李 晴 朱建國

（1上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院/上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240；2上海睿智化學(xué)研究有限公司，上海 200120）

非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD）是全球最為常見的肝臟疾病之一[1]。隨著人們生活水平的提高以及生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)的改變，肥胖和糖尿病的發(fā)病率增加，NAFLD的發(fā)病率也呈上升趨勢，其中，有10%～20%的NAFLD可發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）。

NASH以肝臟脂肪浸潤、炎性反應(yīng)、肝細(xì)胞損害、壞死和纖維化為特征，有發(fā)展為肝纖維化、肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)[2]。然而，目前關(guān)于NASH的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，仍需對NASH的病理生理學(xué)和分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制等進(jìn)行深入研究，以利于臨床診斷和治療[3]。為此，醫(yī)學(xué)界建立了多個(gè)疾病動(dòng)物模型，以探明NASH的發(fā)病機(jī)制。從現(xiàn)有的研究成果來看，疾病動(dòng)物模型主要分為藥物中毒性脂肪肝動(dòng)物模型、特殊品系脂肪肝動(dòng)物模型、營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動(dòng)物模型、復(fù)合因素誘導(dǎo)的脂肪肝動(dòng)物模型[4]。其中，營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動(dòng)物模型，是給予高脂肪、高糖飼料喂養(yǎng)建立的脂肪肝模型，即在食物中添加過量脂類、膽固醇和糖類，從而使動(dòng)物無法完全吸收利用，使脂類堆積于肝而引起脂肪肝，進(jìn)一步出現(xiàn)肝炎和肝臟纖維化，該模型與人類的NASH相似，且病變有漸進(jìn)性過程，便于藥物干預(yù)，但該模型的缺點(diǎn)也較為明顯，如病變輕、造模時(shí)間較長（約需喂養(yǎng)半年以上）[5]。因此，尋求出更理想的模型對于該疾病的藥物篩選意義重大。在此背景下，筆者構(gòu)建了特殊飼料飲食誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型，并對該模型進(jìn)行了驗(yàn)證?，F(xiàn)將相關(guān)研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用SPF級C57BL/6J雄性小鼠，4～5周齡，180只，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于鋪有玉米芯墊料的聚碳酸酯籠盒內(nèi)，動(dòng)物房溫度控制在21～25 ℃，濕度控制在40%～70%，12 h光照、循環(huán)（7:00～19:00）。小鼠所用飼料為美國公司Research Diets生產(chǎn)的專業(yè)嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料，普通飼料型號為Rodent Diet#5001，特殊飼料型號為D09100301，飼料成分見表1和表2。實(shí)驗(yàn)前，小鼠在SPF級動(dòng)物房內(nèi)適應(yīng)1周，待獸醫(yī)評估動(dòng)物狀態(tài)，確定能夠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 特殊飼料組成成分

表2 特殊飼料營養(yǎng)成分 （單位：%）

1.2 儀器與試劑

主要試劑為：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、胰島素試劑盒，金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）、血清細(xì)胞角蛋白-18（CK-18）、透明質(zhì)酸（HA）、III型前膠原N端肽（PIIINP），均購自Merck Millipore。

主要儀器為：酶標(biāo)儀（Bio-Tek U.S.A）、COBAS600型全自動(dòng)生化分析儀（德國羅氏診斷公司）、超薄切片機(jī)（德國Leica CM3050S）、BMJIII型包埋機(jī)（常州市中威電子儀器廠）、Tissue-Tek VIP自動(dòng)脫水機(jī)（SAKURA INC）、光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng)（日本OLYMPUS）。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)小鼠體重，挑選160只體型健壯的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并將其隨機(jī)分為2組，分別為普通飼料組和特殊飼料組，并分別在第2、4、5、7.5個(gè)月每組各安樂死20只小鼠，進(jìn)行生物學(xué)指標(biāo)檢測。

1.4 檢測項(xiàng)目

非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的生物學(xué)指標(biāo)具體為：小鼠的體重，附睪脂肪和肝臟的重量；餐后血糖水平和胰島素水平；膽固醇和甘油三酯的水平；炎癥和肝功能的生物標(biāo)記物（細(xì)胞角質(zhì)素CK18、丙谷轉(zhuǎn)氨酶、天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶）；肝臟纖維化的生物標(biāo)記物（透明質(zhì)酸、金屬蛋白酶抑制劑-1、III型前膠原氨基端肽）。

非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型采用NAS進(jìn)行評分，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SEM）表示，采用單因素分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行誤差顯著性分析，使用Graph Pad Prism 5.0進(jìn)行圖形分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重、附睪脂肪和肝臟重量的變化

由圖1、圖2、圖3可知，從喂養(yǎng)的第2個(gè)月開始，特殊飼料組小鼠體重、附睪脂肪和肝臟重量顯著性高于普通飼料組。

圖1 實(shí)驗(yàn)期間小鼠體重的變化情況

圖2 實(shí)驗(yàn)期間小鼠附睪脂肪重量的變化情況

圖3 實(shí)驗(yàn)期間小鼠肝臟重量的變化情況

2.2 餐后血糖和胰島素水平的變化

由圖4、圖5可知，實(shí)驗(yàn)期間普通飼料組和特殊飼料組的小鼠餐后血糖無明顯區(qū)別，但從第2個(gè)月開始，特殊飼料組的小鼠餐后胰島素水平顯著高于普通飼料組。

