張璐,陳黎薇,劉曼,張潔,周璐,趙經(jīng)文,王邦茂
自身免疫性肝炎(AIH)是一種免疫介導(dǎo)的進(jìn)行性肝臟炎性疾病,近年來(lái)發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)[1-2]。AIH的發(fā)病機(jī)制尚不明確,多數(shù)患者需終身接受免疫抑制劑治療,不良反應(yīng)較大且部分患者不耐受,迫切需要開(kāi)發(fā)針對(duì)AIH的新型治療方法[3-5]。研究發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞參與AIH的發(fā)生和發(fā)展,AIH急性期患者肝組織的巨噬細(xì)胞活化水平和疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[6]。外泌體(Exos)是由活細(xì)胞分泌的直徑為40~160 nm的脂質(zhì)雙層膜囊泡,是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)[7],其內(nèi)容物如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等物質(zhì)由供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞后可導(dǎo)致靶細(xì)胞的功能變化[8-9]。Exos在肝臟炎性疾病及免疫疾病的發(fā)生和治療方面具有重要作用。如臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞Exos可改善白細(xì)胞介素(IL)-6引起的小鼠急性肝損傷[10],骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞Exos可改善小鼠的免疫性肝炎等[11-12]。而M2型巨噬細(xì)胞Exos在自身免疫性疾病中的治療作用尚待進(jìn)一步探索。刀豆蛋白A(Con A)誘導(dǎo)的小鼠AIH模型是模仿人類AIH的成熟模型,被廣泛應(yīng)用于評(píng)估AIH候選藥物的活性[13-14]。本研究采用此模型,探討M2 Exos對(duì)其保護(hù)作用,為AIH的治療提供新的思路。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料 RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)。無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)7周齡雌性C57BL/6J小鼠購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司,小鼠自由飲食并置于12 h/12 h明暗周期下飼養(yǎng),適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Con A、含DAPI抗熒光衰減封片劑、BCA蛋白試劑盒、FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司,胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素購(gòu)于美國(guó)Gibco公司,IL-4購(gòu)于美國(guó)PeproTech公司,PKH26紅色熒光細(xì)胞連接迷你試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma公司,DiR染料購(gòu)于美國(guó)ThermoFisher公司,丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)測(cè)定試劑盒(IFCC法)購(gòu)于深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司,蘇木素-伊紅(HE)染色液購(gòu)于湖北百奧斯生物科技有限公司,F(xiàn)astKing cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司,SYBR Green RT-qPCR Master Mix購(gòu)于美國(guó)ABI公司,精氨酸酶1(ARG1)、甘露糖受體C1(MRC1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-6的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)引物委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成,TSG101抗體和CD9抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司,抗鼠CD16/32抗體、PE抗鼠F4/80抗體、FITC抗鼠CD11b抗體均購(gòu)于美國(guó)Biolegend公司。