王菲菲，孫麗蘊(yùn)，白彥萍

銀屑病是一種T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，多基因背景與環(huán)境因素相互作用所導(dǎo)致的免疫失衡是其發(fā)病的主要原因?；颊叩钠p表現(xiàn)、疾病嚴(yán)重程度以及病程均存在不同程度的差異，但也給患者帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)[1]。microRNA（miRNA）是一類在動(dòng)植物及病毒中廣泛存在的長(zhǎng)度一般為19～25個(gè)核苷酸組成的單鏈小分子非編碼RNA，通過基因切割和翻譯抑制的方式直接調(diào)控基因組中30%以上的蛋白編碼基因的表達(dá)[2]，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖、分化和凋亡參與銀屑病發(fā)病過程[3]。本研究通過檢測(cè)銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中差異表達(dá)的miRNA，并預(yù)測(cè)其靶基因，研究其在銀屑病中的作用機(jī)制[4,5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 選取2016年2—12月在中日友好醫(yī)院就診的尋常性銀屑病患者15例，其中男10例，女5例，年齡18～65歲，平均年齡（37.5±7.5）歲，病程1～20年，平均病程（8.1±5.5）年。所有患者近3個(gè)月未進(jìn)行過系統(tǒng)治療，且無其他免疫系統(tǒng)疾病。同期選體檢中心健康者14例，男8例，女6例，平均年齡（38.1±9.4）歲，與銀屑病組患者在性別、年齡等一般資料方面無差異。銀屑病組中選取5例患者的樣本、健康對(duì)照組中選取4例健康者的樣本用于芯片檢測(cè)。

1.1.2 主要試劑和儀器 Trizol試劑（美國Invitrogen公司），RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo公 司），F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master（Rox）（瑞士Roche公司），RNA洗脫純化試劑盒（美國Qiagen公司），MirVanaTMmiRNA分離試劑盒（美國Ambion公司），Human miRNA Microarray，Release 21.0，8×60K芯片（Agilent公司），本實(shí)驗(yàn)芯片部分在北京博奧晶典完成，其他相關(guān)試劑均由該公司提供。Agilent芯片掃描儀（G2565CA），熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 所有研究對(duì)象均采集外周靜脈血6 ml，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，利用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液采用密度梯度離心法對(duì)PBMC進(jìn)行提取。

1.2.2 miRNA芯片流程 ①總RNA提??；②總RNA質(zhì)檢；③總RNA的去磷酸核、標(biāo)記和雜交；④芯片的清洗和掃描；⑤數(shù)據(jù)提取和分析，使用Agilent Feature Extraction軟件對(duì)雜交圖片進(jìn)行分析，并提取數(shù)據(jù)。使用Agilent GeneSpring軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化和差異分析，遂采用R-Project統(tǒng)計(jì)軟件篩選差異表達(dá)的miRNA，再應(yīng)用TargetScan、DIANA、miRanda數(shù)據(jù)庫，對(duì)可能靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，以及進(jìn)行GO分析和KGEE Pathway分析。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time-PCR）檢測(cè)PBMC中TIGIT mRNA的表達(dá)：①CD4+T淋巴細(xì)胞總RNA的抽提；②RNA質(zhì)量的檢測(cè)；③RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；④PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)：TIGIT引物： sense：GACTTGGGGTGGCACATCTC，anti-sense：AATGGAATCTGGAACCTGGCA；肌動(dòng)蛋白內(nèi)參引物：sense：CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT, antisense：CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Agilent GeneSpring 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）形式表示，符合正態(tài)分布采用t檢驗(yàn)或方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，非正態(tài)分布采用Mann-Whitney非參數(shù)U檢驗(yàn)。相關(guān)性分析使用Spearman相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總RNA質(zhì)量鑒定

分光光度計(jì)分析RNA的濃度和純度。9例患者RNA純度：A260/280≥1.70符合表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)要求；總量≥1 μg，滿足表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)要求。RNA完整性質(zhì)量基本符合表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)要求（表1）。

表1 樣本總RNA定量結(jié)果

2.2 銀屑病組和健康對(duì)照組PBMC差異表達(dá)的miRNA

篩選出268個(gè)表達(dá)異常的miRNA。正常人與銀屑病患者PBMCs中有51個(gè)miRNAs呈差異性表達(dá)（Log FC＞1或Log FC＜-1）。結(jié)果顯示有10個(gè)明顯上調(diào)，41個(gè)明顯下調(diào)，其中miR-23-3p等11個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（表2）。

