張璐，陳黎薇，劉曼，張潔，周璐，趙經(jīng)文，王邦茂

自身免疫性肝炎（AIH）是一種免疫介導(dǎo)的進(jìn)行性肝臟炎性疾病，近年來發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)［1-2］。AIH的發(fā)病機(jī)制尚不明確，多數(shù)患者需終身接受免疫抑制劑治療，不良反應(yīng)較大且部分患者不耐受，迫切需要開發(fā)針對(duì)AIH的新型治療方法［3-5］。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞參與AIH的發(fā)生和發(fā)展，AIH急性期患者肝組織的巨噬細(xì)胞活化水平和疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［6］。外泌體（Exos）是由活細(xì)胞分泌的直徑為40~160 nm的脂質(zhì)雙層膜囊泡，是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)［7］，其內(nèi)容物如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等物質(zhì)由供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞后可導(dǎo)致靶細(xì)胞的功能變化［8-9］。Exos在肝臟炎性疾病及免疫疾病的發(fā)生和治療方面具有重要作用。如臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞Exos可改善白細(xì)胞介素（IL）-6引起的小鼠急性肝損傷［10］，骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞Exos可改善小鼠的免疫性肝炎等［11-12］。而M2型巨噬細(xì)胞Exos在自身免疫性疾病中的治療作用尚待進(jìn)一步探索。刀豆蛋白A（Con A）誘導(dǎo)的小鼠AIH模型是模仿人類AIH的成熟模型，被廣泛應(yīng)用于評(píng)估AIH候選藥物的活性［13-14］。本研究采用此模型，探討M2 Exos對(duì)其保護(hù)作用，為AIH的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)。無特定病原體（SPF）級(jí)7周齡雌性C57BL/6J小鼠購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，小鼠自由飲食并置于12 h/12 h明暗周期下飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Con A、含DAPI抗熒光衰減封片劑、BCA蛋白試劑盒、FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，IL-4購(gòu)于美國(guó)PeproTech公司，PKH26紅色熒光細(xì)胞連接迷你試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，DiR染料購(gòu)于美國(guó)ThermoFisher公司，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）測(cè)定試劑盒（IFCC法）購(gòu)于深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，蘇木素-伊紅（HE）染色液購(gòu)于湖北百奧斯生物科技有限公司，F(xiàn)astKing cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司，SYBR Green RT-qPCR Master Mix購(gòu)于美國(guó)ABI公司，精氨酸酶1（ARG1）、甘露糖受體C1（MRC1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和IL-6的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）引物委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成，TSG101抗體和CD9抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，抗鼠CD16/32抗體、PE抗鼠F4/80抗體、FITC抗鼠CD11b抗體均購(gòu)于美國(guó)Biolegend公司。HT7700透射電子顯微鏡購(gòu)于日本日立公司，NanoSight 300納米顆粒跟蹤分析儀購(gòu)于英國(guó)Malvern公司，Chemidoc XRS凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司，DM5000B熒光顯微鏡購(gòu)于德國(guó)Leica公司，IVIS Spectrum小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)PerkinElmer公司，BS-240VET動(dòng)物專用全自動(dòng)生化儀購(gòu)于深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，熒光定量PCR儀購(gòu)于美國(guó)ABI公司，Optimal-100XP超速離心機(jī)、CytoFLEX流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 M2型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo) RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。待細(xì)胞在T175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中匯合至30%~50%后，更換培養(yǎng)基為無外泌體血清培養(yǎng)基。用IL-4（20μg/L）刺激24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。培養(yǎng)過程始終在5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行。

1.2.2 M2 Exos的提取及鑒定 將收集的M2巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液依次進(jìn)行300×g 10 min，2 000×g 20 min，10 000×g 30 min梯度離心，收集上清液并用0.22μm濾器過濾。然后以110 000×g超速離心70 min，PBS清洗外泌體沉淀后，再以110 000×g超速離心70 min，獲得的外泌體保存于-80℃，所有的過程均在4℃下進(jìn)行。外泌體的蛋白濃度通過BCA蛋白試劑盒測(cè)定。取上述實(shí)驗(yàn)所得外泌體20μL，滴于碳支持膜銅網(wǎng)上吸附3 min，再滴加2%磷鎢酸負(fù)染色3 min，烤干后使用HT7700透射電子顯微鏡觀察并記錄圖像。將外泌體稀釋至1 mL，用NanoSight 300納米顆粒跟蹤分析儀對(duì)外泌體的粒徑分布及濃度進(jìn)行檢測(cè)。取外泌體蛋白樣品，通過SDSPAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉后，加入CD9、TSG101抗體于4℃孵育過夜。第2天加入對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1 h，使用Chemidoc XRS凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)采集。

