楊佳麗 馮澤中 牛建峰 顧文輝 何幫翔劉雪華 邵之卓 鄭陣兵 王旭雷 王廣策

(1. 中國科學院海洋研究所實驗海洋生物學重點實驗室 青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋生物學與生物技術功能實驗室 青島 266237; 3. 中國科學院大學 北京 100049; 4. 青島農(nóng)業(yè)大學海洋科學與工程學院 青島266109; 5. 中國科學院海洋大科學研究中心 青島 266071)

紫菜生長于潮間帶, 隨著每日的潮漲潮落, 周期性地經(jīng)歷干出、強光、溫度等脅迫, 在此過程中, 藻體細胞會產(chǎn)生一系列生理響應, 其中最重要的就是氧自由基(ROS)的產(chǎn)生與清除(Collénet al, 1999)。目前, 國際上已有大量關于潮間帶海藻ROS動態(tài)平衡與抗氧化酶活性變化的相關報道。Burritt等(2002)通過比較低潮位和高潮位生長的Stictosiphonia arbuscula藻體中過氧化氫和脂質過氧化物的含量,確定體內(nèi)抗氧化酶活性較高的藻體具有更強的逆境耐受能力。類似的, 研究人員也發(fā)現(xiàn)壇紫菜耐高溫性狀與藻體本底的抗氧化能力密切相關(楊銳等, 2007;張元等, 2011)。壇紫菜對高溫脅迫的生理響應總體上可概括為: 高溫脅迫導致ROS含量升高, 丙二醛(MDA)含量增加, 抗氧化機制和滲透調節(jié)系統(tǒng)在活性氧信號下被激活, ROS被清除, 最終體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和消除重新獲得平衡(張元等, 2011)。而且, 還原型NADPH氧化酶(NOX)介導的超氧陰離子生成被認為是導致生物體細胞內(nèi)ROS水平上調的第一反應(Lambet al, 1997; 郝福順等, 2005)。

在條斑紫菜(Pyropia yezoensis)抗氧化系統(tǒng)響應逆境脅迫方面, 亦有眾多研究成果發(fā)表。Heber等(2010)報道稱, 干出過程中條斑紫菜的光合活性持續(xù)降低且ROS逐漸累積。黃林斌等(2020)也發(fā)現(xiàn)22 °C高溫脅迫條件下培養(yǎng)的不同品系條斑紫菜,Fv/Fm均呈下降趨勢, 而且其下降幅度與脅迫的溫度、脅迫的時間呈正相關。侯和勝等(2008)研究了條斑紫菜絲狀體在高溫脅迫下的生理響應, 發(fā)現(xiàn)長時間的高溫脅迫使得藻體葉綠素含量下降, 藻體顏色變紅, 可溶性蛋白、丙二醛、可溶性糖含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,后期細胞內(nèi)容物滲露。Yu等(2020)發(fā)現(xiàn)多種抗氧化酶和抗氧化分子在條斑紫菜應對高鹽脅迫中發(fā)揮作用,且本底抗氧化庫庫容大小對清除活性氧的瞬時暴發(fā)具有重要意義。