HT7700透射電子顯微鏡購(gòu)于日本日立公司,NanoSight 300納米顆粒跟蹤分析儀購(gòu)于英國(guó)Malvern公司,Chemidoc XRS凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司,DM5000B熒光顯微鏡購(gòu)于德國(guó)Leica公司,IVIS Spectrum小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)PerkinElmer公司,BS-240VET動(dòng)物專用全自動(dòng)生化儀購(gòu)于深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司,熒光定量PCR儀購(gòu)于美國(guó)ABI公司,Optimal-100XP超速離心機(jī)、CytoFLEX流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)Beckman Coulter公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 M2型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo) RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。待細(xì)胞在T175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中匯合至30%~50%后,更換培養(yǎng)基為無(wú)外泌體血清培養(yǎng)基。用IL-4(20μg/L)刺激24 h后,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。培養(yǎng)過(guò)程始終在5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行。
1.2.2 M2 Exos的提取及鑒定 將收集的M2巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液依次進(jìn)行300×g 10 min,2 000×g 20 min,10 000×g 30 min梯度離心,收集上清液并用0.22μm濾器過(guò)濾。然后以110 000×g超速離心70 min,PBS清洗外泌體沉淀后,再以110 000×g超速離心70 min,獲得的外泌體保存于-80℃,所有的過(guò)程均在4℃下進(jìn)行。外泌體的蛋白濃度通過(guò)BCA蛋白試劑盒測(cè)定。取上述實(shí)驗(yàn)所得外泌體20μL,滴于碳支持膜銅網(wǎng)上吸附3 min,再滴加2%磷鎢酸負(fù)染色3 min,烤干后使用HT7700透射電子顯微鏡觀察并記錄圖像。將外泌體稀釋至1 mL,用NanoSight 300納米顆粒跟蹤分析儀對(duì)外泌體的粒徑分布及濃度進(jìn)行檢測(cè)。取外泌體蛋白樣品,通過(guò)SDSPAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用含5%脫脂牛奶的TBST封閉后,加入CD9、TSG101抗體于4℃孵育過(guò)夜。第2天加入對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1 h,使用Chemidoc XRS凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)采集。
1.2.3 M2 Exos的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 將RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于24孔板,每孔細(xì)胞接種數(shù)量約為5×104個(gè),接種3個(gè)孔。培養(yǎng)細(xì)胞12 h后,每孔加入20μg用PKH26熒光染料標(biāo)記的M2 Exos,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后,用4%多聚甲醛,0.5%的Triton X-100對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定和通透化,用FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽室溫孵育1 h,DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染30 s,封片后使用熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果,全程避光操作。
1.2.4 M2 Exos的體內(nèi)分布 將DiR染料與PBS稀釋的外泌體在室溫條件下孵育30 min,然后于4℃,110 000×g離心70 min以去除未結(jié)合染料。使用等量的DiR染料與PBS孵育30 min后,于相同條件下超速離心以驗(yàn)證超速離心對(duì)染料的去除效果。12只小鼠根據(jù)體質(zhì)量編號(hào)后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組,分別為PBS組、DiR-M0 Exos組、DiR-M2 Exos組和DiR染料對(duì)照組,每組3只。M0為未經(jīng)處理的RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌的外泌體。每組均給予尾靜脈注射Con A(15 mg/kg)。Con A注射完成1 h后,DiR-M0 Exos組、DiR-M2 Exos組和DiR染料對(duì)照組分別尾靜脈注射相應(yīng)100μg Exos或者等體積DiR染料,PBS組尾靜脈注射等體積PBS溶液。在Exos注射后的1、2、6、24 h,使用IVIS Spectrum小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)拍攝小鼠活體圖像(激發(fā)光745 nm,發(fā)射光800 nm)。注射后24 h將小鼠安樂(lè)死,收集肝、脾、心、肺、腎、腸組織進(jìn)行器官離體成像,觀察AIH小鼠體內(nèi)M0 Exos和M2 Exos隨時(shí)間變化在各器官分布情況。
