張 翔，王子杰，鄭 明，韓前廣，黃正楷，易小敏，陶 俊，韓志堅，譚若蕓，居小兵，顧 民

南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科，江蘇 南京 210029

人白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）配型和新型免疫抑制劑的出現(xiàn)極大降低了腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，但是慢性移植腎失功（chronic allograft dysfunction，CAD）仍然是影響移植物存活的主要并發(fā)癥之一，慢性移植腎間質(zhì)纖維化形成是CAD 的主要病理改變［1］。內(nèi)皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT），是內(nèi)皮細胞在各種外部刺激下丟失內(nèi)皮細胞的特征，轉(zhuǎn)變成肌成纖維細胞，分泌大量細胞外基質(zhì)，進而促進了病變組織的纖維化進程［2］。既往研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞是肌成纖維細胞的重要來源之一，且腎微血管EndMT 過程在慢性移植腎間質(zhì)纖維化形成及CAD 中發(fā)揮了重要作用［3］。

目前認為，巨噬細胞可在不同刺激條件下極化成兩種不同的巨噬細胞表型，一種稱為經(jīng)典活化M1型巨噬細胞，另一種稱為替代突進活化M2 型巨噬細胞［4］。研究表明巨噬細胞極化可能參與介導了慢性移植腎的損傷［5］。而另一項研究發(fā)現(xiàn)3 個M1 型巨噬細胞特異性基因（CXCL11、CCL19 和CD86）可預測移植腎損傷的預后［6］。此外，在大鼠腎移植慢性排斥模型中，巨噬細胞極化過程分泌的細胞因子白介素-6（interleukin-6，IL-6）、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）及誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）也被發(fā)現(xiàn)參與了CAD的發(fā)生，并導致了慢性移植腎損傷［7］。然而，巨噬細胞極化在EndMT及CAD中的作用尚不明確。因此，本研究擬結(jié)合生物信息學分析，在組織和細胞水平探討M1 型巨噬細胞極化在EndMT過程及CAD中發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 移植腎臟組織的獲取

所有移植腎功能正常的腎臟組織（對照組）來源于2019年1月—2020年1月于南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院行同種異體腎移植術(shù)且術(shù)后移植腎功能穩(wěn)定的20例移植供腎的穿刺標本；而20例CAD的移植腎組織（CAD 組）均來自于2019 年1 月—2020 年7 月于南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院隨訪的移植腎功能不全患者。

移植腎功能不全患者的納入標準：①血清肌酐緩慢升高，病程中無明顯急性排斥反應(yīng)癥狀，血清肌酐大于200 μmol/L；②移植腎功能不全且藥物干預治療無效；③病程中無明顯感染癥狀。

CAD移植腎的穿刺標本的獲取方式：CAD患者為行二次異體腎移植術(shù)而行失功移植腎切除捐獻的病理組織標本，或因為肌酐升高及移植腎病變而行CAD腎穿刺而獲取的標本。對照組和CAD患者的臨床資料見表1。腎臟標本使用多聚甲醛固定，包埋后切片行染色實驗。部分組織則以RNAkeeper（R501-01，南京諾唯贊公司）于-80 ℃保存。

表1 納入研究的患者的一般信息Table 1 Baseline characteristics of patients included in this study

腎功能正常移植腎患者及CAD 患者術(shù)前的群體反應(yīng)性抗體（panel reactive antibody，PRA）均為陰性。腎功能正常患者的移植腎組織及CAD 患者腎組織標本的收集均通過南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，本研究所遵循的方案為2016-SR-029，并且獲得了所有移植受者的書面知情同意。在研究中執(zhí)行的所有程序都符合國家研究委員會的道德標準，并符合1964年赫爾辛基宣言及其后來修訂的道德標準。