我國是世界上最大的紫菜生產(chǎn)國, 但近年來, 隨著全球氣候變暖, 栽培海區(qū)同期溫度不斷升高。同時,由于紫菜栽培面積持續(xù)而無序的擴張, 導致海區(qū)栽培密度過大, 從而造成了潮流不暢, 水質貧瘠, 最終導致大面積爛菜現(xiàn)象時有發(fā)生。病爛發(fā)生時, 藻體梢部顏色變紅, 部分藻體顏色變淡, 細胞死亡呈空胞化,發(fā)白、腐爛甚至脫落(陳偉洲等, 2015)。2012 年, 福鼎敏灶灣壇紫菜大面積病爛暴發(fā)期間, 林曉明(2014)檢測了當?shù)睾Ｋ白喜吮砻嫖⑸锴闆r, 認為海水中細菌對壇紫菜爛苗基本無影響, 壇紫菜葉狀體表面并未檢測到微生物的異常繁殖。因而, 這種爛菜現(xiàn)象被認為是源于生理性的病變。在氣溫異常升高、海水交換不暢、二氧化碳和營養(yǎng)鹽供給滯緩的情況下易導致壇紫菜病爛的發(fā)生(宋武林, 2009; 賴平玉, 2009;林曉明, 2014)。另一方面, 我們在長期的觀察中也發(fā)現(xiàn), 缺乏干出的紫菜苗簾, 或者連續(xù)的陰雨天, 更容易導致病爛發(fā)生。而病爛發(fā)生時, 處于較高潮位的紫菜受影響程度較輕。目前, 對紫菜病爛現(xiàn)象發(fā)生的原因, 相關研究基本是從環(huán)境因素方面進行分析(宋武林, 2009; 林曉明, 2014), 至于環(huán)境改變對藻體細胞造成了怎樣的影響, 以及導致紫菜病爛發(fā)生的內(nèi)在生物學機制, 一直沒有較為明確和系統(tǒng)的研究。

據(jù)報道, 壇紫菜耐高溫性狀與其本底的抗氧化能力密切相關(楊銳等, 2007; 張元等, 2011)。因此我們推測, 條斑紫菜中可能也存在類似的機制, 即活躍的抗氧化酶活性有助于藻體抵御不良環(huán)境的脅迫;相反, 長期生長于最適環(huán)境條件下的藻體, 其ROS的產(chǎn)生和消除功能處于較不活躍的狀態(tài), 導致條斑紫菜細胞對逆境響應的減弱, 若此時經(jīng)歷高溫脅迫,很容易造成藻體的氧化損傷, 病菌借機侵入, 造成大規(guī)模的爛菜。眾所周知, 條斑紫菜幼苗的生長適溫為12—17 °C, 隨著藻體生長, 其適溫有所降低, 適宜鹽度約21—29 (朱建一等, 2016)。為此, 我們采用不同鹽度、不同溫度處理條斑紫菜, 通過測定其光合作用參數(shù)、抗氧化酶活性, 以及相關基因的表達, 研究了溫度升高及鹽度降低對條斑紫菜抗氧化系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

2020 年12 月初, 從啟東市連濤水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社青島即墨紫菜栽培海區(qū)剪取附有健康條斑紫菜(Pyropia yezoensis)葉狀體網(wǎng)簾, 帶回實驗室暫養(yǎng), 培養(yǎng)條件為: 溫度15 °C; 光照強度50 μE/(m2·s); 光周期12L︰12D。海水中添加PES 營養(yǎng)鹽, 通氣培養(yǎng), 期間每天換水一次。

1.2 方法

1.2.1 不同鹽度海水處理 在滅菌海水中添加去離子水, 分別配制鹽度為20、25 的稀釋海水。新鮮條斑紫菜分別置于相應鹽度海水中適應24 h, 其他條件同對照(鹽度30)。分別對不同鹽度(20, 25, 30)條件下的條斑紫菜進行高溫、強光處理。本實驗以鹵素燈提供1 000 μE/(m2·s)的強光照條件, 溫度通過水浴的方法加以控制。各樣本脅迫處理4 h 后, 測定光合作用參數(shù), 收集材料, 吸水紙吸干, 液氮速凍, –80 °C保存待用。

1.2.2 光合參數(shù)測定 藻體在不同鹽度、溫度條件處理后暗適應 10 min, 使用調制葉綠素熒光儀Dual-PAM-100 (Heinz Walz, Effeltrich)測定其光合作用參數(shù)(Pfündelet al, 2008)。具體測定程序包括: 初始熒光(Fo), 以12 μE/(m2·s)的測量光測定獲得; 最大熒光參數(shù)(Fm), 使用飽和脈沖[SP, 強度6 000 μE/(m2·s)],持續(xù)時間300 ms 測定; 可變熒光(Fv)由Fm和F0的差值獲得。測定過程中光化光強度設定為57 μE/(m2·s),通過運行飽和脈沖的方法, 獲得光合作用各參數(shù), 并在Microsoft Office Excel 2003 中進行數(shù)據(jù)處理并作圖,P<0.05 時認為差異顯著。

