解瀟冬，劉曉瑩，汪文杰，白 潔，李大衛(wèi)，劉亞令

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；2.中國(guó)科學(xué)院武漢植物園獼猴桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430000）

獼猴桃屬多年生木本雌雄異株藤本植物，種類繁多，目前市場(chǎng)上綠肉和黃肉的獼猴桃居多。紅陽(yáng)獼猴桃是由四川省自然資源研究所和蒼溪縣農(nóng)業(yè)局共同選育出的優(yōu)良品種，果肉四周綠色，中間呈紅色，能夠刺激食欲，增加消費(fèi)者的購(gòu)買欲望，且肉質(zhì)細(xì)嫩，口感鮮香甜美，極具佐餐價(jià)值；還有易成花、坐果率高、早產(chǎn)豐產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[1]，使得紅陽(yáng)獼猴桃被大面積推廣。植物組織培養(yǎng)廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究，相比于在成熟植物體中進(jìn)行試驗(yàn)，組培技術(shù)的應(yīng)用能大大加快試驗(yàn)進(jìn)程，且沒(méi)有季節(jié)限制。目前，關(guān)于獼猴桃快繁體系的研究大多聚焦于激素的種類及配比，且趨于完善，但仍未發(fā)現(xiàn)光照等因素對(duì)該體系影響的報(bào)道。

大量研究表明，不同波長(zhǎng)的光對(duì)植物生長(zhǎng)有不同的影響。例如，紅光可以增加番茄株高，但抑制根系活力。藍(lán)光抑制番茄幼苗生長(zhǎng)，降低葉綠素含量，而含有紅藍(lán)光的混合光不僅能促進(jìn)番茄植株生長(zhǎng)，還能提高其光合效率[2]，在茄子中也得到了類似的結(jié)果[3]。有研究表明，混合光源對(duì)植物生長(zhǎng)的影響比單色光更顯著，例如，對(duì)萵苣生長(zhǎng)最有利的是紅光∶藍(lán)光為4∶1[4]；在混合光源（紅光∶藍(lán)光為2∶1，紅光∶藍(lán)光為1∶1）下，番茄幼苗根系表現(xiàn)出明顯的高效生長(zhǎng)[5]；紅光∶藍(lán)光為4∶1時(shí)，香蕉組培苗生長(zhǎng)最快[6]。

花青素是一種存在于植物中的天然色素，在食品染色和染料加工中有廣泛應(yīng)用；同時(shí)花青素還是一種強(qiáng)力的自由基清除劑，比維生素C、維生素E的抗氧化能力高數(shù)十倍，在神經(jīng)和心血管疾病防治方面效果顯著，在抗炎、抗癌保健方面也有很好的前景[7]。

近年來(lái)隨著研究的深入，花青素合成路徑逐步完善，該過(guò)程中許多相關(guān)酶基因的功能已經(jīng)被證實(shí)[7]。另外，還有大量研究表明，由MYB、bHLH、WD40等轉(zhuǎn)錄因子組成的復(fù)合體對(duì)花青素的合成也有重要作用。例如，擬南芥中AtMYB11、At－MYB12、AtMYB111、AtTTG1對(duì)花青素合成的早期調(diào)控基因有激活作用[8]；蘋(píng)果MdMYB1、MdMYB16、MdTTG1對(duì)蘋(píng)果著色有重要作用[9]；此外，百合（LlMYB19）、牡丹（PsMYB58）、柿子（DkMYB10）、葡萄（VvMYBA1和VvMYBA2）以及草莓（FaMYB10）相繼被報(bào)道在花青素的合成中發(fā)揮作用[10-14]。

紅陽(yáng)果肉中花青素的積累是果肉呈紅色的關(guān)鍵所在。已有研究表明，干擾AcMYB75和AcMYB123，紅陽(yáng)果肉顏色會(huì)變淺[15-16]；還有AcMYB10、AcMYB110也與紅陽(yáng)花青苷的積累相關(guān)[17-18]；此外，低溫可以使獼猴桃花青素合成相關(guān)基因AcMYB1-1和AcMYB5-1表達(dá)水平提高，進(jìn)而使花青素含量升高，而高溫則會(huì)抑制花青苷的合成[19-20]。李貴生[21]在紅陽(yáng)和金艷果實(shí)轉(zhuǎn)錄組比較分析中發(fā)現(xiàn)，MYB-A72只存在于紅陽(yáng)的轉(zhuǎn)錄本中，bHLH-B36和WD40-A126可能參與MYB-bHLH-WD40復(fù)合體的形成，靶向調(diào)控CHI2、FLS1和CYP98A1等花青素合成相關(guān)基因。盡管已有大量研究，較為清楚地闡述了花青素的合成機(jī)制，但在獼猴桃中關(guān)于光在花青素合成中的作用仍未解釋清楚。

