周平，裴文迪，孫異凡，于洋，金丹

卵泡作為卵巢組織中重要的內(nèi)分泌和生殖相關(guān)結(jié)構(gòu)，由一層或多層顆粒細(xì)胞包圍的中央卵母細(xì)胞組成。顆粒細(xì)胞在卵泡生長發(fā)育過程中起到至關(guān)重要的調(diào)控作用，顆粒細(xì)胞代謝和凋亡速率變化與卵泡閉鎖、卵母細(xì)胞質(zhì)量下降、卵巢衰老以及多種生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病均具有密切關(guān)系［1-3］。氧化應(yīng)激是活性氧（ROS）過量產(chǎn)生和（或）抗氧化防御機(jī)制受損的結(jié)果，是顆粒細(xì)胞凋亡的主要原因［4］。在生理條件下，與年齡相關(guān)的ROS積累驅(qū)使顆粒細(xì)胞凋亡［5］。同時，細(xì)胞內(nèi)因素（如線粒體突變、營養(yǎng)剝奪和局部缺血）以及外部因素（包括吸煙、空氣污染、電磁輻射）產(chǎn)生的ROS積累會加速顆粒細(xì)胞凋亡，并導(dǎo)致多囊卵巢綜合征、卵巢功能不全等卵巢功能障礙［2，6］。因此，尋找合適的藥物修復(fù)顆粒細(xì)胞在氧化應(yīng)激過程中的損傷，改善其抗氧化應(yīng)激和凋亡的能力，具有重要的臨床意義。人參為多年生草本植物，具有較高的藥用價值。人參皂苷Rg3是從人參中分離得到的一種活性皂苷，具有廣泛的藥理作用，如抑制腫瘤、延緩衰老、治療心血管疾病以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，也是一種天然的抗氧化劑，能夠有效清除ROS的過量累積［7-9］。本研究采用H2O2誘導(dǎo)人卵巢顆粒細(xì)胞（KGN）建立氧化應(yīng)激損傷模型，通過細(xì)胞及分子生物學(xué)技術(shù)探討人參皂苷Rg3對KGN氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 KGN由北京大學(xué)第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心趙越老師課題組惠贈。

1.2 主要藥物、試劑及儀器 人參皂苷Rg3（純度>98%）購自成 都植標(biāo)化 純公司，DMEM/F12（11320033，Thermo Scientific），澳洲胎牛血清（10099141C，美國Gibco），BCA蛋白定量試劑盒（71285-3，北京中生華美），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（A020-2-2，南京建成），DCFH-DA熒光探針ROS檢測試劑盒（ab113851，Abcam），一抗抗體：β-Actin（66009-1-Ig，Proteintech，鼠抗人），細(xì)胞色素C（Cyt C，10993-1-AP，Proteintech，兔抗人），Bcl-2（ab182858，Abcam，兔抗人），BAX（ab32503，Abcam，兔抗人）。CCK-8試劑盒（C0038）、羊抗兔、兔抗鼠二抗購自北京碧云天公司。超敏ECL化學(xué)發(fā)光液（LD-8012，LDBIO）。細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國Eppendorf公司）；Anexxin V FITC細(xì)胞凋亡試劑盒（V13241）、多功能酶標(biāo)儀（Multiskan GO）購自美國Thermo Scientific公司，全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（Tanon-5200，上海天能公司）；電泳、轉(zhuǎn)膜裝置（美國Bio-Rad公司），流式細(xì)胞儀（FACSAriaⅢ，美國BD公司）。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 將KGN種植培養(yǎng)于96孔板中，參閱文獻(xiàn)［10］，采用25、50、100、200、300、400μmol/L的H2O2孵育細(xì)胞2 h，建立H2O2刺激的KGN損傷模型，并用2.5、5、10、20、40 mg/L的Rg3預(yù)孵育細(xì)胞24 h，H2O2處理細(xì)胞2 h以篩選人參皂苷Rg3的有效劑量，每孔加入CCK-8溶液（10μL/孔），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，采用酶標(biāo)儀于450 nm處檢測各孔吸光度（A450）值，檢測細(xì)胞活力，篩選有效的干預(yù)劑量作為后續(xù)試驗的Rg3藥物處理組條件。