圖4 實(shí)驗(yàn)期間小鼠餐后血糖水平的變化情況

圖5 實(shí)驗(yàn)期間小鼠胰島素水平的變化情況

2.3 血漿中膽固醇和甘油三酯的變化

由圖6、圖7可知，實(shí)驗(yàn)期間普通飼料組和特殊飼料組的小鼠血漿中甘油三酯水平無明顯區(qū)別，但從第2個(gè)月開始，特殊飼料組的小鼠血漿中膽固醇水平顯著高于普通飼料組。

圖6 實(shí)驗(yàn)期間小鼠血漿中膽固醇水平的變化情況

圖7 實(shí)驗(yàn)期間小鼠血漿中甘油三酯水平的變化情況

2.4 炎癥和肝功能生物標(biāo)記物的變化

由圖8、圖9、圖10可知，從第2個(gè)月開始，特殊飼料組的小鼠的細(xì)胞角蛋白含量顯著高于普通飼料組，且伴有時(shí)間依賴性。從第5個(gè)月開始，特殊飼料組的小鼠的丙谷轉(zhuǎn)氨酶含量和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量顯著高于普通飼料組，且也伴有時(shí)間依賴性。

圖8 實(shí)驗(yàn)期間小鼠的細(xì)胞角蛋白含量變化情況

圖9 實(shí)驗(yàn)期間小鼠的丙谷轉(zhuǎn)氨酶含量變化情況

圖10 實(shí)驗(yàn)期間小鼠的天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量變化情況

2.5 肝臟纖維化生物標(biāo)記物的變化

由圖11、圖12、圖13可知，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，特殊飼料組和普通飼料組的小鼠的透明質(zhì)酸含量無明顯區(qū)別。從第7.5個(gè)月開始，特殊飼料組的小鼠的金屬蛋白酶抑制含量和III型前膠原氨基端肽含量顯著高于普通飼料組。

圖11 實(shí)驗(yàn)期間小鼠的透明質(zhì)酸含量變化情況

圖12 實(shí)驗(yàn)期間小鼠的金屬蛋白酶抑制劑含量變化情況

圖13 實(shí)驗(yàn)期間小鼠的Ⅲ型前膠原氨基端肽含量變化情況

2.6 非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的NAS（NAFLD,Activity Score）評分

對小鼠模型進(jìn)行NAFLD活動(dòng)度評估，即NAS評分。對肝臟病理改變的3項(xiàng)[小葉內(nèi)炎癥（0～3）、脂肪變性（0～3）和肝細(xì)胞氣球樣變（0～3）]進(jìn)行半定量評估計(jì)分（0～12），具體結(jié)果見圖14、圖15、圖16。根據(jù)NAS總分值進(jìn)行診斷（標(biāo)準(zhǔn)為：NAS＜3，排除NASH；NAS≥4，可診斷為NASH）。由圖17可知，喂食5個(gè)月后，特殊飼料組的小鼠模型NAS評分＞4，可診斷為NASH。

圖14 實(shí)驗(yàn)期間小鼠的小葉內(nèi)炎癥評估情況

圖15 實(shí)驗(yàn)期間小鼠的脂肪變性評估情況

圖16 實(shí)驗(yàn)期間小鼠的肝細(xì)胞氣球樣變評估情況

圖17 小鼠模型的NAS評分

3 結(jié)果與討論

近年來，非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，已嚴(yán)重威脅到人體健康，且目前仍無有效的治療手段。因此，建立理想的非酒精性脂肪性肝炎動(dòng)物模型對于深入研究該疾病的發(fā)生、治療和預(yù)防均具有重要意義。

目前，人們對非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)病機(jī)制并不十分清楚（推測遺傳敏感性和多元代謝絮亂的相互作用可能是致病的重要因素，如氧應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷、胰島素抵抗、線粒體功能障礙、細(xì)胞因子、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞色素P450、脂聯(lián)素、遺傳因素和免疫反應(yīng)等）[6]，且目前還沒有一個(gè)能完整反映人類非酒精性脂肪性肝炎的組織病理學(xué)和病理生理學(xué)特征的動(dòng)物模型（現(xiàn)有的動(dòng)物模型很少或僅能部分重現(xiàn)人類非酒精性脂肪性肝炎的病理特征，很多重要的病變?nèi)缫葝u素抵抗和纖維化均沒有再現(xiàn)）[7]。因此，亟需一個(gè)理想的動(dòng)物模型來盡可能地模擬臨床病人的發(fā)病過程和致病機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的利用特殊飼料誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝炎雄性C57小鼠模型，在病因?qū)W、組織病理學(xué)和全身疾病等方面，均與人類非酒精性脂肪性肝炎極為相似。經(jīng)分析，構(gòu)建的小鼠模型具有穩(wěn)定性好、可重復(fù)性高、方法簡便、病死率低、病變有漸進(jìn)性過程、造模停止后逆轉(zhuǎn)緩慢、便于藥物干擾等特點(diǎn)，是研究非酒精性脂肪性肝炎發(fā)病機(jī)制和尋求臨床治療策略的一個(gè)很好的工具和平臺，適合多種藥物干預(yù)方式及相關(guān)疾病的機(jī)制研究，是理想的治療非酒精性脂肪性肝炎藥物的篩選模型。因此，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建小鼠模型可用于非酒精性脂肪性肝炎藥物藥效實(shí)驗(yàn)的篩選。