本研究在前人的基礎(chǔ)上，以光質(zhì)為變量，紅陽(yáng)獼猴桃愈傷組織為研究對(duì)象，測(cè)量并分析6種光質(zhì)對(duì)紅陽(yáng)獼猴桃愈傷組織生長(zhǎng)速率、花青素含量以及相關(guān)基因表達(dá)量的影響，希望篩選出最適宜紅陽(yáng)獼猴桃離體培養(yǎng)的光照條件，并探明光照對(duì)花青素合成的影響規(guī)律，同時(shí)發(fā)掘花青素合成相關(guān)基因中的主要光響應(yīng)因子，為后期研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅陽(yáng)獼猴桃材料取自中國(guó)科學(xué)院武漢植物園國(guó)家獼猴桃種質(zhì)資源圃。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年8月在中國(guó)科學(xué)院武漢植物園獼猴桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。以紅陽(yáng)獼猴桃的新鮮葉片為外植體，經(jīng)過(guò)植物組織培養(yǎng)誘導(dǎo)生成愈傷組織，然后將愈傷組織重新切分并置于6種LED燈下，分別為：白光（波長(zhǎng)450～465 nm）、紅光（波長(zhǎng)650～700 nm）、藍(lán)光（波長(zhǎng)465～480 nm）、紅光∶藍(lán)光為1∶1、紅光∶藍(lán)光為1∶3和紅光∶藍(lán)光為3∶1（圖1），環(huán)境溫度設(shè)定在25℃下12 h光明/12 h黑暗。

培養(yǎng)基配方：4.42 g/L Murashige & Skoog with Vitamins＋0.9%瓊脂＋3%蔗糖＋1 mg/L TDZ（噻嗪隆）＋0.5 mg/L IAA（吲哚-3-乙酸）。

1.3 愈傷組織直徑和芽長(zhǎng)的測(cè)定

在6種LED光源下，測(cè)定紅陽(yáng)愈傷組織第15、25、40、100天的直徑和芽長(zhǎng)。愈傷組織的直徑用交叉法測(cè)量，每個(gè)樣本設(shè)40個(gè)重復(fù)。愈傷組織分化為芽后，測(cè)量愈傷組織的芽長(zhǎng)，并統(tǒng)計(jì)每皿分化出芽的數(shù)量，計(jì)算平均值。每組設(shè)15個(gè)重復(fù)。

式中，L100為100 d時(shí)愈傷組織的直徑，L15為15 d時(shí)愈傷組織的直徑。

1.4 愈傷組織及葉片花青素含量測(cè)定

分別取培養(yǎng)30、60、90 d的愈傷組織及其分化形成的葉片，液氮冷凍并研磨成粉末狀，將0.1 g粉末狀組織樣品在600 μL提取緩沖液（含1%HCl的甲醇）中于4℃溫育6 h。提取后，向每個(gè)樣品中加入200 μL水和200 μL氯仿，然后在4℃下以14 000×g離心5 min以沉淀植物材料，并使用酶標(biāo)儀在530、657 nm處讀取吸光度。

1.5 獼猴桃花青素合成相關(guān)基因表達(dá)分析

使用植物RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）分別提取不同光質(zhì)處理的愈傷組織及其分化形成的葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA并稀釋3倍備用，終濃度為147.46 ng/μL。以獼猴桃中Actin為內(nèi)參基因進(jìn)行qPCR分析，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)由Applied Biosystems公司提供，型號(hào)為7500FAST；反應(yīng)體系中qPCR Mix加5 μL，正反向引物各加0.2 μL，cDNA加1 μL，加無(wú)菌水補(bǔ)齊到10 μL；反應(yīng)步驟為：94℃預(yù)變性30 s，然后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)的94℃變性5 s、60℃退火30 s。所用引物如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析所用引物

1.6 愈傷組織花青素含量與相關(guān)基因表達(dá)量相關(guān)性分析

用Excle對(duì)花青素含量和相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，使用CORRE函數(shù)計(jì)算相關(guān)系數(shù)，并將結(jié)果用熱圖形式表現(xiàn)出來(lái)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光質(zhì)下愈傷組織及芽生長(zhǎng)效率分析

