張璐，陳黎薇，劉曼，張潔，周璐，趙經文，王邦茂

自身免疫性肝炎（AIH）是一種免疫介導的進行性肝臟炎性疾病，近年來發(fā)病率在全球范圍內呈上升趨勢［1-2］。AIH的發(fā)病機制尚不明確，多數患者需終身接受免疫抑制劑治療，不良反應較大且部分患者不耐受，迫切需要開發(fā)針對AIH的新型治療方法［3-5］。研究發(fā)現，巨噬細胞參與AIH的發(fā)生和發(fā)展，AIH急性期患者肝組織的巨噬細胞活化水平和疾病嚴重程度呈正相關［6］。外泌體（Exos）是由活細胞分泌的直徑為40~160 nm的脂質雙層膜囊泡，是細胞間通訊的重要介質［7］，其內容物如蛋白質、脂質和核酸等物質由供體細胞轉移至受體細胞后可導致靶細胞的功能變化［8-9］。Exos在肝臟炎性疾病及免疫疾病的發(fā)生和治療方面具有重要作用。如臍帶來源間充質干細胞Exos可改善白細胞介素（IL）-6引起的小鼠急性肝損傷［10］，骨髓來源間充質干細胞Exos可改善小鼠的免疫性肝炎等［11-12］。而M2型巨噬細胞Exos在自身免疫性疾病中的治療作用尚待進一步探索。刀豆蛋白A（Con A）誘導的小鼠AIH模型是模仿人類AIH的成熟模型，被廣泛應用于評估AIH候選藥物的活性［13-14］。本研究采用此模型，探討M2 Exos對其保護作用，為AIH的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 RAW264.7小鼠巨噬細胞系購于中國科學院干細胞庫。無特定病原體（SPF）級7周齡雌性C57BL/6J小鼠購于北京華阜康生物科技股份有限公司，小鼠自由飲食并置于12 h/12 h明暗周期下飼養(yǎng)，適應環(huán)境1周后進行實驗。Con A、含DAPI抗熒光衰減封片劑、BCA蛋白試劑盒、FITC標記鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）均購于北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素購于美國Gibco公司，IL-4購于美國PeproTech公司，PKH26紅色熒光細胞連接迷你試劑盒購于美國Sigma公司，DiR染料購于美國ThermoFisher公司，丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）測定試劑盒（IFCC法）購于深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，蘇木素-伊紅（HE）染色液購于湖北百奧斯生物科技有限公司，FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，SYBR Green RT-qPCR Master Mix購于美國ABI公司，精氨酸酶1（ARG1）、甘露糖受體C1（MRC1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和IL-6的實時熒光定量PCR（qPCR）引物委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成，TSG101抗體和CD9抗體購于英國Abcam公司，抗鼠CD16/32抗體、PE抗鼠F4/80抗體、FITC抗鼠CD11b抗體均購于美國Biolegend公司。HT7700透射電子顯微鏡購于日本日立公司，NanoSight 300納米顆粒跟蹤分析儀購于英國Malvern公司，Chemidoc XRS凝膠成像系統購于美國Bio-Rad公司，DM5000B熒光顯微鏡購于德國Leica公司，IVIS Spectrum小動物活體成像系統購于美國PerkinElmer公司，BS-240VET動物專用全自動生化儀購于深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，熒光定量PCR儀購于美國ABI公司，Optimal-100XP超速離心機、CytoFLEX流式細胞儀購于美國Beckman Coulter公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 M2型巨噬細胞的誘導 RAW264.7巨噬細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。待細胞在T175細胞培養(yǎng)瓶中匯合至30%~50%后，更換培養(yǎng)基為無外泌體血清培養(yǎng)基。用IL-4（20μg/L）刺激24 h后，收集細胞培養(yǎng)上清液。培養(yǎng)過程始終在5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中進行。

1.2.2 M2 Exos的提取及鑒定 將收集的M2巨噬細胞培養(yǎng)上清液依次進行300×g 10 min，2 000×g 20 min，10 000×g 30 min梯度離心，收集上清液并用0.22μm濾器過濾。然后以110 000×g超速離心70 min，PBS清洗外泌體沉淀后，再以110 000×g超速離心70 min，獲得的外泌體保存于-80℃，所有的過程均在4℃下進行。外泌體的蛋白濃度通過BCA蛋白試劑盒測定。取上述實驗所得外泌體20μL，滴于碳支持膜銅網上吸附3 min，再滴加2%磷鎢酸負染色3 min，烤干后使用HT7700透射電子顯微鏡觀察并記錄圖像。將外泌體稀釋至1 mL，用NanoSight 300納米顆粒跟蹤分析儀對外泌體的粒徑分布及濃度進行檢測。取外泌體蛋白樣品，通過SDSPAGE分離并轉移至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉后，加入CD9、TSG101抗體于4℃孵育過夜。第2天加入對應二抗室溫孵育1 h，使用Chemidoc XRS凝膠成像系統進行信號采集。