1.2.3 M2 Exos的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 將RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于24孔板，每孔細(xì)胞接種數(shù)量約為5×104個(gè)，接種3個(gè)孔。培養(yǎng)細(xì)胞12 h后，每孔加入20μg用PKH26熒光染料標(biāo)記的M2 Exos，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，用4%多聚甲醛，0.5%的Triton X-100對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定和通透化，用FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽室溫孵育1 h，DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染30 s，封片后使用熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果，全程避光操作。

1.2.4 M2 Exos的體內(nèi)分布 將DiR染料與PBS稀釋的外泌體在室溫條件下孵育30 min，然后于4℃，110 000×g離心70 min以去除未結(jié)合染料。使用等量的DiR染料與PBS孵育30 min后，于相同條件下超速離心以驗(yàn)證超速離心對(duì)染料的去除效果。12只小鼠根據(jù)體質(zhì)量編號(hào)后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，分別為PBS組、DiR-M0 Exos組、DiR-M2 Exos組和DiR染料對(duì)照組，每組3只。M0為未經(jīng)處理的RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌的外泌體。每組均給予尾靜脈注射Con A（15 mg/kg）。Con A注射完成1 h后，DiR-M0 Exos組、DiR-M2 Exos組和DiR染料對(duì)照組分別尾靜脈注射相應(yīng)100μg Exos或者等體積DiR染料，PBS組尾靜脈注射等體積PBS溶液。在Exos注射后的1、2、6、24 h，使用IVIS Spectrum小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)拍攝小鼠活體圖像（激發(fā)光745 nm，發(fā)射光800 nm）。注射后24 h將小鼠安樂死，收集肝、脾、心、肺、腎、腸組織進(jìn)行器官離體成像，觀察AIH小鼠體內(nèi)M0 Exos和M2 Exos隨時(shí)間變化在各器官分布情況。

1.2.5 動(dòng)物模型的建立及分組處理 20只小鼠根據(jù)體質(zhì)量編號(hào)后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，分別為Control組、Con A組、M0 Exos組和M2 Exos組，每組5只。為排除巨噬細(xì)胞外泌體自身對(duì)AIH小鼠的影響，故設(shè)置M0 Exos組作為M2 Exos組的對(duì)照。除Control組外，其余小鼠尾靜脈注射Con A（15 mg/kg）以誘導(dǎo)AIH，Control組注射等體積PBS溶液。Con A注射完成1 h后，M0 Exos組、M2 Exos組小鼠分別經(jīng)尾靜脈注射200μg M0 Exos、200μg M2 Exos，Con A組和Control組尾靜脈注射等體積PBS溶液。

1.2.6 小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè) Con A誘導(dǎo)造模12 h后，收集小鼠眼眶靜脈血，室溫靜置2 h后，4℃下以3 000 r/min離心20 min，分離血清。使用動(dòng)物專用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)小鼠血清ALT和AST水平。

1.2.7 HE染色觀察小鼠肝組織病理變化 將小鼠肝組織置于4%多聚甲醛中固定48 h。然后依次進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明及石蠟包埋，將組織蠟塊制成4μm切片。將切片進(jìn)行脫蠟復(fù)水后，依次進(jìn)行蘇木素染色、1%鹽酸乙醇分化、0.2%氨水反藍(lán)和伊紅染色，經(jīng)無水乙醇脫水和二甲苯透明后用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察小鼠肝臟的病理變化。

1.2.8 qPCR檢測(cè)ARG1、MRC1、TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá) 采用Trizol法分別提取RAW264.7巨噬細(xì)胞RNA（用于檢測(cè)ARG1、MRC1）和小鼠肝組織RNA（用于檢測(cè)TNF-α和IL-6）。用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用SYBR Green RT-qPCR Master Mix進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：SYBR Green Mix 10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.8μL，cDNA 2μL，超純水6.4μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火10 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肝臟巨噬細(xì)胞的亞群變化 小鼠肝組織剪碎后置于Ⅳ型膠原酶中消化，用200目篩網(wǎng)將其過濾為單細(xì)胞懸液。然后用30%和70%的Percoll分離液分離出肝臟單個(gè)核細(xì)胞。向單個(gè)核細(xì)胞懸液中依次加入封閉用CD16/32抗體，PE抗鼠F4/80抗體、FITC抗鼠CD11b抗體并于4℃下避光孵育。使用CytoFLEX流式細(xì)胞儀采集數(shù)據(jù)，并用CytExpert軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey-q法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 M2型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)結(jié)果 使用IL-4刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h后，qPCR結(jié)果顯示，M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因ARG1和MRC1的mRNA表達(dá)水平明顯增高（均P＜0.01），見表2。