1.1.2 細胞與試劑

小鼠來源的巨噬細胞Raw264.7購自上海源之信生物技術(shù)有限公司；CD68抗體（ab125212）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體（ab210823）、CD31 抗體（ab24590）、α-SMA 抗體（ab124964）、Collagen Ⅰ抗體（ab260043）、VEcadherin 抗體（ab33168）、GADPH 抗體（ab9485）、Alexa Fluor?488 標記的驢抗小鼠二抗（ab150109）、Alexa Fluor?555 標記的驢抗兔二抗（ab150062）（Abcam 公司，美國）；Vimentin 抗體（10366-1-AP）、F4/80 抗體（28463-1-AP）、CD206 抗體（60143-1-Ig）（Proteintech公司，美國），CD206流式抗體（17-2061-80，Thermo Fisher Scentific 公司，美國），iNOS 流式抗體（130-116-421，Miltenyibiotec 公司，德國）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（00-4976-93，Thermo Fisher Scentific 公司，美國）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）（CM41，吳江近案蛋白質(zhì)科技有限公司）；引物由南京擎科生物科技有限公司設(shè)計合成。

1.2 方法

1.2.1 生信分析數(shù)據(jù)的獲取

本研究所使用的GSE21374 數(shù)據(jù)集從GEO（Gene Expression Omnibus）公共數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）獲得。包含了術(shù)后早期的穿刺移植腎標本的轉(zhuǎn)錄組信息，同時也包含了移植腎的存活時間與存活狀態(tài)。

1.2.2 免疫熒光染色

石蠟切片置于二甲苯中脫蠟，然后用無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇梯度復水后，將玻片置入濃度為0.01 mol/L、pH 6.0且已沸騰的檸檬酸鈉溶液中15 min，后緩慢降溫至室溫。接著加入3%H2O2，室溫孵育15 min后使用TBST 洗3次，每次5 min。洗完后使用免疫熒光封閉液封閉。封閉完后使用一抗（CD68 抗體稀釋1∶800，iNOS 抗體稀釋1∶1 000，CD206抗體稀釋1∶200）于4 ℃冰箱孵育過夜；TBST 洗3 次，每次5 min；接著使用Alexa Fluor?488 標記的驢抗小鼠二抗、Alexa Fluor?555 標記的驢抗兔二抗混合室溫孵育組織1 h；TBST 洗3次，每次5 min；使用DAPI 孵育組織15 min；TBST 洗3 次，每次5 min；接著使用抗熒光淬滅劑滴上組織，使用蓋玻片封片，在熒光顯微鏡下觀察。Alexa Fluor?488 標記蛋白在熒光鏡下為綠色，而Alexa Fluor?555標記蛋白在熒光鏡下為紅色。

1.2.3 HE染色與Masson染色

HE 染色玻片脫蠟復水方法同免疫熒光，將組織玻片置入蘇木素液中染色5 min，清水沖洗5 min；1%鹽酸乙醇酸化30 s，清水沖洗30 s；伊紅液3 min，清水沖洗5 min；75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇脫水，并置入二甲苯，最后用中性樹脂封片。Masson染色的玻片脫蠟、復水、蘇木素染色、酸化同HE 染色；接著用Masson 麗春紅酸性復紅液處理5～10 min；2%冰醋酸水溶液浸洗片刻；1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min 后直接用苯胺藍染5 min；0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻；脫水封片同HE染色。

1.2.4 M1、M2 型巨噬細胞的誘導極化及細胞聯(lián)合培養(yǎng)

使 用5 ng/mL LPS 和40 ng/mL IFN-γ 誘 導Raw264.7 細胞，作用時間為24 h，使細胞向M1 型巨噬細胞方向極化。通過PCR、細胞免疫熒光及流式細胞學驗證其極化效率。將2 mL極化的M1型巨噬細胞按1×105個/mL 置于0.4 μm 的Transwell 小室上層，而小鼠主動脈內(nèi)皮細胞則種植與小室下層，細胞接種密度為1×105個/孔，細胞共培養(yǎng)條件為DMEM+10%FBS。聯(lián)合培養(yǎng)72 h 后，提取下層內(nèi)皮細胞的總蛋白及RNA待用。

小鼠主動脈內(nèi)皮細胞則種植于小室下層，分別在0、24、48 h后向6孔板孔中加入種植了極化的M1型巨噬細胞的Transwell 小室，進而獲取M1 型巨噬細胞作用0、24、48、72 h的內(nèi)皮細胞。