1.2.3 M2 Exos的細胞攝取實驗 將RAW264.7巨噬細胞接種于24孔板，每孔細胞接種數量約為5×104個，接種3個孔。培養(yǎng)細胞12 h后，每孔加入20μg用PKH26熒光染料標記的M2 Exos，繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h后，用4%多聚甲醛，0.5%的Triton X-100對細胞進行固定和通透化，用FITC標記的鬼筆環(huán)肽室溫孵育1 h，DAPI對細胞核進行復染30 s，封片后使用熒光顯微鏡觀察染色結果，全程避光操作。

1.2.4 M2 Exos的體內分布 將DiR染料與PBS稀釋的外泌體在室溫條件下孵育30 min，然后于4℃，110 000×g離心70 min以去除未結合染料。使用等量的DiR染料與PBS孵育30 min后，于相同條件下超速離心以驗證超速離心對染料的去除效果。12只小鼠根據體質量編號后采用隨機數字表法分為4組，分別為PBS組、DiR-M0 Exos組、DiR-M2 Exos組和DiR染料對照組，每組3只。M0為未經處理的RAW264.7巨噬細胞分泌的外泌體。每組均給予尾靜脈注射Con A（15 mg/kg）。Con A注射完成1 h后，DiR-M0 Exos組、DiR-M2 Exos組和DiR染料對照組分別尾靜脈注射相應100μg Exos或者等體積DiR染料，PBS組尾靜脈注射等體積PBS溶液。在Exos注射后的1、2、6、24 h，使用IVIS Spectrum小動物活體成像系統拍攝小鼠活體圖像（激發(fā)光745 nm，發(fā)射光800 nm）。注射后24 h將小鼠安樂死，收集肝、脾、心、肺、腎、腸組織進行器官離體成像，觀察AIH小鼠體內M0 Exos和M2 Exos隨時間變化在各器官分布情況。

1.2.5 動物模型的建立及分組處理 20只小鼠根據體質量編號后采用隨機數字表法分為4組，分別為Control組、Con A組、M0 Exos組和M2 Exos組，每組5只。為排除巨噬細胞外泌體自身對AIH小鼠的影響，故設置M0 Exos組作為M2 Exos組的對照。除Control組外，其余小鼠尾靜脈注射Con A（15 mg/kg）以誘導AIH，Control組注射等體積PBS溶液。Con A注射完成1 h后，M0 Exos組、M2 Exos組小鼠分別經尾靜脈注射200μg M0 Exos、200μg M2 Exos，Con A組和Control組尾靜脈注射等體積PBS溶液。

1.2.6 小鼠血清轉氨酶檢測 Con A誘導造模12 h后，收集小鼠眼眶靜脈血，室溫靜置2 h后，4℃下以3 000 r/min離心20 min，分離血清。使用動物專用全自動生化儀檢測小鼠血清ALT和AST水平。

1.2.7 HE染色觀察小鼠肝組織病理變化 將小鼠肝組織置于4%多聚甲醛中固定48 h。然后依次進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明及石蠟包埋，將組織蠟塊制成4μm切片。將切片進行脫蠟復水后，依次進行蘇木素染色、1%鹽酸乙醇分化、0.2%氨水反藍和伊紅染色，經無水乙醇脫水和二甲苯透明后用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察小鼠肝臟的病理變化。

1.2.8 qPCR檢測ARG1、MRC1、TNF-α和IL-6的mRNA表達 采用Trizol法分別提取RAW264.7巨噬細胞RNA（用于檢測ARG1、MRC1）和小鼠肝組織RNA（用于檢測TNF-α和IL-6）。用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒將其逆轉錄為cDNA，然后使用SYBR Green RT-qPCR Master Mix進行qPCR反應。反應體系：SYBR Green Mix 10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.8μL，cDNA 2μL，超純水6.4μL。反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火10 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量，引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.9 流式細胞術檢測小鼠肝臟巨噬細胞的亞群變化 小鼠肝組織剪碎后置于Ⅳ型膠原酶中消化，用200目篩網將其過濾為單細胞懸液。然后用30%和70%的Percoll分離液分離出肝臟單個核細胞。向單個核細胞懸液中依次加入封閉用CD16/32抗體，PE抗鼠F4/80抗體、FITC抗鼠CD11b抗體并于4℃下避光孵育。使用CytoFLEX流式細胞儀采集數據，并用CytExpert軟件進行分析。