1.2.3 過氧化氫(H2O2)含量測定 取適量–80 °C凍存的條斑紫菜樣品, 放入2 mL 離心管, 液氮預凍,于研磨儀(JX-FSTPRP-24, 凈信科技, 中國上海)粉碎成粉, 加適量提取液(南京建成)充分混勻, 12 000g,4 °C 離心10 min, 小心吸取上清, 得粗提液。使用多功能微孔板檢測儀(M1000Pro, Tecan Ifinite,Switzerland), 按試劑盒操作步驟, 測定吸光值, 計算H2O2含量。

1.2.4 丙二醛(MDA)含量測定 通過植物MDA 試劑盒(南京建成)測定。材料粉碎研磨及粗提液的獲得方法同前。按照說明書步驟, 以無水乙醇為空白對照,以10 nmol/mL 的MDA 標準品作為標準管對樣本中MDA 含量的標定, 不同樣本作為測定管, 使用多功能微孔板檢測儀(M1000Pro, Tecan Ifinite, Switzerland)在340 nm 波長下測定吸光度, 計算MDA 含量。

1.2.5 抗氧化酶活性測定 材料粉碎研磨及粗提液的獲得方法同前。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成)基于WST-8 的顯色反應, 通過比色對組織樣品中的酶活進行測定; 抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性通過APX 試劑盒(南京建成)測定, 根據(jù)單位時間內(nèi)A290吸光度的減少值計算。過氧化氫酶(CAT)活性通過CAT 試劑盒(南京建成)測定, 根據(jù)單位時間內(nèi)A405吸光度的變化量測定獲得。過氧化物酶(POD)活性通過POD 試劑盒(南京建成)測定, 根據(jù)單位時間內(nèi)A420吸光度的變化量測定獲得。

1.2.6 抗氧化酶系統(tǒng)關鍵分子實時熒光定量(qRT-PCR)檢測

(1) RNA 提取 各取適量不同條件處理后的樣品, 依據(jù)RNAprep pure 試劑盒說明書進行總RNA提取。提取得到的 RNA 濃度通過 Nanodrop Photometer 分光光度計(IMPLEN, CA, 美國)測定。每個樣品提取3 次。

(2) 反轉錄 反轉錄操作依據(jù)TaKaRa 反轉錄酶試劑盒說明書進行, 每個反應含總RNA 200 ng,具體操作步驟包括: (1) 去除基因組 DNA 反應。5×gDNA Eraser Buffer 2 μL, gDNA Eraser 1 μL, Total RNA (200 ng), 添加RNase Free dH2O 至10 μL; 42 °C 2 min; (2) 反轉錄反應。向步驟(1)的反應液中加入以下試劑: PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL, RT Primer Mix 1 μL, 5×Primescript Buffer 4 μL, RNase Free dH2O 4 μL; 37 °C 15 min, 85 °C 5 s, 4 °C 保存。所獲cDNA 模板置于–20 °C 暫存。

(3) 引物設計 選擇eEF-1a(Elongation factor1-α)為內(nèi)參基因, 基因序列從本實驗室轉錄組數(shù)據(jù)獲得。利用Primer Premier 5.0 設計引物, 基因名稱及引物序列見表1。

表1 目標基因引物序列及PCR 產(chǎn)物長度Tab.1 Primer sequences and the PCR product sizes of target genes

