林少沖，徐麗達，杜俊鵬，王凱，王寶金

(1.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院 婦科，河南 鄭州 450052；2.河南省卵巢惡性腫瘤國際聯(lián)合實驗室，河南 鄭州 450052；3.同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，上海 201204)

卵巢癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，具有起病隱匿、易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率高和高度耐藥等惡性生物學(xué)行為[1-2]。手術(shù)切除及術(shù)后輔助化療使部分卵巢癌患者從中獲益，但是卵巢癌患者的5 a總體生存率仍不理想[3]。近年來，靶向治療及免疫治療在多種腫瘤治療中展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢，如PD-1抑制劑可以阻斷免疫檢查點PD-1，激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生腫瘤免疫應(yīng)答，已用于癌癥治療中[4]。MUC1在臨床研究和腫瘤基礎(chǔ)研究領(lǐng)域一直備受關(guān)注。本研究旨在分析MUC1在卵巢癌中的表達水平及意義，為以MUC1為靶點的卵巢癌免疫治療策略提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 GEPIA數(shù)據(jù)庫篩選條件如下。(1)“gene: MUC1”。(2)“Expression DIY: Boxplot”。(3)“Datasets selection: OV”。檢索MUC1轉(zhuǎn)錄組水平變化。

1.2 HPA數(shù)據(jù)庫利用人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫(the human protein atlas，HPA)比較卵巢癌組織和正常卵巢組織中MUC1蛋白表達情況。

1.3 LinkedOmics數(shù)據(jù)庫檢索步驟如下。(1)cancer type database：卵巢癌TCGA數(shù)據(jù)集。(2)data type：mRNA expression(RNA seq)。(3)選擇基因MUC1并應(yīng)用pearson correlation test分析，得到與ESPL1正負相關(guān)的基因。(4)進行GSEA分析(GO生物功能和KEGG通路富集分析)。將得到的正負相關(guān)基因進行Cmap分析尋找潛在小分子藥物。

1.4 Kaplan-Meier 生存分析利用Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫進行生存分析。篩選條件如下。(1)“Cancer：Ovarian Cancer”。(2)“Gene：MUC1”。(3)“Survival：OS和FPS”。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。卵巢癌組織與正常組織表達差異的比較，采用t檢驗。MUC1表達與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系采用Kaplan-Meier生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MUC1基因在腫瘤中的表達概況首先，利用GEPIA數(shù)據(jù)庫探究MUC1基因在33種常見腫瘤中的表達情況。如圖1所示，MUC1在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺浸潤癌(BRCA)、宮頸鱗癌和腺癌(CESC)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBC)、膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)、低級別膠質(zhì)瘤(LGG)、胰腺癌(PAAD)、胸腺癌(THYM)和子宮內(nèi)膜癌(UCEC)中表達明顯升高；腎上腺皮質(zhì)腫瘤(ACC)、腎透明細胞癌(KIRC)、腎乳頭狀細胞癌(KIRP)、肺鱗癌(LUSC)、皮膚黑色素瘤(SKCM)和睪丸癌(TGCT)中MUC1基因表達水平明顯降低。

圖1 MUC1基因在33種常見腫瘤中的表達情況

2.2 MUC1在卵巢癌中的表達GEPIA數(shù)據(jù)庫中比較了426個卵巢癌組織和88個正常卵巢組織的MUC1mRNA水平。腫瘤組織中MUC1表達明顯高于正常組織，見圖2A。同時，MUC1的異常高表達在GSE18520數(shù)據(jù)集得到了再次驗證，見圖2B。通過HPA數(shù)據(jù)庫中的免疫組化數(shù)據(jù)，探索MUC1蛋白的表達情況。圖2C和圖2D使用相同的抗體染色，但是染色的強度和質(zhì)量明顯不同。癌組織中檢測到較高的表達強度，但在正常卵巢組織中未檢測到MUC1蛋白的表達。

2.3 MUC1與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存曲線顯示，MUC1高表達患者的無瘤進展生存時間(18.6個月)明顯短于MUC1低表達的卵巢癌患者的無瘤進展生存時間(22個月)(P<0.05)。但是MUC1高表達組與低表達組患者的總體生存時間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.15)，見圖3B。

臨床分期Ⅰ期和Ⅱ期卵巢癌患者的亞組中，MUC1的表達與預(yù)后無關(guān)，見圖3C。但是臨床分期Ⅲ期和Ⅳ期的卵巢癌患者的亞組中， MUC1低表達組患者總生存時間明顯長于高表達組(P<0.05)，見圖3D。與此類似的是，亞組分析顯示，TP53基因突變是影響患者預(yù)后的危險因素(HR=1.35)。突變組中MUC1基因高表達患者預(yù)后較差，但在TP53基因野生型亞組中，MUC1表達與預(yù)后無關(guān)。見圖3E、3F。

A.GEPIA數(shù)據(jù)庫中MUC1 mRNA水平；B.GSE18520數(shù)據(jù)集中MUC1 mRNA表達水平；C、D.HPA數(shù)據(jù)庫中卵巢癌和正常卵巢組織MUC1蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果