1.3 統計學方法 使用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，2組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey-q法，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 M2型巨噬細胞的誘導結果 使用IL-4刺激RAW264.7巨噬細胞24 h后，qPCR結果顯示，M2型巨噬細胞相關標志基因ARG1和MRC1的mRNA表達水平明顯增高（均P＜0.01），見表2。

Tab.2 Changes of ARG1 and MRC1 mRNA expression levels in RAW264.7 macrophages in the Control group and IL-4 group表2 Control組和IL-4組RAW264.7巨噬細胞ARG1和MRC1 mRNA表達水平變化 （n=3，x±s）

2.2 M2 Exos的鑒定 納米顆粒跟蹤分析結果顯示，M0 Exos和M2 Exos的粒徑分別集中于107.5 nm和123.3 nm，均處于40~160 nm范圍內，見圖1A、B。透射電子顯微鏡顯示，M0 Exos和M2 Exos均具有典型的類圓形雙層膜結構，見圖1C、D。蛋白質免疫印跡結果顯示，其均表達外泌體標志性蛋白CD9和TSG101，見圖1E。

2.3 RAW264.7巨噬細胞可攝取M2 Exos 將PKH26標記后的M2 Exos添加到RAW264.7巨噬細胞中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，可見RAW264.7巨噬細胞的細胞質內呈現明顯的紅色熒光，見圖2。表明M2 Exos可被RAW264.7巨噬細胞攝取。

2.4 M2 Exos在AIH小鼠體內的治療性分布情況 體內成像系統示，DiR染料對照組沒有熒光信號表達，DiR-M0 Exos組和DiR-M2 Exos組的熒光信號在24 h內持續(xù)累積，并且主要富集在肝臟，見圖3A。為更好地分辨各個器官的Exos熒光信號，在Exos注射后24 h收集小鼠器官并進行離體成像，結果顯示，M0 Exos和M2 Exos均在小鼠的肝臟和脾中富集，其他組織未見熒光信號，見圖3B。

2.5 M2 Exos對AIH小鼠血清轉氨酶的影響 與Control組相比，Con A組血清ALT和AST水平明顯升高（P＜0.05）。與Con A組相比，M2 Exos組血清ALT和AST顯著降低（P＜0.05），M0 Exos組血清ALT和AST未見明顯變化，見表3。

Fig.1 Identification of Exos derived from M0 and M2 macrophages圖1 M0 Exos和M2 Exos的鑒定

Fig.2 Uptake of M2 Exos by RAW264.7 macrophages(immunofluorescence staining,scale=25μm)圖2 RAW264.7巨噬細胞對M2 Exos的攝?。庖邿晒馊旧壤?25μm）

2.6 M2 Exos對AIH小鼠肝組織病理學變化的影響 HE染色顯示，Control組小鼠肝組織結構清晰，肝細胞形態(tài)完整，肝板和肝血竇圍繞中央靜脈呈放射狀分布。Con A組肝臟結構紊亂，肝血竇內大量紅細胞淤積，匯管區(qū)炎性細胞浸潤增多，肝細胞不同程度壞死。M0 Exos組肝臟壞死區(qū)域較Con A組減少，但仍有較多炎性細胞浸潤。M2 Exos組肝臟結構恢復正常，炎性細胞浸潤和肝細胞壞死明顯減輕，見圖4。

2.7 M2 Exos對AIH小鼠肝臟炎性細胞因子的影響 與Control組相比，Con A組小鼠肝組織TNF-α和IL-6mRNA的表達水平均明顯升高（P＜0.05）；與Con A組相比，M2 Exos組小鼠肝組織TNF-α和IL-6mRNA的表達水平均顯著下降（P＜0.05），M0 Exos組小鼠肝組織TNF-αmRNA水平下降（P＜0.05），而IL-6mRNA未見明顯變化，見表4。

Fig.3 Distribution of Exos after intravenous administration in mice with autoimmune hepatitis圖3 經尾靜脈注射的Exos在AIH小鼠體內的分布情況

Tab.3 Comparison of serum levels of ALT and AST between the four groups of mice表3 4組小鼠血清ALT和AST水平比較（n=5，x±s）

Tab.4 Comparison of TNF-αand IL-6 mRNA expression levels in liver tissues between the 4 groups of mice表4 4組小鼠肝組織TNF-α和IL-6 mRNA表達水平比較（n=5，x±s）

2.8 M2 Exos可以降低肝臟單核來源巨噬細胞的浸潤 使用流式細胞術檢測各組小鼠肝臟中的F4/80hiCD11blow枯否細胞（KCs）和F4/80intCD11bhi單核細胞來源巨噬細胞（MoMFs），見圖5。相較于Control組，Con A組肝臟單核細胞中MoMFs細胞比例顯著升高，KCs細胞比例明顯下降（均P＜0.05）。相較于Con A組，M2 Exos組肝臟單核細胞中MoMFs細胞比例顯著下降，而KCs細胞比例明顯升高（均P＜0.05），見表5。