(4) qRT-PCR 條件優(yōu)化及基因表達量測定 通過調整PCR 各參數(shù), 分別對各引物擴增條件進行優(yōu)化。將獲得的純化片段插入PMD19-T 載體, 轉化E.coil感受態(tài)細胞。菌落 PCR 及測序驗證后, 利用EZNA TM plasmid mini kit 提取試劑盒提取質粒, 并對質粒進行10 倍梯度稀釋, 進行引物擴增效率檢測。如擴增效率達到90%—110%, 則進行qRT-PCR 實驗。

借助于StepOne Plus 多色實時熒光定量PCR 儀(ABI, Foster, CA, USA), 使用2 × SYBR Green Master Mix (Roche, 德國), 每組處理樣品設3 個重復, 進行基因轉錄水平的測定。qRT-PCR 反應體系20 μL, 包括1 μL cDNA 模板, 10 μL 2 × SYBR Green Master Mix, 上下游引物各0.5 μL (濃度為10 μmol/μL), 8 μL RNase-free 水。qRT-PCR 反應程序: 預變性: 95 °C 10 min; 變性: 95 °C 10 s、退火: 不同引物有不同退火溫度15 s、延伸: 72 °C 25 s, 40 個循環(huán); 65 °C 30 s,61 個循環(huán)。反應結束后, 通過2–ΔΔCt的方法計算相對基因表達值(Livaket al, 2001)。

2 結果

2.1 不同脅迫處理條件下光合參數(shù)的變化

脅迫處理 4 h 后, 各樣本潛在最大量子產(chǎn)額(Fv/Fm)及非光化學淬滅(Y(NO))結果如下圖所示(圖1)。在15 °C 下, 不同鹽度處理組的Fv/Fm無顯著性差異;而在20 °C 處理后,Fv/Fm明顯降低(圖1a), 各樣本的潛在光合作用均受到了影響, 尤其是20 低鹽處理的樣本, 其活性不僅顯著低于15 °C 處理的樣本, 而且也明顯低于鹽度25 及鹽度30 在20 °C 高溫條件下的Fv/Fm。

非光化學淬滅Y(NO)值則顯示, 在15 °C 條件下,隨著鹽度降低,Y(NO)值存在上調趨勢。而20 °C 高溫脅迫下, 30 鹽度下藻體Y(NO)值相較于15 °C 顯著上調, 且隨鹽度降低Y(NO)值持續(xù)上調(圖1b)。

圖1 不同鹽度、溫度條件下條斑紫菜Fv/Fm 及Y(NO)的變化Fig.1 Changes in Fv/Fm and Y(NO) of P. yezoensis under different salinity and temperature conditions

2.2 過氧化氫及丙二醛含量變化

測定結果顯示, 在30 鹽度下, 20 °C 高溫脅迫會導致H2O2含量顯著增加, 而在較低的25 及20 鹽度條件下, H2O2含量與15 °C 低溫條件下相當, 未見明顯變化(圖2)。

圖2 條斑紫菜葉狀體不同處理條件下H2O2 含量Fig.2 H2O2 content of P. yezoensis under different treatment conditions

機體MDA 含量可間接反應細胞受損傷的程度。本實驗測定結果如圖3 所示, 在15 °C 低鹽(20)條件下, MDA 含量相對低于鹽度25 及30 樣本中的含量,但當溫度上升到20 °C 時, MDA 含量顯著上升。在20 °C 條件下, 鹽度25 和20 處理的樣本中, MDA 含量亦出現(xiàn)輕微上調, 且顯著高于鹽度 30 條件下的MDA 含量。

圖3 條斑紫菜葉狀體不同處理條件下MDA 含量Fig.3 MDA content of P. yezoensis under different treatment conditions

2.3 抗氧化酶活性測定

前期研究表明, 抗氧化系統(tǒng)在條斑紫菜應對環(huán)境脅迫的過程中發(fā)揮了重要作用(Yuet al, 2020)。因此, 本文測定了超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)在不同條件下的活性變化(圖4)。

圖4 條斑紫菜葉狀體不同處理條件下抗氧化酶活性變化Fig.4 Changes of antioxidant enzyme activities in P. yezoensis under different treatment conditions