將愈傷組織置于6種LED光源下進(jìn)行培養(yǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，各種光質(zhì)下愈傷組織生物量都有所增加，其中，白光和紅光增加最為明顯，且紅光照射誘導(dǎo)產(chǎn)生芽的數(shù)量明顯多于其他光照，愈傷組織的顏色相對(duì)于其他光質(zhì)較淺（圖2）。由表2可知，15 d時(shí)，芽的數(shù)量呈紅光、紅光∶藍(lán)光為1∶3、藍(lán)光、紅光∶藍(lán)光為3∶1、白光、紅光∶藍(lán)光為1∶1依次遞減；培養(yǎng)至30 d時(shí)，各個(gè)光質(zhì)下芽數(shù)量的增量大致相同，但其愈傷組織的直徑及芽的長(zhǎng)度存在差異。

表2 不同光質(zhì)下平均每皿芽的數(shù)量比較 個(gè)

從圖3可以看出，不同光質(zhì)條件下愈傷組織的直徑和芽長(zhǎng)均隨愈傷組織發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在4個(gè)發(fā)育階段，紅光條件下愈傷組織直徑最大，紅光∶藍(lán)光為1∶3次之。在紅光照射下，各愈傷組織的芽長(zhǎng)最長(zhǎng)。通過(guò)計(jì)算愈傷組織直徑和芽長(zhǎng)的平均生長(zhǎng)速率，發(fā)現(xiàn)在6種光質(zhì)下，紅光和紅光∶藍(lán)光為3∶1下愈傷組織直徑的平均生長(zhǎng)速率最高。紅光處理下，芽的平均生長(zhǎng)率高于其他處理；紅光∶藍(lán)光為3∶1處理下，芽的平均生長(zhǎng)速率最低。白光和紅光∶藍(lán)光為1∶3下愈傷組織的直徑和芽生長(zhǎng)速率處于較高水平，而藍(lán)光和紅光∶藍(lán)光為1∶1下愈傷組織的生長(zhǎng)速率處于較低水平。通過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，不同光質(zhì)下不同芽長(zhǎng)度占比存在差異。在紅光下，芽長(zhǎng)占比最多為2～3 cm，占43%，說(shuō)明紅光促進(jìn)了芽的生長(zhǎng)。而在藍(lán)光和紅光∶藍(lán)光為1∶1條件下，紅陽(yáng)芽長(zhǎng)在0～1 cm占比最大，說(shuō)明這2種光都抑制了紅陽(yáng)芽的生長(zhǎng)。此外，100 d時(shí)紅光下0 cm處的芽長(zhǎng)占比最小，大于3 cm處的芽長(zhǎng)占比最大。由此可見(jiàn)，紅光下獼猴桃愈傷組織的生長(zhǎng)速度最快。

2.2 不同光質(zhì)下愈傷組織及葉片花青素含量分析

從圖4可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，白光和紅光下葉片花青素的含量逐漸增加，而藍(lán)光、紅光∶藍(lán)光為1∶1、紅光∶藍(lán)光為1∶3處理則呈現(xiàn)先降后升的規(guī)律，紅光∶藍(lán)光為3∶1處理在3個(gè)時(shí)期花青素含量沒(méi)有明顯差異。以白光作為對(duì)照，藍(lán)光下30、90 d、紅光∶藍(lán)光為1∶1下30 d、紅光∶藍(lán)光為1∶3下90 d花青素含量與對(duì)照組相當(dāng)，其他光照條件和其他時(shí)期花青素含量均明顯降低。愈傷組織中花青素含量較葉片中整體水平偏高；隨著時(shí)間的推移，白光和紅光∶藍(lán)光為3∶1下花青素含量小幅上升，紅光下花青素的含量在3個(gè)時(shí)期基本恒定；而藍(lán)光下，第1時(shí)期花青素含量遠(yuǎn)高于平均水平，隨著時(shí)間延長(zhǎng)大幅下降；紅光∶藍(lán)光為1∶3下花青素含量也呈緩慢下降的規(guī)律，紅光∶藍(lán)光為1∶3僅在60 d時(shí)，花青素含量躍升，而后又急劇降低。整體來(lái)看，相對(duì)于白光，紅光∶藍(lán)光為1∶3愈傷組織的花青素含量與之相當(dāng)，紅光和紅光∶藍(lán)光為3∶1有明顯降低，而藍(lán)光和紅光∶藍(lán)光為1∶1則明顯升高。綜上，紅光和紅光∶藍(lán)光為3∶1能抑制葉片及愈傷組織中的花青素合成，而藍(lán)光和紅光∶藍(lán)光為1∶1能促進(jìn)愈傷組織中花青素的合成，在葉片中效果不明顯。