1.4 細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測 細(xì)胞接種于6孔板，分為空白組、H2O2模型組、H2O2+Rg3組和Rg3組。其中，H2O2+Rg3組和Rg3組以人參皂苷Rg3預(yù)處理24 h，隨后H2O2模型組和H2O2+Rg3組加入H2O2作用2 h。空白組采用熒光探針DCFH-DA檢測胞內(nèi)ROS的含量，收集各組細(xì)胞，加入終濃度為20μmol/L的DCFH-DA并于37℃孵育30 min，以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡比例 將KGN種植培養(yǎng)于6孔板中，按照1.4的分組方法處理后收集各組細(xì)胞，以預(yù)冷的PBS洗滌2次，室溫下與100μL含PI（1 mg/L）的1×AnnexinⅤ工作溶液避光孵育15 min。隨后加入400μL 1×結(jié)合緩沖液并迅速渦旋后，立即使用FACSAriaⅢ流式細(xì)胞儀（Becton，Dickinson and Company，CA，USA）分析細(xì)胞。

1.6 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，加入哺乳動物蛋白抽提劑超聲提取1 min。裂解終止后，將細(xì)胞裂解液在4℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液用于蛋白表達(dá)分析。采用BCA蛋白定量法確定蛋白濃度，然后用10%或12%SDS-PAGE電泳分離。電泳完畢后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別加入相應(yīng)的一抗抗體Bcl-2（1∶2 000）、BAX（1∶5 000）、Cyt C（1∶4 000），β-actin（1∶5 000），4℃孵育過夜。TBST洗滌后，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h，TBST洗滌3次，每次15 min。顯影5 min，采用化學(xué)發(fā)光法曝光，并用Gel pro軟件進(jìn)行條帶定量分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用軟件GraphPad 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間多重比較采用SNKq檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2處理對細(xì)胞活力的影響 空白組及25、50、100、200、300、400μmol/L組細(xì)胞活力分別為1.00±0.03、0.92±0.05、0.75±0.07、0.68±0.08、0.47±0.02、0.48±0.02、0.48±0.01，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=5，F(xiàn)=111.528，P＜0.01），其中25μmol/L H2O2組與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，50、100、200、300、400μmol/L H2O2組較空白組顯著降低（P＜0.05）。200μmol/L H2O2可使細(xì)胞活力降低至空白組的50%左右，后續(xù)采用200μmol/L H2O2作用2 h作為造模條件。

2.2 人參皂苷Rg3預(yù)處理改善H2O2誘導(dǎo)的KGN細(xì)胞活力下降 空白組，H2O2模型組與H2O2+Rg3的2.5、5、10、20、40 mg/L組細(xì)胞活力分別為1.00±0.05、0.57±0.04、0.65±0.04、0.66±0.06、0.69±0.05、0.66±0.06、0.64±0.05，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=5，F(xiàn)=30.063，P＜0.01），與H2O2模型組比較，2.5、40 mg/L H2O2+Rg3組細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），5、10、20 mg/L H2O2+Rg3組與模型組比較細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05）。后續(xù)的實驗中使用10 mg/L人參皂苷Rg3進(jìn)行干預(yù)。

2.3 人參皂苷Rg3抑制H2O2誘導(dǎo)的KGN細(xì)胞氧化應(yīng)激 與空白組相比，H2O2模型組的細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯增加（P＜0.05），人參皂苷Rg3預(yù)處理明顯減少了ROS的產(chǎn)生（P＜0.05），人參皂苷Rg3單獨處理細(xì)胞對ROS水平無影響，見表1、圖1。

Tab.1 Comparison of ROS fluorescence intensity,apoptosis rate and expression of Bcl-2/BAX and Cyt C between the four groups of cells表1不同組間KGN細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度、凋亡率以及Bcl-2/BAX、Cyt C表達(dá)的比較（n=6，x±s）

2.4 人參皂苷Rg3抑制H2O2誘導(dǎo)的KGN細(xì)胞凋亡 與空白組相比，H2O2模型組細(xì)胞凋亡率顯著增高，人參皂苷Rg3可顯著降低H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率，見表1、圖2。

Fig.1 The effect of ginsenoside Rg3 on H2O2 induced ROS production in KGN cells圖1 人參皂苷Rg3對H2O2誘導(dǎo)KGN細(xì)胞ROS的影響

Fig.2 The effect of ginsenoside Rg3 on the apoptosis of KGN cells induced by H2O2圖2 人參皂苷Rg3對H2O2誘導(dǎo)KGN細(xì)胞凋亡的影響

2.5 人參皂苷Rg3調(diào)控線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白的表達(dá) 與空白組相比，H2O2模型組Cyt C表達(dá)升高，Bcl-2/BAX降低（P＜0.05），而H2O2+Rg3組可逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的Cyt C上調(diào)以及Bcl-2/BAX的降低（P＜0.05），見表1、圖3。

Fig.3 Expression levels of apoptosis-related proteins in the four groups圖3 各組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