SOD 酶活檢測結果顯示(圖4a), 鹽度降低, SOD酶活性增加, 尤其在鹽度20 條件下, 其活性較相同溫度下30 鹽度處理組樣本顯著上調。升高的溫度也會引起SOD 酶活性的上調, 在鹽度30 和20 處理組中, 20 °C 條件下樣本SOD 活性均顯著高于15 °C 培養(yǎng)樣本的SOD 活性。

在15 °C條件下, CAT活性隨鹽度的降低而呈現(xiàn)降低的趨勢。當溫度升高至20 °C后, 無論在高鹽還是低鹽條件下, CAT活性均明顯低于15 °C (圖4b), 同時發(fā)現(xiàn), CAT活性在鹽度20條件下下調最為明顯。

抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性(圖4c)在15 °C 條件下, 隨著鹽度的降低呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢; 鹽度25 條件下, APX 活性顯著降低; 在鹽度20 下, 又出現(xiàn)明顯的上調。而鹽度不變, 溫度升至20 °C 時后APX酶活出現(xiàn)顯著下調。尤其在鹽度20 的樣本中, APX 活性受到明顯的影響, 降至15 °C 條件下的三分之一。

過氧化物酶(POD)活性測定結果顯示(圖4d), 在15 °C, 不同的鹽度條件下處理4 h 后其活性無明顯變化, 當溫度升高至20 °C 時, 鹽度30 和25 培養(yǎng)下的POD 活性略有下降, 但不顯著, 而在鹽度20 處理的藻體中, POD 活性出現(xiàn)顯著上調。

2.4 抗氧化酶系統(tǒng)關鍵基因的實時熒光定量分析

熒光定量檢測結果顯示SOD 表達量(圖5a)在不同鹽度條件下無明顯差別, 除鹽度20 處理的樣本外,較高溫度的脅迫使得SOD 表達均明顯上調。因此, 推測SOD 的表達受鹽度影響較小, 而溫度對SOD 的表達影響較大。但在高溫低鹽(20 °C, 鹽度20)條件下,SOD 的轉錄表達受到了抑制。

藻體中H2O2可被CAT 直接還原為H2O 和O2。熒光定量結果顯示15 °C 下, 與30 鹽度條件下的對照相比, 25 條件下CAT 表達顯著下調, 而20 的低鹽可誘導CAT 上調表達。相反地, 在溫度升高至20 °C 后,CAT 的表達在鹽度30 和25 下與對照相比顯著上調,但20 的低鹽條件則抑制了其轉錄活性(圖5b)。

與SOD 的轉錄變化趨勢類似, APX 轉錄水平(圖5c)在溫度15 °C 條件下亦呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,值得注意的是在20 的低鹽脅迫下, APX 轉錄水平與其他鹽度處理組相比, 出現(xiàn)顯著的上調。高溫脅迫使得APX 在鹽度25 與30 條件下, 表達量均明顯上調,而在鹽度20 條件下, APX 表達則出現(xiàn)明顯的下調。

圖5 不同培養(yǎng)條件下抗氧化酶關鍵基因的表達變化Fig.5 Changes of the expression of key antioxidant enzyme genes under different conditions

POD 的表達在鹽度25 及20 條件下顯著下調。在20 °C 高溫條件下, 鹽度30 處理的樣本POD 轉錄水平顯著上調, 低鹽條件下的轉錄隨鹽度降低而呈下調趨勢(圖5d)。

谷胱甘肽還原酶(GR)熒光定量的結果顯示(圖5e), 15 °C 條件下不同鹽度對其表達量影響甚微, 而20 °C 時出現(xiàn)高溫脅迫, 使得GR 在不同鹽度下的表達出現(xiàn)明顯變化。在鹽度25 時, 表達顯著上調, 而在鹽度20 的條件下, 則顯著下調。