1.2.5 動(dòng)物模型的建立及分組處理 20只小鼠根據(jù)體質(zhì)量編號(hào)后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組,分別為Control組、Con A組、M0 Exos組和M2 Exos組,每組5只。為排除巨噬細(xì)胞外泌體自身對(duì)AIH小鼠的影響,故設(shè)置M0 Exos組作為M2 Exos組的對(duì)照。除Control組外,其余小鼠尾靜脈注射Con A(15 mg/kg)以誘導(dǎo)AIH,Control組注射等體積PBS溶液。Con A注射完成1 h后,M0 Exos組、M2 Exos組小鼠分別經(jīng)尾靜脈注射200μg M0 Exos、200μg M2 Exos,Con A組和Control組尾靜脈注射等體積PBS溶液。
1.2.6 小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè) Con A誘導(dǎo)造模12 h后,收集小鼠眼眶靜脈血,室溫靜置2 h后,4℃下以3 000 r/min離心20 min,分離血清。使用動(dòng)物專用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)小鼠血清ALT和AST水平。
1.2.7 HE染色觀察小鼠肝組織病理變化 將小鼠肝組織置于4%多聚甲醛中固定48 h。然后依次進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明及石蠟包埋,將組織蠟塊制成4μm切片。將切片進(jìn)行脫蠟復(fù)水后,依次進(jìn)行蘇木素染色、1%鹽酸乙醇分化、0.2%氨水反藍(lán)和伊紅染色,經(jīng)無(wú)水乙醇脫水和二甲苯透明后用中性樹(shù)膠封片,顯微鏡下觀察小鼠肝臟的病理變化。
1.2.8 qPCR檢測(cè)ARG1、MRC1、TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá) 采用Trizol法分別提取RAW264.7巨噬細(xì)胞RNA(用于檢測(cè)ARG1、MRC1)和小鼠肝組織RNA(用于檢測(cè)TNF-α和IL-6)。用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后使用SYBR Green RT-qPCR Master Mix進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系:SYBR Green Mix 10μL,上下游引物(10μmol/L)各0.8μL,cDNA 2μL,超純水6.4μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性15 s,60℃退火10 s,40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量,引物序列見(jiàn)表1。
Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列
1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肝臟巨噬細(xì)胞的亞群變化 小鼠肝組織剪碎后置于Ⅳ型膠原酶中消化,用200目篩網(wǎng)將其過(guò)濾為單細(xì)胞懸液。然后用30%和70%的Percoll分離液分離出肝臟單個(gè)核細(xì)胞。向單個(gè)核細(xì)胞懸液中依次加入封閉用CD16/32抗體,PE抗鼠F4/80抗體、FITC抗鼠CD11b抗體并于4℃下避光孵育。使用CytoFLEX流式細(xì)胞儀采集數(shù)據(jù),并用CytExpert軟件進(jìn)行分析。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,2組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用Tukey-q法,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 M2型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)結(jié)果 使用IL-4刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h后,qPCR結(jié)果顯示,M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因ARG1和MRC1的mRNA表達(dá)水平明顯增高(均P<0.01),見(jiàn)表2。
Tab.2 Changes of ARG1 and MRC1 mRNA expression levels in RAW264.7 macrophages in the Control group and IL-4 group表2 Control組和IL-4組RAW264.7巨噬細(xì)胞ARG1和MRC1 mRNA表達(dá)水平變化 (n=3,x±s)
2.2 M2 Exos的鑒定 納米顆粒跟蹤分析結(jié)果顯示,M0 Exos和M2 Exos的粒徑分別集中于107.5 nm和123.3 nm,均處于40~160 nm范圍內(nèi),見(jiàn)圖1A、B。透射電子顯微鏡顯示,M0 Exos和M2 Exos均具有典型的類圓形雙層膜結(jié)構(gòu),見(jiàn)圖1C、D。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示,其均表達(dá)外泌體標(biāo)志性蛋白CD9和TSG101,見(jiàn)圖1E。
