宋志博, 陳 濤, 王岱杰, 鄒登朗, 王 碩, 李洪梅, 劉亞蓉, 楊鳳梅, 海 平, 李玉林

(1.中國(guó)科學(xué)院 西北高原生物研究所, 青海 西寧 810001； 2.山東省分析測(cè)試中心, 山東 濟(jì)南 250014；3.青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院 中藥(藏藥)質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海省中藥(藏藥)現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青海 西寧 810016；4.青海師范大學(xué), 青海 西寧 810008； 5.中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

標(biāo)準(zhǔn)樣品是確認(rèn)產(chǎn)品質(zhì)量必不可少的標(biāo)準(zhǔn)參照物，具有良好的穩(wěn)定性、量值準(zhǔn)確性和高度均勻性.利用標(biāo)準(zhǔn)樣品作為標(biāo)準(zhǔn)參照物對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，可以保證測(cè)試結(jié)果具有可溯源性、準(zhǔn)確性與合法性.研制天然產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品，可以解決我國(guó)中醫(yī)藥、食品及化妝品等多行業(yè)領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)樣品極度缺乏，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量控制和檢測(cè)的問(wèn)題[1-3].

訶子是使君子科植物訶子TerminaliachebularRetz.及其變種絨毛訶子TerminaliachebularRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果實(shí)[4]，別名訶黎勒、訶黎，藏醫(yī)、蒙醫(yī)稱(chēng)“阿如拉”，原產(chǎn)于印度、緬甸，在我國(guó)云南、廣東、廣西、西藏等地均有分布[5].藏醫(yī)藥學(xué)認(rèn)為，訶子有全部藏藥具備的六味、八性、三化味和十七效，能治療很多種疾病，被廣泛用于治療哮喘、喉嚨痛、痢疾、血栓、痛風(fēng)和心臟病等[6-8].在部頒標(biāo)準(zhǔn)收錄的200個(gè)藏藥處方中，有118種含有訶子，由此訶子被稱(chēng)為“藏藥之王”[9].訶子已被收錄于2020版中國(guó)藥典，但缺乏含量測(cè)定項(xiàng)[4]，不利于其開(kāi)發(fā)利用.訶子主要含有鞣質(zhì)、酚類(lèi)、苯丙素類(lèi)、黃酮和三萜類(lèi)等多種化學(xué)成分，具有抗氧化、抗炎、抗病原微生物、抗腫瘤等作用[10-14].訶子酸是訶子中的特征性鞣質(zhì)類(lèi)成分，具有抗氧化、抗炎、降糖、保肝、強(qiáng)心、抗菌等作用，與訶子的藥效類(lèi)似[15-18]，可作為控制藥材質(zhì)量和成藥質(zhì)量的重要指標(biāo)，目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有這種化合物的標(biāo)準(zhǔn)樣品.為了滿足藥材及新藥研發(fā)、質(zhì)量控制、分析檢測(cè)工作的需求，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、溯源性，急需研制訶子酸國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品.

本研究參照標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則，以訶子的干燥成熟果實(shí)為原料，圍繞其中的特征性成分訶子酸，開(kāi)展了制備工藝、純度分析、結(jié)構(gòu)確證、均勻性、穩(wěn)定性和定值等研究，成功研制了訶子酸(GSB 11-3725-2020)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品.

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器

CTXNW-100B循環(huán)超聲提取儀(北京弘祥隆生物技術(shù)股份有限公司)；50 L大孔樹(shù)脂純化柱(浙江溫兄機(jī)械閥業(yè)有限公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)； Waters e2695高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世公司)；Agilent 6520 Q-TOF液相質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；SHIMADZU TG-40 DTA-40M 熱重分析儀(日本島津公司)；UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)； Vertex 70紅外光譜儀(德國(guó)布魯克公司)；LC-8A島津高效制備液相色譜儀(日本島津公司)；GLZ-1B冷凍干燥機(jī)(上海浦東冷凍干燥設(shè)備有限公司)；R 1020旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)； BRUKER 400 MHz核磁共振波譜儀(德國(guó)布魯克公司).