2.3 不同光質(zhì)處理愈傷組織花青素合成相關(guān)基因表達(dá)量分析

定量結(jié)果表明（圖5），每個(gè)基因在不同光質(zhì)、不同時(shí)期的表達(dá)量都存在差異性。CHS主要在第1時(shí)期和第3時(shí)期發(fā)揮作用，第2時(shí)期表達(dá)水平整體偏低，白光、藍(lán)光以及紅光∶藍(lán)光為1∶1的組合中CHS在第1時(shí)期的表達(dá)水平都最高，而紅光∶藍(lán)光為1∶3和紅光∶藍(lán)光為3∶1處理，CHS在第3時(shí)期的表達(dá)水平明顯提高。F3′H在不同光質(zhì)、不同時(shí)期的差異不明顯，僅在90 d的藍(lán)光處理中表達(dá)量提升2倍。DFR、ANS為前期主要的功能基因，它們?cè)诘?時(shí)期的表達(dá)量明顯高于其他2個(gè)時(shí)期，這2個(gè)基因在紅光下表達(dá)水平極低，并且紅光∶藍(lán)光為1∶3組合中表達(dá)量也不高。反之，CHI、UFGT、CRY則為后期的主要功能基因，它們的表達(dá)量隨著時(shí)間呈現(xiàn)上升或小幅回落而后上升的趨勢(shì)，其中，藍(lán)光能促進(jìn)CHI、UFGT、CRY的表達(dá)，而紅光則有抑制作用，3種紅藍(lán)組合下CHI、UFGT、CRY的表達(dá)水平與白光一致。F3H在白光和紅光下表達(dá)水平都不高，相比較而言，紅光∶藍(lán)光為1∶1和紅光∶藍(lán)光為1∶3的表達(dá)量有小幅增加，藍(lán)光和紅光∶藍(lán)光為3∶1能明顯提升F3H的表達(dá)水平。作為紅陽(yáng)獼猴桃調(diào)控紅色果肉形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，MYB110基因的相對(duì)表達(dá)量整體偏低，主要在第2個(gè)時(shí)期發(fā)揮作用，不難看出，其在紅光及紅光∶藍(lán)光為3∶1的3個(gè)時(shí)期基因表達(dá)量保持一致，相對(duì)于白光而言，僅在紅光∶藍(lán)光為1∶3的組合中表達(dá)量有明顯提升，其余組合差異不明顯或略微減低。此外，葉片中各個(gè)基因的表達(dá)水平極低，不做分析。綜上，紅光抑制CHS、DFR、ANS、UFGT、CRY等基因的表達(dá)，進(jìn)而影響花青素的合成，而藍(lán)光則能提升CHS、F3H、DFR、CHI、UFGT、CRY、F3′H等基因的表達(dá)水平進(jìn)而促進(jìn)花青素的合成，混合光紅光∶藍(lán)光為1∶3提升CHS、F3H、F3′H、MYB110的表達(dá)量以及抑制DRF、ANS的表達(dá)水平從而影響花青素的含量；紅光∶藍(lán)光為3∶1則促進(jìn)CHS和F3H的表達(dá)，抑制UFGT的表達(dá)來(lái)調(diào)控花青素的合成。

2.4 不同光質(zhì)下愈傷組織花青素含量和相關(guān)基因相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果表明（圖6），不同基因的表達(dá)量與花青素含量的相關(guān)性在不同光質(zhì)下存在差異。CHS的表達(dá)量在白光下與花青素含量呈顯著負(fù)相關(guān)，而在藍(lán)光照射下呈顯著正相關(guān)，其他光處理沒(méi)有相關(guān)性或相關(guān)性不顯著；與之相反的是CHI和CRY，在白光下顯著正相關(guān)而藍(lán)光下顯著負(fù)相關(guān)，紅光∶藍(lán)光為1∶3下CRY的表達(dá)量與花青素負(fù)相關(guān)也達(dá)到顯著水平；DFR和ANS相關(guān)性分析結(jié)果類似，均為白光顯著負(fù)相關(guān)，藍(lán)光和紅光∶藍(lán)光為1∶3則高水平正相關(guān)，紅光為中等水平的負(fù)相關(guān)；紅光下的F3H和紅光∶藍(lán)光為1∶3下的F3′H的表達(dá)量與花青素含量呈顯著負(fù)相關(guān)，紅光∶藍(lán)光為1∶3下的F3H和紅光∶藍(lán)光為1∶1的F3′H相關(guān)性明顯，為正相關(guān)；UFGT的表達(dá)量在不同光質(zhì)下與花青素含量中度相關(guān)或不相關(guān)；MYB110的表達(dá)量與花青素含量?jī)H在紅光∶藍(lán)光為1∶1下顯著正相關(guān)，其余光質(zhì)下相關(guān)性水平不高。