2.3 RAW264.7巨噬細(xì)胞可攝取M2 Exos 將PKH26標(biāo)記后的M2 Exos添加到RAW264.7巨噬細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,可見(jiàn)RAW264.7巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)明顯的紅色熒光,見(jiàn)圖2。表明M2 Exos可被RAW264.7巨噬細(xì)胞攝取。
2.4 M2 Exos在AIH小鼠體內(nèi)的治療性分布情況 體內(nèi)成像系統(tǒng)示,DiR染料對(duì)照組沒(méi)有熒光信號(hào)表達(dá),DiR-M0 Exos組和DiR-M2 Exos組的熒光信號(hào)在24 h內(nèi)持續(xù)累積,并且主要富集在肝臟,見(jiàn)圖3A。為更好地分辨各個(gè)器官的Exos熒光信號(hào),在Exos注射后24 h收集小鼠器官并進(jìn)行離體成像,結(jié)果顯示,M0 Exos和M2 Exos均在小鼠的肝臟和脾中富集,其他組織未見(jiàn)熒光信號(hào),見(jiàn)圖3B。
2.5 M2 Exos對(duì)AIH小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的影響 與Control組相比,Con A組血清ALT和AST水平明顯升高(P<0.05)。與Con A組相比,M2 Exos組血清ALT和AST顯著降低(P<0.05),M0 Exos組血清ALT和AST未見(jiàn)明顯變化,見(jiàn)表3。
Fig.1 Identification of Exos derived from M0 and M2 macrophages圖1 M0 Exos和M2 Exos的鑒定
Fig.2 Uptake of M2 Exos by RAW264.7 macrophages(immunofluorescence staining,scale=25μm)圖2 RAW264.7巨噬細(xì)胞對(duì)M2 Exos的攝?。庖邿晒馊旧壤?25μm)
2.6 M2 Exos對(duì)AIH小鼠肝組織病理學(xué)變化的影響 HE染色顯示,Control組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞形態(tài)完整,肝板和肝血竇圍繞中央靜脈呈放射狀分布。Con A組肝臟結(jié)構(gòu)紊亂,肝血竇內(nèi)大量紅細(xì)胞淤積,匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多,肝細(xì)胞不同程度壞死。M0 Exos組肝臟壞死區(qū)域較Con A組減少,但仍有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。M2 Exos組肝臟結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞壞死明顯減輕,見(jiàn)圖4。
2.7 M2 Exos對(duì)AIH小鼠肝臟炎性細(xì)胞因子的影響 與Control組相比,Con A組小鼠肝組織TNF-α和IL-6mRNA的表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05);與Con A組相比,M2 Exos組小鼠肝組織TNF-α和IL-6mRNA的表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05),M0 Exos組小鼠肝組織TNF-αmRNA水平下降(P<0.05),而IL-6mRNA未見(jiàn)明顯變化,見(jiàn)表4。
Fig.3 Distribution of Exos after intravenous administration in mice with autoimmune hepatitis圖3 經(jīng)尾靜脈注射的Exos在AIH小鼠體內(nèi)的分布情況
Tab.3 Comparison of serum levels of ALT and AST between the four groups of mice表3 4組小鼠血清ALT和AST水平比較(n=5,x±s)
Tab.4 Comparison of TNF-αand IL-6 mRNA expression levels in liver tissues between the 4 groups of mice表4 4組小鼠肝組織TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平比較(n=5,x±s)
2.8 M2 Exos可以降低肝臟單核來(lái)源巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn) 使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠肝臟中的F4/80hiCD11blow枯否細(xì)胞(KCs)和F4/80intCD11bhi單核細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞(MoMFs),見(jiàn)圖5。相較于Control組,Con A組肝臟單核細(xì)胞中MoMFs細(xì)胞比例顯著升高,KCs細(xì)胞比例明顯下降(均P<0.05)。相較于Con A組,M2 Exos組肝臟單核細(xì)胞中MoMFs細(xì)胞比例顯著下降,而KCs細(xì)胞比例明顯升高(均P<0.05),見(jiàn)表5。