選取RAW264.7 巨噬細胞系，使用40 ng/mL 白細胞介素（interleukin，IL）-4誘導巨噬細胞系Raw264.7，作用時間為24 h，使細胞向M2型巨噬細胞方向極化。通過PCR、細胞免疫熒光及流式細胞學驗證其極化效率。共培養(yǎng)方法同前，以上實驗均重復3次。

1.2.5 聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）

所有樣本的RNA 通過HiScript Ⅱ合成cDNA，qRT-PCR 則是在AB7300 實時熒光定量儀（Applied Biosystems 公司，美國）上進行，同時利用AA341 實時定量PCR 試劑行PCR 反應(yīng)，GADPH 作為內(nèi)參照檢測mRNA 的表達量。每個樣本重復3 次，通過比較Ct值進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot，WB）

樣本使用RIPA 試劑裂解抽提出蛋白質(zhì)后，經(jīng)測定濃度，用10%SDS-PAGE分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。封閉后，將條帶置于一抗（Vimentin，1∶10 000；Collagen I，1∶1 000；GADPH，1∶5 000；VE-Cadherin，1∶1 000；α-SMA，1∶20 000）中，4 ℃孵育過夜；TBST沖洗3次，每次15 min；再分別于與二抗（HRP 標記的抗鼠IgG，1∶5 000；HRP 標記的抗兔IgG，1∶5 000）孵育；PBST 沖洗3 次，每次15 min；化學發(fā)光系統(tǒng)（Bio-Rad 公司，美國）檢測信號，并使用Image Lab軟件進行分析。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均利用R 3.6.1進行數(shù)據(jù)分析，用Limma 包對公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行差異分析，使用Clusterprofiler 包分別基于GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫行基因富集分析。同時借助生物信息學軟件Cibersort（cibersortx.stanford.edu）對各個樣本的免疫細胞浸潤狀態(tài)進行擬合（擬合次數(shù)=100次）。利用Image J軟件進行免疫熒光強度及免疫組化陽性區(qū)域的計算。所有統(tǒng)計圖的繪制與統(tǒng)計均借助Graphpad 軟件（7.0.1）。使用Student’st方法比較兩組間差異，多組間計量資料比較使用方差分析，還用Tukey’s多重比較檢驗方法比較兩組之間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CAD 患者移植腎中存在顯著的單核巨噬細胞浸潤

首先，下載GSE21374 數(shù)據(jù)集，對其進行均一化處理，并對移植腎功能穩(wěn)定患者與CAD患者的轉(zhuǎn)錄組信息進行差異分析，發(fā)現(xiàn)存在大量的差異基因（圖1A）?；贕O 數(shù)據(jù)庫的通路富集分析結(jié)果提示，差異表達的基因主要富集于對LPS 和IFN-γ刺激產(chǎn)生的反應(yīng)、對病毒感染的反應(yīng)、體液免疫反應(yīng)、細胞外結(jié)構(gòu)的重建等過程（圖1B、C）；而基于KEGG 數(shù)據(jù)庫的通路富集分析表明，差異表達基因主要富集于免疫排斥及移植物抗宿主疾病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、1 型糖尿病等過程（圖1D、E）。使用Cibersort 軟件對各個樣本的免疫細胞成分構(gòu)成進行擬合，繪制了移植腎的免疫細胞構(gòu)成的柱狀圖（圖1F），并通過小提琴圖發(fā)現(xiàn)CAD 組的患者移植腎中存在顯著的單核細胞和巨噬細胞浸潤（P＜0.05，圖1G）。

圖1 基于GEO數(shù)據(jù)庫的CAD組與移植腎功能正常組移植腎基因表達譜的生物信息學分析Figure 1 The bioinformatic analysis of mRNAs expression profile of the CAD allograft and normal function allograft based on the GEO database