3 結(jié)論與討論

本研究探討了6種LED光組合下紅陽(yáng)獼猴桃愈傷組織的生長(zhǎng)效率，紅色照射下紅陽(yáng)愈傷組織直徑和芽長(zhǎng)的平均生長(zhǎng)速率顯著高于其他光質(zhì)下。單色紅光促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)，愈傷組織顏色變淺，推測(cè)紅光照射改變了紅陽(yáng)愈傷組織的薄壁細(xì)胞，影響了其遺傳轉(zhuǎn)化活性。單色藍(lán)光對(duì)紅陽(yáng)愈傷組織的生長(zhǎng)速率和芽的伸長(zhǎng)有抑制作用。該結(jié)果與之前的報(bào)道相似，紅光顯著促進(jìn)了番茄幼苗株高的增加，但根系活力下降，強(qiáng)壯的幼苗指數(shù)下降；紅、藍(lán)光結(jié)合可增加番茄幼苗葉片光合色素含量，提高光合效率，促進(jìn)植株生長(zhǎng)[2]。不同比例的紅藍(lán)光還能提高黃瓜根系活力和葉面積，紅光∶藍(lán)光為4∶1最有利于生菜的生長(zhǎng)等[22]。此外，與單色光質(zhì)相比，紅光∶藍(lán)光為1∶1下愈傷組織的直徑和芽長(zhǎng)均受到抑制。紅光∶藍(lán)光為1∶3組合對(duì)愈傷組織直徑和芽長(zhǎng)有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，而紅光∶藍(lán)光為3∶1組合對(duì)愈傷組織直徑有顯著的促進(jìn)作用，對(duì)芽長(zhǎng)有顯著的抑制作用，這些結(jié)果與袁華玲等[23]研究的紅光∶藍(lán)光為3∶1的LED燈下對(duì)萼獼猴試管苗生長(zhǎng)最好的結(jié)果有些出入，推測(cè)可能是品種不同，倍性不同所導(dǎo)致，值得進(jìn)一步探究。

花青素含量與光有關(guān)已經(jīng)被證實(shí)，紫薯塊根花青素的含量在黑膜下更高[24]。余敏[25]對(duì)獼猴桃果子著色的研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)光能促進(jìn)中華獼猴桃花青素的積累。在本研究中，紅光和紅光∶藍(lán)光為3∶1對(duì)葉片和花青素的合成均有所抑制，藍(lán)光和紅光∶藍(lán)光為1∶1對(duì)愈傷組織花青素的合成有促進(jìn)作用。相較于余敏[25]的研究，本研究光源更為豐富，更清楚的解釋了不同光源對(duì)獼猴桃花青素含量的影響。前人研究表明，在草莓中，隨著光強(qiáng)的增加FaCHS、FaCHI、FaF3H、FaF3′H、FaDFR、FaANS、FaUFGT等基因表達(dá)水平下降[26]，本研究從不同光質(zhì)的處理中發(fā)現(xiàn)，紅光對(duì)CHS、DFR、ANS、UFGT、CRY等基因表達(dá)抑制而使花青素合成受阻，而藍(lán)光則對(duì)CHS、F3H、DFR、CHI、UFGT、CRY、F3′H等基因表達(dá)有促進(jìn)作用，花青素積累增加；紅光∶藍(lán)光為1∶3促進(jìn)CHS、F3H的表達(dá)，但抑制UFGT的表達(dá)，紅光∶藍(lán)光為3∶1促進(jìn)CHS和MYB110的表達(dá)，混合光對(duì)基因表達(dá)水平的影響同樣調(diào)控著花青素合成。張彬等[27]證實(shí)F3H、DFR、ANS、UFGT過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)羽衣甘藍(lán)花青素積累增加而顏色加深[27]，這與本研究的結(jié)果一致。此外，花青素含量與相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)性會(huì)隨著光質(zhì)的變化而改變。

綜上所述，本研究探究了不同光質(zhì)下紅陽(yáng)獼猴桃愈傷組織及芽的生長(zhǎng)速率，結(jié)果表明，紅光最適合紅陽(yáng)獼猴桃離體培養(yǎng)，藍(lán)光和紅光∶藍(lán)光為1∶1組合最適宜花青素的積累，同時(shí)本研究將不同光質(zhì)下花青素的含量與相關(guān)基因的表達(dá)量相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)不同基因?qū)Σ煌N類的光質(zhì)響應(yīng)程度不同。研究結(jié)果對(duì)獼猴桃快繁體系的優(yōu)化有一定的參考意義，同時(shí)為花青素在不同光質(zhì)下的調(diào)控研究提供了新的思路。