Fig.4 Histological profiles of liver tissue in 4 groups of mice(HE staining,×400)圖4 4組小鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色,×400)
Fig.5 The liver macrophage subsets of four groups detected by flow cytometry圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)4組小鼠肝臟巨噬細(xì)胞亞群
Tab.5 Changes of liver macrophage subpopulations in four groups of mice表5 4組小鼠肝臟巨噬細(xì)胞亞群變化(n=5,x±s)
AIH可發(fā)生于任何年齡和種族的個(gè)體中,通常以女性為主,約25%的病例始于急性肝炎發(fā)作,可發(fā)展為肝硬化或肝癌。目前AIH具體病因尚不明確,但其主要涉及遺傳和環(huán)境的相互作用[15]。AIH的組織學(xué)特征為門靜脈周圍的單核細(xì)胞浸潤(rùn),包括淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞及漿細(xì)胞等。自身的免疫細(xì)胞對(duì)肝臟的異常攻擊是AIH的發(fā)病基礎(chǔ),并最終導(dǎo)致正常肝臟結(jié)構(gòu)的破壞。目前AIH的臨床治療需求是減少長(zhǎng)期使用免疫抑制劑的不良反應(yīng),同時(shí)為標(biāo)準(zhǔn)免疫抑制治療無(wú)反應(yīng)的患者提供可耐受的替代方案[16-17]。
肝臟巨噬細(xì)胞主要由組織駐留的KCs和募集的MoMFs組成,是肝臟中最大的先天性免疫細(xì)胞群[18]。活化的巨噬細(xì)胞常分為兩類,M1型巨噬細(xì)胞具有促炎功效,而M2型巨噬細(xì)胞可抑制炎癥反應(yīng)并促進(jìn)組織修復(fù)[19-20]。正常情況下,KCs主要通過(guò)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)來(lái)維持機(jī)體的免疫耐受狀態(tài)。當(dāng)肝臟免疫穩(wěn)態(tài)被破壞時(shí),KCs會(huì)極化為M1型來(lái)促進(jìn)炎癥反應(yīng),同時(shí)循環(huán)中的單核細(xì)胞會(huì)被募集進(jìn)入肝臟并參與肝臟疾病的進(jìn)展。KCs和MoMfs具有較高的可塑性,可迅速調(diào)整其表型以適應(yīng)肝臟免疫微環(huán)境的變化[21]。靶向肝臟巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是治療包括AIH在內(nèi)的多種肝臟疾病的一個(gè)新策略,核心在于調(diào)節(jié)KCs的活化,MoMfs的募集或兩者的極化[22]。
Exos通過(guò)將其攜帶內(nèi)容物遞送給受體細(xì)胞,起到調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的免疫和炎性狀態(tài)的作用[23-24]。目前發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞分泌的Exos具有治療潛力,如間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源Exos可對(duì)小鼠的心肌缺血、結(jié)腸炎、實(shí)驗(yàn)性免疫性肝炎等疾病起到保護(hù)作用[25]。M2 Exos作為具有抑制炎性反應(yīng)的M2型巨噬細(xì)胞釋放的外泌體,可以減輕小鼠結(jié)腸炎和小鼠大腦缺血再灌注損傷[26-28]。
既往研究表明,通過(guò)尾靜脈注射的方式,Exos優(yōu)先在小鼠的肝、肺、脾和腎臟中積累[29]。為了探究M2 Exos在AIH小鼠體內(nèi)的治療性分布情況,本研究首先分離并鑒定M2 Exos,并將DiR熒光染料標(biāo)記的M2 Exos通過(guò)尾靜脈注射。結(jié)果表明,M2 Exos能良好靶向小鼠的肝臟和脾,在24 h內(nèi)有蓄積效果,且其他組織對(duì)其沒(méi)有明顯的攝取作用,提示該種治療方式可用于靶向治療肝臟疾病。
為了觀察M2 Exos是否對(duì)小鼠的AIH有治療效果,筆者將小鼠隨機(jī)分為4組,相較于Con A造模組,經(jīng)M2 Exos治療后AIH小鼠的血清轉(zhuǎn)氨酶水平明顯下降,肝臟病理情況改善。在AIH患者中,肝組織常見(jiàn)促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)水平升高。為了探究M2 Exos對(duì)AIH小鼠的保護(hù)機(jī)制,筆者檢測(cè)了肝組織炎性因子IL-6和TNF-αmRNA水平以及肝臟巨噬細(xì)胞亞群的比例變化,結(jié)果顯示,M2 Exos治療可降低肝組織炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平,減少M(fèi)oMfs的浸潤(rùn);在體外,RAW264.7巨噬細(xì)胞可大量攝取M2 Exos。
綜上所述,M2 Exos可經(jīng)由靜脈循環(huán)進(jìn)入小鼠肝臟,被肝臟巨噬細(xì)胞攝取,通過(guò)降低肝臟炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生及減少對(duì)MoMfs的招募來(lái)改善小鼠AIH。本研究為AIH的治療提供了新的思路。