1.2 試劑

高效液相色譜(HPLC)及HPLC-質(zhì)譜(MS)使用甲醇(山東禹王公司)、乙腈(武漢弗頓控股有限公司)為色譜純，乙醇為分析純(成都市科隆化學(xué)品有限公司)，水為超純水.訶子果實(shí)購(gòu)自青海省西寧市藥材市場(chǎng)，由青海民族大學(xué)熱增才旦教授鑒定為使君子科植物訶子(TerminaliachebulaRetz.)的果實(shí).

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

取干燥訶子果實(shí)藥材10 kg，破碎機(jī)破碎，使用100 L 60%乙醇在室溫下超聲提取1次，提取1 h.將提取液濃縮至無(wú)醇味后冷凍干燥，得到訶子果實(shí)粗提取物.

取訶子果實(shí)粗提取物，分散于水中，緩慢倒入裝有D101大孔樹(shù)脂的層析柱中，先用30%乙醇洗脫至無(wú)色，再用50%乙醇洗脫，得到訶子酸洗脫組分，減壓濃縮后冷凍干燥得到富集組分.將富集組分注入到制備液相色譜中分離，得到訶子酸樣品.

采用HPLC進(jìn)行樣品分析，分析條件：Agilent 1260高效液相色譜儀；Agela Innoval C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-0.5%乙酸水溶液，0～30 min，45%-80%甲醇；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：274 nm.制備液相分離條件：LC-8A島津高效制備液相色譜儀；Reprosil 100 C18(250 mm×20 mm, 10 μm)制備色譜柱；檢測(cè)波長(zhǎng)274 nm；流速：18 mL/min；流動(dòng)相為甲醇-水，45%甲醇等度洗脫.

1.3.2 純度分析

(1) HPLC純度分析：Waters e2695高效液相色譜儀；Agela Innoval C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相：乙腈-0.5%乙酸水溶液(體積比為16∶84).流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；運(yùn)行時(shí)間：30 min；檢測(cè)波長(zhǎng)：200～400 nm.

(2) 液相(LC)-MS純度分析：Agilent 6520 Q-TOF液相質(zhì)譜儀；色譜柱：Agela Innoval C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.5%乙酸水溶液(體積比為16∶84)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；運(yùn)行時(shí)間：30 min.

MS條件：ESI電噴霧離子源，毛細(xì)管電壓4.0 kV，載氣：普氮，載氣流速：10 L/min，載氣溫度：300 ℃，掃描范圍為m/z為100～1 000.

1.3.3 水分和灰分含量測(cè)定

依據(jù)GB 606-2003《化學(xué)試劑 水分測(cè)定通用方法 卡爾·費(fèi)休法》，測(cè)定水分含量.

根據(jù)文獻(xiàn)[19]，采用熱重分析儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品灰分，稱(chēng)取10 mg樣品坩堝內(nèi)，以40 ℃/min的升溫速率從初溫25 ℃升至800 ℃，保持時(shí)間60 min.

1.3.4 結(jié)構(gòu)確證

通過(guò)紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn).

1.3.5 均勻性檢驗(yàn)

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品導(dǎo)則要求[20]，采用隨機(jī)順序重復(fù)測(cè)量的方法，隨機(jī)抽取10瓶分裝后的樣品，分別從每瓶中稱(chēng)取0.5 mg樣品3份，分別使用1.0 mL甲醇溶解，樣品按“1.3.2”項(xiàng)下HPLC純度分析方法進(jìn)行分析，采用方差分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[21].第一次：1-3-5-7-9-2-4-6-8-10；第二次：10-9-8-7-6-5-4-3-2-1；第三次：2-4-6-8-10-1-3-5-7-9.

瓶間方差使用式(1)計(jì)算：

(1)

式中，MS：均方差，n：樣品組數(shù)

瓶間標(biāo)準(zhǔn)偏差是該方差的平方根：

(2)

重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差可由MSwithin計(jì)算：

(3)

均勻性檢驗(yàn)的不確定度ubb=sbb.

1.3.6 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

(1)加速穩(wěn)定性檢驗(yàn)：從分裝后的樣品中隨機(jī)抽取15瓶樣品，3瓶一組分別放置于-20、2～8、20、40、60 ℃保存.本研究以6天為期，按“1.3.2”項(xiàng)下HPLC純度分析方法對(duì)制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，定值結(jié)果是測(cè)定2次的平均值.