Fig.4 Histological profiles of liver tissue in 4 groups of mice(HE staining,×400)圖4 4組小鼠肝組織形態(tài)學變化（HE染色，×400）

Fig.5 The liver macrophage subsets of four groups detected by flow cytometry圖5 流式細胞術檢測4組小鼠肝臟巨噬細胞亞群

Tab.5 Changes of liver macrophage subpopulations in four groups of mice表5 4組小鼠肝臟巨噬細胞亞群變化（n=5，x±s）

3 討論

AIH可發(fā)生于任何年齡和種族的個體中，通常以女性為主，約25%的病例始于急性肝炎發(fā)作，可發(fā)展為肝硬化或肝癌。目前AIH具體病因尚不明確，但其主要涉及遺傳和環(huán)境的相互作用［15］。AIH的組織學特征為門靜脈周圍的單核細胞浸潤，包括淋巴細胞、單核/巨噬細胞及漿細胞等。自身的免疫細胞對肝臟的異常攻擊是AIH的發(fā)病基礎，并最終導致正常肝臟結構的破壞。目前AIH的臨床治療需求是減少長期使用免疫抑制劑的不良反應，同時為標準免疫抑制治療無反應的患者提供可耐受的替代方案［16-17］。

肝臟巨噬細胞主要由組織駐留的KCs和募集的MoMFs組成，是肝臟中最大的先天性免疫細胞群［18］。活化的巨噬細胞常分為兩類，M1型巨噬細胞具有促炎功效，而M2型巨噬細胞可抑制炎癥反應并促進組織修復［19-20］。正常情況下，KCs主要通過誘導調節(jié)性T細胞的表達來維持機體的免疫耐受狀態(tài)。當肝臟免疫穩(wěn)態(tài)被破壞時，KCs會極化為M1型來促進炎癥反應，同時循環(huán)中的單核細胞會被募集進入肝臟并參與肝臟疾病的進展。KCs和MoMfs具有較高的可塑性，可迅速調整其表型以適應肝臟免疫微環(huán)境的變化［21］。靶向肝臟巨噬細胞被認為是治療包括AIH在內的多種肝臟疾病的一個新策略，核心在于調節(jié)KCs的活化，MoMfs的募集或兩者的極化［22］。

Exos通過將其攜帶內容物遞送給受體細胞，起到調節(jié)受體細胞的免疫和炎性狀態(tài)的作用［23-24］。目前發(fā)現多種細胞分泌的Exos具有治療潛力，如間充質干細胞來源Exos可對小鼠的心肌缺血、結腸炎、實驗性免疫性肝炎等疾病起到保護作用［25］。M2 Exos作為具有抑制炎性反應的M2型巨噬細胞釋放的外泌體，可以減輕小鼠結腸炎和小鼠大腦缺血再灌注損傷［26-28］。

既往研究表明，通過尾靜脈注射的方式，Exos優(yōu)先在小鼠的肝、肺、脾和腎臟中積累［29］。為了探究M2 Exos在AIH小鼠體內的治療性分布情況，本研究首先分離并鑒定M2 Exos，并將DiR熒光染料標記的M2 Exos通過尾靜脈注射。結果表明，M2 Exos能良好靶向小鼠的肝臟和脾，在24 h內有蓄積效果，且其他組織對其沒有明顯的攝取作用，提示該種治療方式可用于靶向治療肝臟疾病。

為了觀察M2 Exos是否對小鼠的AIH有治療效果，筆者將小鼠隨機分為4組，相較于Con A造模組，經M2 Exos治療后AIH小鼠的血清轉氨酶水平明顯下降，肝臟病理情況改善。在AIH患者中，肝組織常見促炎細胞因子TNF-α和IL-6的表達水平升高。為了探究M2 Exos對AIH小鼠的保護機制，筆者檢測了肝組織炎性因子IL-6和TNF-αmRNA水平以及肝臟巨噬細胞亞群的比例變化，結果顯示，M2 Exos治療可降低肝組織炎性細胞因子的表達水平，減少MoMfs的浸潤；在體外，RAW264.7巨噬細胞可大量攝取M2 Exos。

綜上所述，M2 Exos可經由靜脈循環(huán)進入小鼠肝臟，被肝臟巨噬細胞攝取，通過降低肝臟炎性細胞因子的產生及減少對MoMfs的招募來改善小鼠AIH。本研究為AIH的治療提供了新的思路。