接著在本中心的CAD 組患者移植腎組織中進行驗證。HE染色顯示CAD組患者移植腎中出現(xiàn)顯著的腎小球硬化、腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化（圖2A）；Masson 染色提示移植腎間質(zhì)出現(xiàn)大量膠原纖維蛋白沉積（圖2B、C）。組織免疫熒光實驗也發(fā)現(xiàn)CD68（+）iNOS（+）的M1 型巨噬細胞于CAD 組腎組織中浸潤明顯增加（P＜0.05，圖2D、E）。此外，CAD組中巨噬細胞的特異性指標CD68 mRNA 的表達量也顯著高于對照組，而CAD 組中M1 型巨噬細胞的特異性指標iNOS mRNA 表達量也顯著高于對照組（圖2F）。上述結(jié)果提示，非特異性免疫應(yīng)答參與了CAD 的發(fā)生過程，且M1 型巨噬細胞可能在CAD 發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。

圖2 CAD患者移植腎組織中M1型巨噬細胞極化的檢測Figure 2 Detection of M1 macrophages in the allograft tissue of CAD patients

2.2 體外誘導Raw264.7細胞向M1、M2巨噬細胞誘導分化

使用5 ng/mL LPS、40 ng/mL IFN-γ誘導巨噬細胞系Raw264.7，作用24 h 使它向M1 型巨噬細胞極化。使用40 ng/mL IL-4誘導巨噬細胞系Raw264.7，作用24 h使它向M2型巨噬細胞極化。細胞免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)刺激24 h 后M1 型Raw264.7 均為F4/80（+）iNOS（+）細胞，而M2 型Raw264.7 均為F4/80（+）CD206（+）細胞（圖3A、B）。接著使用流式細胞學的方法，用iNOS與CD206標記Raw264.7，發(fā)現(xiàn)刺激24 h后Raw264.7 向M1 極化的陽性率為93.3%，M2 極化的陽性率為83.0%（圖3C～E）。PCR檢測發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細胞的標志物（CD86、iNOS）在向M1 極化的Raw264.7 中表達增高，M2 型巨噬細胞的標志物（ARG1、CD206）在向M2 極化的Raw264.7 中表達增高（圖3F）。

圖3 體外誘導Raw264.7細胞向M1、M2巨噬細胞誘導分化的鑒定結(jié)果Figure 3 The identification of M1 and M2 polarized raw264.7 in vitro

2.3 M1型巨噬細胞極化誘導內(nèi)皮細胞的EndMT

體外誘導巨噬細胞向M1型極化，并將M1型巨噬細胞與內(nèi)皮細胞聯(lián)合培養(yǎng)。結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時間的延長，內(nèi)皮細胞的形態(tài)由鋪路石樣變成梭形（圖4A），而細胞免疫熒光結(jié)果提示共培養(yǎng)后內(nèi)皮細胞CD31表達量減少，而α-SMA的表達量增加，提示內(nèi)皮細胞發(fā)生了EndMT 過程（圖4B）。PCR 結(jié)果表明，下層內(nèi)皮細胞CD31 mRNA 的表達量隨時間顯著減少，而肌成纖維細胞的標志物（α-SMA、Fibronectin、Vimentin、FSP1、Collagen Ⅰ）mRNA隨時間表達增加（P＜0.05，圖4C）；WB結(jié)果表明，內(nèi)皮細胞的標志物VE-cadherin蛋白的表達顯著減少，而肌成纖維細胞的指標（α-SMA、Vimentin、Collagen Ⅰ）表達增加（P＜0.05，圖4D、E）。由上可見，M1 型巨噬細胞極化可誘導內(nèi)皮細胞發(fā)生EndMT過程。

2.4 M1 型巨噬細胞能誘導內(nèi)皮細胞的EndMT 而M2型巨噬細胞不能誘導內(nèi)皮細胞的EndMT

隨著培養(yǎng)時間的延長，和M1 型巨噬細胞共培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞呈梭形，而和M2 型巨噬細胞共培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞仍然保持為鋪路石樣（圖4A）。細胞免疫熒光結(jié)果亦提示共培養(yǎng)后，和M2 型巨噬細胞共培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞α-SMA 的表達量未見增加，內(nèi)皮細胞并未發(fā)生EndMT 過程（圖4B），M2 型巨噬細胞極化不能誘導內(nèi)皮細胞發(fā)生EndMT 過程。結(jié)合既往研究結(jié)果，即腎微血管EndMT 過程顯著促進了CAD 的發(fā)生，推測M1 型巨噬細胞極化可能通過誘導內(nèi)皮細胞發(fā)生EndMT 過程而促進CAD 的發(fā)生。