(2)長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)：將樣品分裝后，于4 ℃冰箱中保存.本研究以?xún)赡隇槠冢础?.3.2”項(xiàng)下HPLC純度分析方法，對(duì)制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品每6個(gè)月取一次樣進(jìn)行檢驗(yàn)，定值結(jié)果是測(cè)定5次的平均值并使用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

斜率可以使用式(4)計(jì)算：

(4)

截距由式(5)計(jì)算：

(5)

直線上點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差可由式(6)計(jì)算：

(6)

與斜率相關(guān)的不確定度使用式(7)計(jì)算：

(7)

自由度為n-2和p為0.95(95%置信水平)的分布t因子等于3.182.

1.3.7 定值

按照標(biāo)準(zhǔn)品導(dǎo)則要求，由8家實(shí)驗(yàn)室(如表1所列)對(duì)訶子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行協(xié)作定值.隨機(jī)抽取24瓶樣品，每個(gè)定值實(shí)驗(yàn)室送3瓶，每瓶平行測(cè)定2次.定值實(shí)驗(yàn)室將樣品配成一定濃度的溶液，高效液相色譜儀測(cè)定，采用峰面積歸一化法進(jìn)行純度定值[22].

表1 參加定值的實(shí)驗(yàn)室及儀器型號(hào)

測(cè)定總平均值：

(8)

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差：

(9)

實(shí)驗(yàn)室間再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差：

(10)

實(shí)驗(yàn)室總平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

(11)

實(shí)驗(yàn)室總平均值的不確定度：

(12)

其中，N：測(cè)定總次數(shù)；p：定值實(shí)驗(yàn)室個(gè)數(shù)；n：每個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)量次數(shù).

1.3.8 不確定度評(píng)價(jià)

標(biāo)準(zhǔn)樣品的擴(kuò)展不確定度由4部分合成：分別是標(biāo)準(zhǔn)樣品定值分析引入的不確定度、均勻性引入的不確定度、短期穩(wěn)定性引入的不確定度和長(zhǎng)期穩(wěn)定性引入的不確定度[23].

總平均值不確定度：

(13)

均勻性不確定度：

ubb=sbb= (MSamong-MSwithin)/n

(14)

穩(wěn)定性不確定度：

(15)

擴(kuò)展不確定度：

(16)

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的制備與分離

樣品的HPLC分析色譜圖如圖1所示.

圖1 樣品HPLC分析色譜圖

在制備液相色譜條件的優(yōu)化時(shí)，流速與流動(dòng)相對(duì)分離效果影響明顯.通過(guò)式(17)計(jì)算[24]，得到制備液相色譜最優(yōu)流速為18 mL/min.

Fp=Fa× (Dp/Da)2

(17)

式中，F(xiàn)p為制備液相色譜的流速，F(xiàn)a為制備液相色譜的流速，Dp和Da分別為制備柱與分析柱的直徑.

經(jīng)計(jì)算，HPLC分析時(shí)，訶子酸出峰時(shí)甲醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%左右.因此，本研究在進(jìn)樣量為100 mg/5 mL、檢測(cè)波長(zhǎng)為274 nm的條件下，首先采用甲醇-0.5%乙酸水溶液(體積比為60∶40)為流動(dòng)相等度洗脫，未實(shí)現(xiàn)較好的基線分離.逐步降低甲醇濃度改善分離效果，當(dāng)甲醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于45%時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)較好的基線分離.但甲醇濃度越低，分離時(shí)間越長(zhǎng).為減少分離時(shí)間，本研究選用45%甲醇等度洗脫.分離色譜圖如圖2所示.

圖2 訶子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品制備的液相色譜分離圖

2.2 純度分析

2.2.1 HPLC純度分析

扣除溶劑色譜峰后，對(duì)樣品色譜峰進(jìn)行面積歸一法定量，經(jīng)積分，樣品純度在98%以上，三維色譜圖如圖3所示.

圖3 訶子酸標(biāo)準(zhǔn)品的三維色譜圖

2.2.2 LC-MS純度分析

正負(fù)離子模式下總離子流圖如圖4所示.從總離子流圖中未發(fā)現(xiàn)明顯雜質(zhì)峰存在.

圖4 訶子酸總離子流圖

2.3 水分和灰分含量測(cè)定

經(jīng)測(cè)定，訶子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品中水分含量為0.06%，灰分含量為0.07%.