Tab.2 Changes of ARG1 and MRC1 mRNA expression levels in RAW264.7 macrophages in the Control group and IL-4 group表2 Control組和IL-4組RAW264.7巨噬細(xì)胞ARG1和MRC1 mRNA表達(dá)水平變化 （n=3，x±s）

2.2 M2 Exos的鑒定 納米顆粒跟蹤分析結(jié)果顯示，M0 Exos和M2 Exos的粒徑分別集中于107.5 nm和123.3 nm，均處于40~160 nm范圍內(nèi)，見圖1A、B。透射電子顯微鏡顯示，M0 Exos和M2 Exos均具有典型的類圓形雙層膜結(jié)構(gòu)，見圖1C、D。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，其均表達(dá)外泌體標(biāo)志性蛋白CD9和TSG101，見圖1E。

2.3 RAW264.7巨噬細(xì)胞可攝取M2 Exos 將PKH26標(biāo)記后的M2 Exos添加到RAW264.7巨噬細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，可見RAW264.7巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)明顯的紅色熒光，見圖2。表明M2 Exos可被RAW264.7巨噬細(xì)胞攝取。

2.4 M2 Exos在AIH小鼠體內(nèi)的治療性分布情況 體內(nèi)成像系統(tǒng)示，DiR染料對(duì)照組沒有熒光信號(hào)表達(dá)，DiR-M0 Exos組和DiR-M2 Exos組的熒光信號(hào)在24 h內(nèi)持續(xù)累積，并且主要富集在肝臟，見圖3A。為更好地分辨各個(gè)器官的Exos熒光信號(hào)，在Exos注射后24 h收集小鼠器官并進(jìn)行離體成像，結(jié)果顯示，M0 Exos和M2 Exos均在小鼠的肝臟和脾中富集，其他組織未見熒光信號(hào)，見圖3B。

2.5 M2 Exos對(duì)AIH小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的影響 與Control組相比，Con A組血清ALT和AST水平明顯升高（P＜0.05）。與Con A組相比，M2 Exos組血清ALT和AST顯著降低（P＜0.05），M0 Exos組血清ALT和AST未見明顯變化，見表3。

Fig.1 Identification of Exos derived from M0 and M2 macrophages圖1 M0 Exos和M2 Exos的鑒定

Fig.2 Uptake of M2 Exos by RAW264.7 macrophages(immunofluorescence staining,scale=25μm)圖2 RAW264.7巨噬細(xì)胞對(duì)M2 Exos的攝?。庖邿晒馊旧壤?25μm）

2.6 M2 Exos對(duì)AIH小鼠肝組織病理學(xué)變化的影響 HE染色顯示，Control組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)完整，肝板和肝血竇圍繞中央靜脈呈放射狀分布。Con A組肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，肝血竇內(nèi)大量紅細(xì)胞淤積，匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多，肝細(xì)胞不同程度壞死。M0 Exos組肝臟壞死區(qū)域較Con A組減少，但仍有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。M2 Exos組肝臟結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞壞死明顯減輕，見圖4。

2.7 M2 Exos對(duì)AIH小鼠肝臟炎性細(xì)胞因子的影響 與Control組相比，Con A組小鼠肝組織TNF-α和IL-6mRNA的表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）；與Con A組相比，M2 Exos組小鼠肝組織TNF-α和IL-6mRNA的表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.05），M0 Exos組小鼠肝組織TNF-αmRNA水平下降（P＜0.05），而IL-6mRNA未見明顯變化，見表4。

Fig.3 Distribution of Exos after intravenous administration in mice with autoimmune hepatitis圖3 經(jīng)尾靜脈注射的Exos在AIH小鼠體內(nèi)的分布情況

Tab.3 Comparison of serum levels of ALT and AST between the four groups of mice表3 4組小鼠血清ALT和AST水平比較（n=5，x±s）

Tab.4 Comparison of TNF-αand IL-6 mRNA expression levels in liver tissues between the 4 groups of mice表4 4組小鼠肝組織TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平比較（n=5，x±s）

2.8 M2 Exos可以降低肝臟單核來源巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn) 使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠肝臟中的F4/80hiCD11blow枯否細(xì)胞（KCs）和F4/80intCD11bhi單核細(xì)胞來源巨噬細(xì)胞（MoMFs），見圖5。相較于Control組，Con A組肝臟單核細(xì)胞中MoMFs細(xì)胞比例顯著升高，KCs細(xì)胞比例明顯下降（均P＜0.05）。相較于Con A組，M2 Exos組肝臟單核細(xì)胞中MoMFs細(xì)胞比例顯著下降，而KCs細(xì)胞比例明顯升高（均P＜0.05），見表5。

Fig.4 Histological profiles of liver tissue in 4 groups of mice(HE staining,×400)圖4 4組小鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化（HE染色，×400）

Fig.5 The liver macrophage subsets of four groups detected by flow cytometry圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)4組小鼠肝臟巨噬細(xì)胞亞群

