識。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集濟寧市第一人民醫(yī)院皮膚科自2020年8月至2021年4月經(jīng)病原學(xué)診斷為海分枝桿菌的病例共9例，其中男7例、女2例。記錄患者年齡、職業(yè)、感染途徑、病程時間、皮損形態(tài)、病理檢查結(jié)果、病原學(xué)培養(yǎng)結(jié)果、結(jié)核菌素實驗(PPD)及結(jié)核菌感染T細(xì)胞斑點試驗(T-spot)結(jié)果、胸部影像學(xué)結(jié)果、治療方案和轉(zhuǎn)歸情況等。

1.2 方法

1.2.1 病理活檢及組織培養(yǎng) 將患者皮損拍照后完成病理活檢，充分消毒取材區(qū)域，切取皮損處組織至淺筋膜層，將所得組織縱行剖開。一半置于福爾馬林溶液固定并完成HE、PAS及抗酸染色；一半在無菌容器中充分剪碎，分別接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、哥倫比亞血平板、巧克力平板、MiddleBrook 7H10瓊脂中，沙氏葡萄糖瓊脂及哥倫比亞血平板置于27℃培養(yǎng)，巧克力平板及MiddleBrook 7H10瓊脂置于30℃培養(yǎng)，每3天觀測一次，直至第5周。

1.2.2 病原菌分離及鑒定 持續(xù)觀察直至培養(yǎng)基上出現(xiàn)淺黃色或深黃色，表面略粗糙，邊緣不規(guī)則菌落。挑取單菌落于MiddleBrook 7H10瓊脂純化培養(yǎng)7天。將純化菌株行飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)及16S核糖體RNA基因測序鑒定，MALDI-TOF大于99.9%置信區(qū)間結(jié)果及NCBI數(shù)據(jù)庫比對相似度大于99%結(jié)果為最終鑒定結(jié)果，將測序結(jié)果與NCBI查詢到海分枝桿菌參比菌株基因?qū)隡AGA X軟件，建立最大似然比法的系統(tǒng)發(fā)育樹，對所得菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 將患者臨床資料進行匯總，并繪制三線表進行描述性統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 本研究共納入9例經(jīng)病原學(xué)診斷為海分枝桿菌感染患者，其中男7例(78%)，女2例(22%)。年齡分布區(qū)間為21～63歲，平均(40.4±14.16)歲。9例患者中廚師或后廚工作人員4例，魚類養(yǎng)殖或銷售2例，工人3例。所有患者均有外傷史，其中明確魚類創(chuàng)傷6例(67%)，創(chuàng)傷后污水沾染3例(33%)。病程0.5～12個月，平均(4.6±4.41)個月。其中3例患者表現(xiàn)為局限斑塊型(圖1a～1c)，6例患者表現(xiàn)為沿淋巴管線狀分布的暗紅色皮下結(jié)節(jié)(圖1d～1j)；皮損8例發(fā)生于上肢、1例發(fā)生于下肢。9例患者均行PPD實驗，7例陽性，2例陰性。5例患者同期行T-spot實驗，3例陽性，2例陰性，其中PPD實驗及T-spot實驗雙重陽性2例，PPD實驗陰性T-spot實驗陽性1例；9例患者胸部CT均未見明顯異常?；颊呓?jīng)過單獨克拉霉素(clarithromycin, CLR)、克拉霉素聯(lián)合異煙肼(isoniazid, INH)或利福平(rifampicin, RFP)和/或聯(lián)合光動力治療(ALA-PDT)，均痊愈或明顯好轉(zhuǎn)。將患者原發(fā)皮損消退70%定義為好轉(zhuǎn)，統(tǒng)計單用藥物治療及藥物聯(lián)合光動力治療的平均好轉(zhuǎn)周期，單用藥物組平均好轉(zhuǎn)周期為(5.8333±1.33)周，光動力聯(lián)合藥物治療平均好轉(zhuǎn)周期為(2.67±0，578)周，治療時間明顯縮短，見表1。

表1 魚刺傷肉芽腫患者一覽表

圖1 1a～1c:局限斑塊型海分枝桿菌感染；1d～1j:沿淋巴管分布的皮膚結(jié)節(jié)型海分枝桿菌感染(1a、1b、1d～1j均為上肢皮損,1c為下肢皮損)