3 討論

卵泡異常閉鎖可致卵巢功能障礙。顆粒細(xì)胞是卵泡的重要組成部分，顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡可能由衰老或病理刺激觸發(fā)，并在卵泡異常閉鎖以及多種卵巢功能損傷中起重要作用［4，11-12］。ROS是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要信號分子，但細(xì)胞內(nèi)過多的ROS累積會導(dǎo)致細(xì)胞損傷，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。卵泡顆粒細(xì)胞處于高水平代謝狀態(tài)，易導(dǎo)致代謝產(chǎn)物增加，進(jìn)而引發(fā)ROS的過度累積［13-14］。因此，保護(hù)顆粒細(xì)胞，避免顆粒細(xì)胞受氧化應(yīng)激損傷，對于改善卵巢功能障礙，以及卵巢早衰等生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病的治療具有重要意義。

H2O2作為一種較強(qiáng)的氧化劑，極易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，形成高活性的氧自由基或羥基自由基；H2O2產(chǎn)生的羥自由基可引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，促進(jìn)ROS產(chǎn)生；過量ROS能夠攻擊細(xì)胞生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并形成脂質(zhì)過氧化物，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)抗氧化物和氧化物生成之間的不平衡狀態(tài)，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷，同時導(dǎo)致線粒體膜電位下降，進(jìn)一步加劇ROS產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)［15-16］。本研究通過給予不同劑量的H2O2作用2 h，篩選出200μmol/L H2O2誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷模型，結(jié)果表明，H2O2作用2 h后，ROS水平顯著升高，說明顆粒細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)；同時，細(xì)胞存活率下降，凋亡率增加，說明氧化應(yīng)激抑制了細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)了KGN凋亡。上述指標(biāo)表明，H2O2誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型構(gòu)建成功。

人參皂苷Rg3是從人參中分離得到的，屬于人參二醇型最具代表性的單體成分之一，具有藥用價值。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，人參皂苷Rg3具有調(diào)節(jié)免疫、改善心血管功能及抗腫瘤等作用［17-18］。除上述功效外，Rg3還是一種天然的抗氧化劑，能夠清除過多的ROS。但是，人參皂苷Rg3能否有效抑制氧化應(yīng)激所致的卵巢顆粒細(xì)胞損傷，并對卵巢功能障礙發(fā)揮治療作用，尚未見報道。

線粒體作為活性氧產(chǎn)生的主要細(xì)胞器，其功能改變是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要途徑。Bcl-2蛋白家族，特別是抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白BAX的動態(tài)變化對線粒體凋亡途徑起關(guān)鍵調(diào)控作用［19-20］。線粒體凋亡是細(xì)胞凋亡的重要途徑之一，是一種由凋亡基因調(diào)控的高度保守的死亡過程。大多數(shù)凋亡信號作用于線粒體，通過改變線粒體膜的通透性，導(dǎo)致相關(guān)活性因子釋放至胞質(zhì)，進(jìn)而介導(dǎo)線粒體及細(xì)胞的凋亡；其中Bcl-2蛋白家族和caspase家族是關(guān)鍵的凋亡調(diào)控基因。Bcl-2/BAX降低可導(dǎo)致線粒體功能障礙，并引起細(xì)胞釋放大量的Cyt C；Cyt C不僅能夠在線粒體呼吸中起到傳遞電子的作用，同時作為一個凋亡的起始因子也扮演重要角色；其能夠與凋亡蛋白酶激活因子Ⅰ結(jié)合，激活下游細(xì)胞凋亡過程中關(guān)鍵的執(zhí)行分子caspase家族蛋白的表達(dá)，啟動型caspases先通過結(jié)合特異輔助因子而激活，發(fā)揮水解蛋白的作用，從而激活下游效應(yīng)型caspases，其可大范圍水解細(xì)胞內(nèi)的靶物質(zhì)，進(jìn)而降解細(xì)胞內(nèi)蛋白，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［21-23］。在本實驗中，人參皂苷Rg3（10 mg/L）預(yù)給藥24 h能夠明顯改善H2O2誘導(dǎo)的KGN細(xì)胞的凋亡，減少ROS的過度產(chǎn)生，提高細(xì)胞Bcl-2/BAX，減少Cyt C的釋放，表明其可通過改善線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，減緩氧化應(yīng)激損傷。

綜上，人參皂苷Rg3可以通過調(diào)節(jié)線粒體通路相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)，抑制H2O2誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡，提高其抗氧化應(yīng)激損傷能力。Rg3可能在抗氧化損傷及維持卵巢功能穩(wěn)定方面具有較好的應(yīng)用前景，本研究為進(jìn)一步開展體內(nèi)研究奠定了實驗基礎(chǔ)。