Tab.5 Changes of liver macrophage subpopulations in four groups of mice表5 4組小鼠肝臟巨噬細(xì)胞亞群變化（n=5，x±s）

3 討論

AIH可發(fā)生于任何年齡和種族的個(gè)體中，通常以女性為主，約25%的病例始于急性肝炎發(fā)作，可發(fā)展為肝硬化或肝癌。目前AIH具體病因尚不明確，但其主要涉及遺傳和環(huán)境的相互作用［15］。AIH的組織學(xué)特征為門靜脈周圍的單核細(xì)胞浸潤(rùn)，包括淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞及漿細(xì)胞等。自身的免疫細(xì)胞對(duì)肝臟的異常攻擊是AIH的發(fā)病基礎(chǔ)，并最終導(dǎo)致正常肝臟結(jié)構(gòu)的破壞。目前AIH的臨床治療需求是減少長(zhǎng)期使用免疫抑制劑的不良反應(yīng)，同時(shí)為標(biāo)準(zhǔn)免疫抑制治療無反應(yīng)的患者提供可耐受的替代方案［16-17］。

肝臟巨噬細(xì)胞主要由組織駐留的KCs和募集的MoMFs組成，是肝臟中最大的先天性免疫細(xì)胞群［18］。活化的巨噬細(xì)胞常分為兩類，M1型巨噬細(xì)胞具有促炎功效，而M2型巨噬細(xì)胞可抑制炎癥反應(yīng)并促進(jìn)組織修復(fù)［19-20］。正常情況下，KCs主要通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)來維持機(jī)體的免疫耐受狀態(tài)。當(dāng)肝臟免疫穩(wěn)態(tài)被破壞時(shí)，KCs會(huì)極化為M1型來促進(jìn)炎癥反應(yīng)，同時(shí)循環(huán)中的單核細(xì)胞會(huì)被募集進(jìn)入肝臟并參與肝臟疾病的進(jìn)展。KCs和MoMfs具有較高的可塑性，可迅速調(diào)整其表型以適應(yīng)肝臟免疫微環(huán)境的變化［21］。靶向肝臟巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是治療包括AIH在內(nèi)的多種肝臟疾病的一個(gè)新策略，核心在于調(diào)節(jié)KCs的活化，MoMfs的募集或兩者的極化［22］。

Exos通過將其攜帶內(nèi)容物遞送給受體細(xì)胞，起到調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的免疫和炎性狀態(tài)的作用［23-24］。目前發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞分泌的Exos具有治療潛力，如間充質(zhì)干細(xì)胞來源Exos可對(duì)小鼠的心肌缺血、結(jié)腸炎、實(shí)驗(yàn)性免疫性肝炎等疾病起到保護(hù)作用［25］。M2 Exos作為具有抑制炎性反應(yīng)的M2型巨噬細(xì)胞釋放的外泌體，可以減輕小鼠結(jié)腸炎和小鼠大腦缺血再灌注損傷［26-28］。

既往研究表明，通過尾靜脈注射的方式，Exos優(yōu)先在小鼠的肝、肺、脾和腎臟中積累［29］。為了探究M2 Exos在AIH小鼠體內(nèi)的治療性分布情況，本研究首先分離并鑒定M2 Exos，并將DiR熒光染料標(biāo)記的M2 Exos通過尾靜脈注射。結(jié)果表明，M2 Exos能良好靶向小鼠的肝臟和脾，在24 h內(nèi)有蓄積效果，且其他組織對(duì)其沒有明顯的攝取作用，提示該種治療方式可用于靶向治療肝臟疾病。

為了觀察M2 Exos是否對(duì)小鼠的AIH有治療效果，筆者將小鼠隨機(jī)分為4組，相較于Con A造模組，經(jīng)M2 Exos治療后AIH小鼠的血清轉(zhuǎn)氨酶水平明顯下降，肝臟病理情況改善。在AIH患者中，肝組織常見促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)水平升高。為了探究M2 Exos對(duì)AIH小鼠的保護(hù)機(jī)制，筆者檢測(cè)了肝組織炎性因子IL-6和TNF-αmRNA水平以及肝臟巨噬細(xì)胞亞群的比例變化，結(jié)果顯示，M2 Exos治療可降低肝組織炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平，減少M(fèi)oMfs的浸潤(rùn)；在體外，RAW264.7巨噬細(xì)胞可大量攝取M2 Exos。

綜上所述，M2 Exos可經(jīng)由靜脈循環(huán)進(jìn)入小鼠肝臟，被肝臟巨噬細(xì)胞攝取，通過降低肝臟炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生及減少對(duì)MoMfs的招募來改善小鼠AIH。本研究為AIH的治療提供了新的思路。