NAD(P)H 氧化酶(NOX)熒光定量結果顯示(圖5f),NOX 的表達在15 °C 條件下隨鹽度的降低呈現(xiàn)上調趨勢, 在鹽度 20 下顯著高于對照。另一方面, 在20 °C 下, NOX 的轉錄水平與對照相比均呈顯著變化,在鹽度25 和30 條件下, 其表達活性比低溫條件下(15 °C)明顯上調, 而在鹽度20 條件下, NOX 轉錄活性與低溫條件下(15 °C)相比, 呈明顯下調表達。

3 討論

3.1 高溫脅迫對條斑紫菜的影響

光合作用是對溫度變化非常敏感的一個生理生化過程, 高溫等逆境脅迫條件下, 通常是光合作用先受到影響(Berryet al, 1980), 反映在光合作用參數(shù)上則為, 指示光能轉換效率參數(shù)的Fv/Fm值首先下降,光合電子傳遞速率降低, 以及非光化學淬滅的增加(Davisonet al, 1996; 張守仁, 1999)。本研究中, 我們發(fā)現(xiàn)高溫(20 °C)導致條斑紫菜Fv/Fm出現(xiàn)下調, 尤其在高溫和低鹽(鹽度20)復合脅迫下, 藻體光合作用受到明顯抑制。同時, 指示藻體光合系統(tǒng)受損的非光化學淬滅Y(NO)值均上升, 且這種損傷在鹽度降低時更加明顯。因此, 高溫逆境會影響條斑紫菜的光合作用系統(tǒng), 而鹽度的降低則加劇了對光合作用的抑制效果。

正常的植物生長發(fā)育過程中, 其機體內(nèi)會維持一個相對穩(wěn)定的氧自由基代謝平衡狀態(tài), 而這種相對穩(wěn)定的狀態(tài)在脅迫發(fā)生時會遭到破壞(Mittleret al,2006)。高能態(tài)電子與氧分子結合形成活性氧(reactive oxygen species, ROS) (Mittler, 2002), 包括單線態(tài)氧(singlet oxygen,1O2)、過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)、超氧陰離子(superoxide anion free radical, O2–)和羥自由基(hydroxyl radical, HO·)。構成細胞的蛋白質、DNA、脂質等可能受到氧化損傷而導致正常的細胞功能受到影響(Apelet al, 2004)。若藻體內(nèi)生物膜的多不飽和脂肪酸與氧自由基發(fā)生過氧化反應, 生成丙二醛(MDA), 會引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合, 加劇細胞膜的損傷, 因而MDA 的含量可反映機體脂質過氧化的程度, 間接反映出細胞受損傷的程度。我們的測定結果顯示不同處理條件下,H2O2含量的變化不大, 說明條斑紫菜中存在有效的氧自由基清除機制。而值得注意的是, 溫度升高的條件下, 鹽度25 或20 條件下的樣本中, MDA 含量出現(xiàn)顯著增加。因此推測, 在高溫(20 °C)條件下, 藻體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)作用的發(fā)揮可能受到了抑制, 尤其在鹽度降低的情況下, 會導致藻體MDA 含量增加, 最終可能引起藻體膜系統(tǒng)受到損傷。

3.2 抗氧化酶活化是條斑紫菜抵御高溫脅迫的重要機制之一

植物在長期的進化過程中, 發(fā)展出了多種應對環(huán)境脅迫的保護機制。而抗氧化防御系統(tǒng)的活性變化被認為是植物細胞耐高溫的主要機制之一, 依賴抗氧化系統(tǒng)的作用, 生物體內(nèi)的氧化脅迫得到緩解(Sies, 1993; 臧曉南等, 2008)。本文測定發(fā)現(xiàn), 條斑紫菜葉狀體在高溫處理4 h后, 無論SOD酶活(圖4a), 還是其轉錄水平(圖5a)均出現(xiàn)上調。然而, 在25及20的低鹽度條件下, H2O2的含量卻沒有出現(xiàn)與SOD酶活相對應的上調趨勢。尤其是20低鹽條件下, 20 °C處理4 h后, 其酶活顯著上調, 而H2O2的含量卻保持在較低水平, 說明H2O2的清除效率相對較高。同時, 高溫條件下, 低鹽(20)脅迫導致SOD轉錄水平略微下調, 暗示SOD的轉錄已經(jīng)受到了影響。