表2 銀屑病患者與健康對(duì)照組差異miRNAs比較

2.3 差異表達(dá)的miRNA（miR-23b-3p）分析

使用DIANA進(jìn)行通路富集分析。GO分析顯示miR-23b-3p參與了細(xì)胞間信號(hào)傳遞過程、免疫應(yīng)答過程、表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)傳遞過程等（圖1）；KEGG 通路分析提示miR-23b-3p參與T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等（圖2），這些通路均參與了銀屑病的發(fā)病過程。并且通過TargetScanHuman對(duì)靶基因預(yù)測(cè)后，發(fā)現(xiàn)TIGIT是其重要的靶基因（ENST00000486257.1）。靶基因表達(dá)驗(yàn)證TIGITmRNA在銀屑病患者外周血PBMC表達(dá)顯著低于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 miR-23b-3p GO分析

圖2 miR-23b-3p KEGG 通路分析

2.4 TIGIT 在PBMC中的表達(dá)

靶基因表達(dá)驗(yàn)證TIGITmRNA在銀屑病患者PBMC表達(dá)顯著低于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

表3 TIGITmiRNA在PBMC中的表達(dá) （xˉ ±s）

3 討論

銀屑病一種以全身免疫失衡為特點(diǎn)的炎癥性皮膚病，可累及患者的皮膚和（或）關(guān)節(jié)，發(fā)病總?cè)巳杭s占全球總?cè)藬?shù)的5%[6]，對(duì)患者的生活質(zhì)量有嚴(yán)重的負(fù)面影響。銀屑病是一種復(fù)雜的多因素疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。目前普遍認(rèn)為銀屑病的病因與遺傳易感性、環(huán)境以及與患者性別和年齡因素有關(guān)。其中表觀遺傳學(xué)可以與環(huán)境相互作用影響易感基因表達(dá)，通過作用于表皮的分化和增殖、免疫和炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期和凋亡及干擾素（IFN）-γ、腫瘤壞死因子（TNF）-α信號(hào)通路的多基因表達(dá)參與銀屑病的發(fā)病過程[7]。特別是基因調(diào)控的異常表達(dá)miRNAs，被認(rèn)為是銀屑病的重要致病因素。

miRNAs的表達(dá)水平在不同組織和不同發(fā)育階段具有顯著差異。包括發(fā)育進(jìn)程，造血過程，器官形成，細(xì)胞增殖、分化、代謝和凋亡等。miRNA通過與信號(hào)通路和調(diào)控因子相互作用形成了一個(gè)全方位、多層次的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了對(duì)機(jī)體免疫平衡和表皮穩(wěn)態(tài)的調(diào)控[8]。Sonkely等[9]報(bào)道m(xù)iRNA-20、miRNA-146在銀屑病患者皮損中表達(dá)增加，可通過作用于靶基因SOCS3、TARF6和IRAK1的表達(dá)，調(diào)控STAT-3和TNF-α信號(hào)通路，影響角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化以及體內(nèi)的免疫應(yīng)答，參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展。Jinnin[10]通過研究銀屑病患者血清中異常表達(dá)miRNAs組的交聯(lián)關(guān)系，首次提出miRNAs組合表達(dá)情況可以作為銀屑病可靠的診斷指標(biāo)。筆者通過篩選銀屑病患者差異表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-23-3p在銀屑病患者PBMC中呈低表達(dá)狀態(tài)。同時(shí)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)miR-23-3p在多種腫瘤組織中表達(dá)增高[11]，提示其可能具有免疫抑制的作用或參與調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫抑制過程。本文通過對(duì)miR-23-3p進(jìn)行GO和KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)其可能參與機(jī)體多種免疫活動(dòng)，尤其是T淋巴細(xì)胞受體與其配體間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過對(duì)miR-23-3p靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，TIGIT作為具有免疫抑制作用的共抑制受體引起筆者的重視，進(jìn)一步用實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量分析后驗(yàn)證了TIGIT在銀屑病患者確實(shí)呈低表達(dá)狀態(tài)。

TIGIT作為T淋巴細(xì)胞的協(xié)同信號(hào)分子，可以通過直接抑制T淋巴細(xì)胞的活化、與抗原提呈細(xì)胞（APCs）上的CD155結(jié)合等直接或間接調(diào)節(jié)Th1/Th17對(duì)自身抗原及炎性因子發(fā)揮免疫抑制作用。因此筆者推測(cè)通過干預(yù)miR-23-3p使銀屑病患者T淋巴細(xì)胞TIGIT表達(dá)增高，可能在銀屑病的治療中具有一定的潛在價(jià)值。提示miR-23b-3p可能是其潛在的治療靶點(diǎn)，但其具體機(jī)制仍值得進(jìn)一步探討和研究。