2.4 結(jié)構(gòu)確證

UV λmax(EtOH)：274 nm；IR KBrνmax(cm-1)：3 351 (νO-H)，1 704 (νC=O)，1 609, 1 531, 1 447(νC= =C), 1 313, 1 165, 1 021 (νC-O-C)；正離子模式：實(shí)測(cè)值m/z為974.145 4 [M+NH4]+，計(jì)算值m/z為974.146 9 [M+NH4]+，推測(cè)分子式為C41H32O27；負(fù)離子模式：實(shí)測(cè)值m/z為955.105 4 [M-H]-，計(jì)算值m/z為955.105 8 [M-H]-，推測(cè)分子式為C41H32O27.

制備樣品的1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)如表2、3所列，與文獻(xiàn)[25] 比對(duì)，確定結(jié)構(gòu)為訶子酸.

表2 訶子酸的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)

表3 訶子酸的核磁共振碳譜數(shù)據(jù)

2.5 均勻性檢驗(yàn)

以F檢驗(yàn)，確定訶子酸樣品的均勻性數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，結(jié)果如表4、5所列.

由表4、5可見(jiàn)，以υ1(即組間)為9及υ2(即組內(nèi))為20，查F界值表，得訶子酸F0.05(9, 20)為2.39.由于：

表4 每瓶的平均值、方差和測(cè)量次數(shù)

F=MSamong/MSwithin=1.12

(18)

所以本樣品是均勻的.經(jīng)計(jì)算，均勻性不確定度為0.01%.

表5 均勻性研究的方差分析

2.6 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

2.6.1 加速穩(wěn)定性檢驗(yàn)

訶子酸在5個(gè)不同溫度下放置6天后測(cè)得樣品平均純度為98.17%，不確定度為0.05%，符合要求.對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液穩(wěn)定性進(jìn)行考察，選取乙腈和甲醇作為保存溶劑，在6天時(shí)間內(nèi)，兩種標(biāo)準(zhǔn)樣品在乙腈和甲醇保存中均具有較好的溶液穩(wěn)定性.

2.6.2 長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)

由表6數(shù)據(jù)可得，訶子酸每次測(cè)得的平均值在測(cè)定時(shí)間內(nèi)沒(méi)有隨時(shí)間的變化而明顯的升高或降低.

表6 長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)

經(jīng)計(jì)算，斜率變化的絕對(duì)值：

︱b1︱

(19)

即︱b1︱低于0.031 82，所以，斜率的變化不顯著，因而訶子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品在二年內(nèi)穩(wěn)定性良好.有效期t為24個(gè)月的長(zhǎng)期穩(wěn)定性的不確定度的貢獻(xiàn)為u=sb·t=0.24%.

2.7 定值分析

對(duì)測(cè)定結(jié)果，采用格拉布斯(Grubbs)檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)異常值，測(cè)定結(jié)果呈正態(tài)分布.從以上對(duì)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的考察，所得數(shù)據(jù)符合GB/T 15000.3—2008統(tǒng)計(jì)計(jì)算要求.

根據(jù)GB/T 15000.3—2008標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，定值結(jié)果由標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度組成.扣除水分和灰分后，依據(jù)高效液相色譜法峰面積歸一法所得測(cè)定結(jié)果，訶子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)值為：

(1-0.06%-0.07%)×98.21%=98.08%

(20)

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表7所列.

表7 訶子酸定值結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析表

2.8 擴(kuò)展不確定度的評(píng)定

經(jīng)計(jì)算，訶子酸置信度為95%的擴(kuò)展不確定度均為0.50%.

3 結(jié)論

本研究針對(duì)2020版藥典收錄的特色藏藥材缺乏含量測(cè)定項(xiàng)的現(xiàn)狀，圍繞其中的特征性成分訶子酸，并根據(jù)導(dǎo)則要求對(duì)訶子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行了均勻性、穩(wěn)定性和定值研究，得到了定值結(jié)果為98.08%，置信度為95%的不確定度值0.50%的訶子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，符合國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)樣品技術(shù)要求.建立了基于大孔樹(shù)脂和制備液相色譜技術(shù)的訶子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備工藝，可以為相關(guān)產(chǎn)品的分析檢測(cè)、質(zhì)量控制等工作提供物質(zhì)基礎(chǔ).