2.2 組織病理 全部患者均進行病理學(xué)檢查，均完善HE、PAS及抗酸染色，其中HE染色均表現(xiàn)為表皮鱗狀上皮樣增生，真皮及皮下灶性壞死(圖2a)、微膿腫形成(圖2b)，伴淋巴細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞及少許多核巨細(xì)胞構(gòu)成肉芽腫性炎，可見有纖維素性壞死的非干酪樣肉芽腫，無典型結(jié)核樣肉芽腫改變(圖2c～2f)，PAS及抗酸染色均為陰性。

圖2 2a:表皮鱗狀上皮樣增生，真皮及皮下灶性壞死(HE，×100)；2b;微膿腫形成(HE，×100)；2c、2d:可見有纖維素性壞死的非干酪樣肉芽腫，無典型結(jié)核樣肉芽腫改變(HE，×100)；2e、2f:淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞及少許多核巨細(xì)胞構(gòu)成亞急性肉芽腫性炎(HE，2e:×200;2f:×400)

2.3 菌種鑒定及發(fā)育 全部患者組織培養(yǎng)標(biāo)本均分離到海分枝桿菌，真菌及常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)均為陰性。原代菌株分離時間7～28天，平均(17.2±5.14)天。菌落均為深黃色、光滑或稍粗糙，熒光染色陽性，抗酸染色陽性(圖3a～3d)。將菌落純化至MiddleBrook 7H10瓊脂培養(yǎng)7天，MALDI-TOF鑒定均為海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)，置信區(qū)間大于99.9%。16S基因測序后經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對，全部菌株與海分枝桿菌相似度均大于99%。MAGA X建立最大似然比發(fā)育樹。9株菌均被鑒定為海分枝桿菌。

圖3 3a:組織培養(yǎng)3周，巧克力平板可見深黃色邊緣粗糙的菌落；3b:MiddleBrook 7H10瓊脂培養(yǎng)10天，可見深黃色光滑菌落；3c:熒光染色可見桿狀菌體，藍(lán)色熒光；3d:抗酸染色可見紫紅色桿菌；3e:基于16S基因，采用最大似然比模型行發(fā)育分析，選取M.arabiense為外群，臨床菌株與海分枝桿菌在100%支持率下聚集在一起

3 討論

海分枝桿菌對魚類等水生動植物及人類均可造成感染，部分研究將其認(rèn)定為人畜共患病，但不存在人際傳播的風(fēng)險。海分枝桿菌感染對某些專業(yè)人員可能是一種職業(yè)危害，但許多感染發(fā)生在在家中養(yǎng)魚愛好者身上，因此又名“養(yǎng)魚者手指綜合征”[2]。國人對魚類需求量較大，但魚類食品加工的廚師罹患風(fēng)險并沒有被正確認(rèn)知，正如我們研究中約半數(shù)感染者為廚師或后廚人員，這也應(yīng)當(dāng)被視為職業(yè)損害的一種。大部分的感染途徑為魚鰭或魚刺扎傷、接觸或更換水族箱水體均可能造成感染，有趣的是，近年來其他非海水來源的水體中也出現(xiàn)海分枝桿菌的分離記錄如煤礦污水等[3]。這也與我們所報道的病例相一致，其中1例患者為煤礦工人，井下工作創(chuàng)傷后接觸煤礦污水繼發(fā)海分枝桿菌感染。因此對海分枝桿菌的分布有待進一步研究。

相關(guān)研究指出約60%的海分枝桿菌的皮膚感染表現(xiàn)為原發(fā)創(chuàng)傷處孤立的結(jié)節(jié)、潰瘍、疣狀增生；25%的表現(xiàn)為類孢子絲菌病的沿淋巴管線狀分布的紅色至紫紅色炎性結(jié)節(jié)或膿丘疹，伴或不伴破潰[1]。無論局限型或淋巴管型皮損均需同孢子絲菌病及皮膚腫瘤相鑒別。因此，詳細(xì)的創(chuàng)傷史、接觸史、病理組織學(xué)檢查、組織培養(yǎng)對診斷都是不可或缺的[4]。海分枝桿菌最適生長溫度為30～32℃，37℃下并不生長，因此海分枝桿菌的感染多局限在皮膚，但也不乏深部感染的病例，多因局部類固醇激素注射有關(guān)[5]。全身播散感染罕見，僅在造血干細(xì)胞移植及抗腫瘤壞死因子治療患者中有報道，但因缺乏特異性癥狀，診斷也較為困難[6-8]。