圖4 細胞共培養(yǎng)模型實驗觀察M1型與M2巨噬細胞極化對內(nèi)皮細胞EndMT過程的影響Figure 4 The effects of M1 and M2 macrophage on the EndMT of endothelial cells through cells co-culture model

3 討論

本研究在GEO 公共數(shù)據(jù)庫及本中心的移植腎標本中均發(fā)現(xiàn)了巨噬細胞在CAD 患者移植腎組織中顯著浸潤；而體外實驗發(fā)現(xiàn)，M1 型巨噬細胞極化能顯著誘導內(nèi)皮細胞發(fā)生EndMT 過程，而M2 型巨噬細胞卻不能誘導內(nèi)皮細胞發(fā)生EndMT 過程。結(jié)合本中心既往研究成果［3］，認為M1型巨噬細胞極化顯著浸潤于CAD移植腎組織，并可能通過誘導腎微血管EndMT過程進而促進CAD的發(fā)生。

內(nèi)皮細胞一直被認為是肌成纖維細胞的重要細胞來源之一，而EndMT被認為是上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變的一個特殊類型［8］。研究表明內(nèi)皮細胞來源的肌成纖維細胞在參與腎纖維化形成的肌成纖維細胞中占比約35%［9］。而本中心既往研究發(fā)現(xiàn)在慢性移植腎纖維化形成及CAD 過程中腎微血管EndMT 過程被顯著激活，且組織生長因子-β1 參與誘導了這一過程［3，10］。同時也發(fā)現(xiàn)有大量的信號在慢性腎纖維化中發(fā)揮了重要作用，如Wnt/β-catenin信號通路、磷酸酶2A信號通路、自噬等［11-13］。既往研究都聚焦于細胞因子和信號通路導致EndMT 的這一現(xiàn)象，較少有誘導EndMT 信號因子來源的研究，同時也缺乏移植腎局部免疫微環(huán)境對EndMT 影響的相關(guān)性研究。

實體器官或組織的局部免疫微環(huán)境會導致疾病的發(fā)生與發(fā)展［14］。移植腎中同樣存在局部免疫微環(huán)境，腎移植患者存在特異性免疫和非特異性免疫。已有研究發(fā)現(xiàn)，移植腎定植巨噬細胞的活化和移植腎的存活有關(guān)［15］；而也有研究表明骨髓來源的巨噬細胞定植于移植腎中能夠轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞，導致慢性移植腎失功的發(fā)生［16］。既往已經(jīng)有大量研究表明，極化的巨噬細胞在慢性移植腎失功與損傷中的作用，比如M1 型巨噬細胞的特征基因與分泌因子能夠?qū)е乱浦材I的慢性損傷，與患者的長期預后相關(guān)［6］。但是既往研究均局限于細胞極化狀態(tài)對移植腎纖維化及預后的影響，并沒有闡明極化后的巨噬細胞是通過何種途徑或者機制導致了移植腎間質(zhì)的纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細胞能夠明顯誘導內(nèi)皮細胞發(fā)生EndMT過程，這也部分解釋了巨噬細胞極化介導移植腎纖維化的過程，同時也提示了移植腎的免疫微環(huán)境改變在移植腎間質(zhì)纖維化中發(fā)揮的作用。

綜上所述，本研究在GEO公共數(shù)據(jù)庫及CAD移植腎組織中均發(fā)現(xiàn)了巨噬細胞明顯浸潤；而細胞實驗證實，M1型巨噬細胞極化可顯著促進內(nèi)皮細胞發(fā)生EndMT。結(jié)合既往研究成果認為，M1 型巨噬細胞極化可通過誘導內(nèi)皮細胞發(fā)生EndMT 而促進CAD的進展。