CAT 可以將H2O2轉化為水和分子氧, 從而減少對細胞造成的氧化損傷。高溫脅迫下, CAT 活性的降低說明其對溫度較敏感, 而且, 15 °C 下, CAT 活性隨海水鹽度降低而下降, 說明其活性對鹽度也較為敏感。在轉錄水平, 20 °C 的高溫脅迫導致CAT 表達在鹽度25 和30 樣本中均顯著上調, 這與CAT 被認為是植物熱激下ROS 主要清除劑的報道相一致(Gillet al,2010)。然而, 無論在酶活水平還是在基因轉錄水平,CAT 在高溫低鹽(20 °C, 鹽度20)條件下均被抑制。暗示此條件下產(chǎn)生的H2O2不能被CAT 及時分解, 會對細胞造成一定的損傷。

POD 以H2O2為電子受體, 催化H2O2直接氧化酚類或胺類化合物, 據(jù)報道, POD 活性在條斑紫菜應對高溫脅迫的過程中呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(侯和勝等, 2008), 本實驗中, 我們僅測定了高溫脅迫4 h 后的酶活變化, 發(fā)現(xiàn)在鹽度25 與30 的條件下, 其活性變化同文獻報道的結果類似(圖4d), 而鹽度20 條件下高溫處理樣本POD 酶活則顯著升高, 說明低鹽高溫脅迫可能已經(jīng)造成了條斑紫菜體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的失衡, POD 活性的顯著上調, 也解釋了CAT (圖4b)在此條件下下調而H2O2含量卻略微下調的原因。而在轉錄水平, 除鹽度30 外, 藻體在低鹽高溫度條件下的轉錄受到了顯著抑制(圖5d), 因此, 隨著脅迫時間的推移, POD 酶在低鹽高溫條件下的表達將受到抑制,酶活不可避免地出現(xiàn)下調, 最終導致氧自由基對細胞造成更為嚴重的損傷。

抗壞血酸過氧化物酶(APX)是葉綠體和過氧化物酶體中主要的H2O2清除酶, 以還原型抗氧壞血酸(AsA)作為電子供體將H2O2還原, 與過氧化氫酶(CAT)相比具有更高的H2O2親和性, 很多情況下是一種更高效的H2O2清除劑(閻成士等, 1999)。其酶活與轉錄在在整個低鹽、高溫脅迫過程中顯著變化, 暗示APX對于環(huán)境脅迫具有較強烈的響應, 且高溫條件明顯抑制了其活性, 而鹽度的降低, 使得這種抑制作用更為明顯(圖4c)。APX的轉錄在鹽度20, 溫度15 °C時表達出現(xiàn)明顯上調(圖5c), 則可能暗示在較低的溫度下,低鹽已經(jīng)造成了藻體的脅迫, 而在溫度升高的條件下, APX的表達受到了抑制, 故而導致APX的表達顯著下調。同時發(fā)現(xiàn), 鹽度25和30下培養(yǎng)的藻體, 其APX活性雖然在高溫脅迫下降低, 但其表達量則呈現(xiàn)明顯的上調(圖4c), 說明, 高溫條件下APX迅速發(fā)揮功能而失活, 轉錄水平的上調則為其合成奠定基礎, 隨著脅迫時間的延長, APX酶活可能出現(xiàn)上調,這與其他報道中抗氧化酶活性在脅迫條件下出現(xiàn)先降低后升高的趨勢相同(王潤豪等, 2020)。另據(jù)文獻報道, 高等植物中, APX在熱激條件下常被作為一種代表性的ROS清除酶被激活(Hanet al, 2019)。但在鹽度20的條件下培養(yǎng)的藻體, 其表達受到了抑制, 因而,藻體對高溫脅迫的響應受到了抑制。