海分枝桿菌感染常規(guī)的輔助檢查應(yīng)包括PPD及T-spot實驗。但海分枝桿菌與結(jié)核桿菌在發(fā)育學(xué)上具有相近的親緣關(guān)系，因此常出現(xiàn)交叉免疫反應(yīng)，故PPD實驗通常為陽性[2]，T-spot實驗也可表現(xiàn)為陽性[9，10]，這也與我們回顧的病例相一致；盡管無法與結(jié)核感染相鑒別，但區(qū)分其他種類感染十分重要，因此兩者均有進行的必要[11]。

在海分枝桿菌皮膚感染早期，組織病理檢查表現(xiàn)為非特異性的炎性浸潤。感染進一步發(fā)展，多表現(xiàn)為多核巨細(xì)胞肉芽腫，并可出現(xiàn)纖維素樣壞死，但無干酪樣壞死[12，13]。病理組織中抗酸染色陽性率較低[14]，但仍需抗酸及PAS染色，目的在于明確是否桿菌感染，與真菌感染相鑒別，為臨床上精準(zhǔn)的診斷提供證據(jù)。

分離得到海分枝桿菌對診斷具有決定性意義。必須提高病原菌分離意識，進行組織病理檢查的同時，應(yīng)進行組織分離培養(yǎng)。通常情況下，正確的培養(yǎng)取材陽性率約為70%，培養(yǎng)條件選擇十分重要，海分枝桿菌最適生長溫度為30～32℃，平均生長周期較長，因此合適的溫度及較長的培養(yǎng)時間十分必要，應(yīng)不少于4周。目前MALDI-TOF與16S基因測序為常見的菌株鑒定手段。MALDI-TOF中由于分枝桿菌之間較近的親緣關(guān)系，許多亞種之間難以鑒別，諸如海分枝桿菌與潰瘍分枝桿菌，但推薦該方法可作為原代菌株的快速鑒定[15]。16S基因在分枝桿菌進化中高度保守，因此其可以很好的用于不同菌種之間的鑒別，此外hsp65、gyrA、rpoB基因均具備較高的鑒定效率[16]。

海分枝桿菌的治療遵循以藥物治療為主，局部物理治療為輔的策略。在大多數(shù)研究中，海分枝桿菌已經(jīng)表現(xiàn)出對抗結(jié)核藥物異煙肼、乙胺丁醇和吡嗪酰胺的抗藥性。利福平和利福布丁較為敏感；米諾環(huán)素、多西環(huán)素、克拉霉素、利奈唑胺、司帕沙星、莫西沙星、亞胺培南、磺胺甲惡唑和阿米卡星具有中等活性，因此臨床用藥多應(yīng)從上述藥物中選擇[17-20]。一般推薦口服兩種敏感抗生素至癥狀消除后1～2個月，總療程平均為3～4個月[21]。對于早期較輕的病變，可單獨使用一種抗生素，如克拉霉素、多西環(huán)素等。對于較為復(fù)雜的患者，則需要使用利福平和乙胺丁醇聯(lián)合大環(huán)內(nèi)酯類或四環(huán)素進行治療[22]。本文中患者使用克拉霉素與異煙肼聯(lián)合，也顯示了良好的治療效果，是否此類患者主要因克拉霉素發(fā)揮了治療效果，未來可進一步臨床驗證。手術(shù)在皮膚感染中的使用有一定的爭議，尚未發(fā)現(xiàn)手術(shù)可使患者顯著獲益的證據(jù)[23]。光動力治療、電切術(shù)、X線治療、冷凍治療、局部高溫治療等治療也取得良好效果[24，25]。與此同時，當(dāng)機體存在此類感染時，建議停用TNF-α抑制劑或其他免疫抑制劑，警惕感染深部擴散。

皮膚原發(fā)海分枝桿菌感染作為常見的NTM感染形式，其臨床表現(xiàn)多樣，極易誤診。因此仔細(xì)追溯職業(yè)接觸及創(chuàng)傷史極為重要，組織病理學(xué)、PPD實驗、T-spot實驗有助于縮小診斷范圍，合適條件下的組織培養(yǎng)聯(lián)合MALD-TOF及16S基因測序可準(zhǔn)確鑒定菌株，提供診斷金標(biāo)準(zhǔn)。克拉霉素單獨或聯(lián)合利福平、乙胺丁醇的兩聯(lián)用藥方案具有較好的療效。光動力療法及局部物理治療也可作為輔助治療縮短療程。最后，高危人群的主動自我保護對減少感染的發(fā)生至關(guān)重要。