谷胱甘肽還原酶(GR)以NADPH 為電子供體將氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原為還原型谷胱甘肽(GSH), 是維持谷胱甘肽還原性的重要酶, 而GSH 是抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)(AsA-GSH 循環(huán))的電子供體,將脫氫型抗壞血酸(DHA)還原為AsA, 被認為是葉綠體中清除超氧陰離子和 H2O2的主要途徑。相對于CAT, 在15 °C 的低溫條件下, 鹽度變化對GR 轉錄水平無明顯影響, 而在20 °C 高溫脅迫下, 不同鹽度條件下GR 的轉錄存在較大區(qū)別, 30 的鹽度條件下與對照相比無明顯變化, 25 鹽度條件下, 其轉錄顯著上調,在20 鹽度條件下顯著下調(圖5e)。說明細胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)及AsA-GSH 循環(huán)在低鹽條件下可能受到了抑制, 導致藻體更易受到氧化損傷。

3.3 海水鹽度與高溫誘發(fā)的條斑紫菜病爛發(fā)生密切相關

綜上所述, 條斑紫菜葉狀體在鹽度25與30的條件下, 短時經(jīng)歷高溫、強光等環(huán)境因子脅迫時, 藻體內(nèi)部分抗氧化酶活性及抗氧化系統(tǒng)關鍵基因的表達均呈現(xiàn)上調趨勢, 抗氧化系統(tǒng)對藻體細胞起到了有效地保護作用。但當鹽度降低到20時, 藻體利用NAD(P)H提供電子而生成超氧陰離子自由基的反應受到了抑制, 同時, 抗氧化系統(tǒng)相關酶的表達也不同程度地受到了影響, 因而不可避免地造成了MDA含量上升, 最終導致藻體細胞受到了嚴重的氧化損傷。另據(jù)報道, 較高的抗氧化酶的表達, 對于壇紫菜應對水體升溫導致的環(huán)境脅迫具有積極意義(楊銳,2007; 張元等, 2011)。這是因為植物體內(nèi)存在交叉適應現(xiàn)象, 即一種脅迫處理會誘導出植物體對另外一種或多種逆境的抗性, 因而可以通過多種脅迫預處理來增強植物對某種逆境的抵抗力(Valladareset al,1997; Sabehatet al, 1998; Ladjalet al, 2000; 康建宏等,2008; 張永福等, 2015)。事實上, 在紫菜人工栽培生產(chǎn)過程中, 人們也正是利用干出脅迫處理來提高紫菜的品質和預防病爛發(fā)生。分布于江蘇南通長江入海口北部的啟東、如東等沿海地區(qū), 是我國高品質條斑紫菜主產(chǎn)區(qū), 由于長江沖淡水的影響, 海區(qū)鹽度一般在24—26之間(何小燕等, 2010)。栽培期間, 如遇高溫降水, 很容易導致爛菜現(xiàn)象的發(fā)生。

4 結論

在溫度升高及鹽度降低的雙重脅迫下, 條斑紫菜藻體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)酶活及相關基因的表達受到抑制, 并由此導致藻體MDA 含量增加, 膜系統(tǒng)受到損傷, 這可能是紫菜病爛發(fā)生的重要誘因之一。故在海水鹽度較低的南通海區(qū), 溫度升高很容易導致紫菜病爛的發(fā)生, 而山東青島、威海等北方海區(qū)海水鹽度通常維持在30 左右, 即使在遭遇高溫、降雨天氣時,藻體抗氧化系統(tǒng)的表達受影響程度仍然較小。因此,在同樣的海水溫度條件下, 山東栽培的條斑紫菜在抵御高溫誘發(fā)的病爛方面, 比南通沿岸栽培的同品系條斑紫菜具有更大的優(yōu)勢。