A.無瘤進展生存時間；B.總體生存時間；C.Ⅰ期和Ⅱ期亞組；D.Ⅲ期和Ⅳ期亞組；E.TP53突變型；F.TP53野生型。

2.4 MUC1在卵巢癌中的生物學(xué)功能分析LinkedOmics數(shù)據(jù)庫探索了MUC1引起卵巢癌患者預(yù)后較差的潛在分子機制。GO富集分析顯示MUC1與細胞免疫密切相關(guān)，參與了適應(yīng)性免疫反應(yīng)、體液免疫反應(yīng)等免疫相關(guān)生物學(xué)過程。同時，KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)MUC1與Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路和TNF信號通路等癌癥相關(guān)信號通路相關(guān)，見表1。LinkedOmics數(shù)據(jù)庫中miR-503、miR-499、miR-154和miR-29a等在卵巢癌中可能靶向MUC1，起負向調(diào)控作用，見表2。

表1 卵巢癌中MUC1及其密切相關(guān)基因的GO富集分析和KEGG通路富集分析

2.5MUC1的潛在治療價值Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，MUC1與ELF3、HTR3A、LCN2、CFB及APOL1等表達呈正相關(guān)，與MEST、SALL2、TET1、SMO和C10orf82等表達呈負相關(guān)，見表3。基于MUC1正負相關(guān)基因，CMap分析結(jié)果顯示，褪黑素、納多洛爾和甲芐肼為對卵巢癌具有潛在治療價值的3種小分子藥物，并在PubChem數(shù)據(jù)庫中獲取了上述3種藥物的二維和三維結(jié)構(gòu)，見圖4。

表2 對MUC1表達具有負性調(diào)控作用的miRNA

表3 MUC1最正和最負相關(guān)的5個基因

A.褪黑素；B.納多洛爾；C.甲芐肼

3 討論

MUC1黏蛋白是一種屬于黏蛋白家族的Ⅰ型高度糖化跨膜蛋白，對黏膜起潤滑、保護作用，并且在上皮更新與分化及維持上皮完整性等方面起重要作用[5]。MUC1基因是一種癌基因，研究發(fā)現(xiàn)，其在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌和肝癌中呈現(xiàn)出過表達的狀態(tài)，并且表達水平與腫瘤惡性程度相關(guān)[6-7]。本文從基因表達、臨床預(yù)后、調(diào)控機制等多角度、多層面探究了MUC1在卵巢癌中的表達和臨床意義，為尋找可靠腫瘤標志物和了解卵巢癌惡性過程提供新思路。

MUC1基因表達紊亂，在多種腫瘤類型中普遍存在。Jing等[8]證實MUC1在乳腺癌中異常高表達，且可作為乳腺癌潛在預(yù)后和治療靶點。還有學(xué)者指出，MUC1蛋白著色強度在增生活躍的癌細胞中更明顯，提示MUC1的表達量隨病情加重而增加。對大樣本數(shù)據(jù)進行Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，MUC1高表達患者的無瘤進展時間明顯短于低表達患者。進一步的亞組分析發(fā)現(xiàn)，高臨床分期及TP53突變患者的預(yù)后與MUC1的表達密切相關(guān)。TP53基因編碼p53蛋白，監(jiān)測細胞的分裂，能影響細胞進行DNA修復(fù)，修復(fù)失敗后激活下游基因使細胞凋亡，發(fā)揮抑制腫瘤作用[9]。臨床分期高及TP53基因突變都是卵巢癌患者預(yù)后的高危因素，推測MUC1可能加速卵巢癌的惡性進展使患者的生存時間縮短。

近年來，MUC1在腫瘤免疫領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注。有研究表明，MUC1可以通過和腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞相互作用促進腫瘤細胞的免疫逃逸[10]，MUC1參與到適應(yīng)性免疫、T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和抗原的處理和呈遞等多種免疫過程。通路富集分析顯示，MUC1與NF-κB、TNF等細胞信號通路密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，MUC1可以幫助腫瘤細胞抵抗TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體引起的細胞損傷，參與腫瘤細胞的免疫逃逸，加速癌癥的惡性進程。另外，MUC1可以與NF-κB、p65和轉(zhuǎn)錄因子TWIST等形成復(fù)合物，誘導(dǎo)活化EMT相關(guān)蛋白的表達，促進EMT進程[11]。MUC1胞外區(qū)域的抗MUC1單克隆抗體正在成為包括乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥的治療手段[12]。鑒于MUC1在腫瘤免疫和癌癥相關(guān)通路中的關(guān)鍵作用，MUC1有望成為卵巢癌免疫治療的新靶點。

本研究結(jié)果顯示，miR-512-5p等miRNA與MUC1存在負性調(diào)控關(guān)系，與相關(guān)研究結(jié)果一致[13]。褪黑素和甲芐肼等小分子藥物可以抑制MUC1的表達，對卵巢癌具有潛在的治療價值。褪黑素是松果體分泌的內(nèi)源性藥物，具有抗癌作用，如調(diào)控細胞周期、促進細胞凋亡、抗血管生成、抗炎和抗氧化，還能調(diào)節(jié)各種免疫系統(tǒng)內(nèi)細胞和細胞因子[14]。甲芐肼是一種細胞周期非特異性抗腫瘤藥物，現(xiàn)主要應(yīng)用于霍奇金淋巴瘤和黑色素瘤等多種癌癥的治療中[15]，其抗卵巢癌作用有待于進一步揭示。這些miRNA及小分子藥物的應(yīng)用將為卵巢癌治療提供新思路。

綜上所述，本研究通過多數(shù)據(jù)的聯(lián)合應(yīng)用，多層次、多角度地分析了MUC1在卵巢癌惡性進程中的作用，MUC1基因在卵巢癌中異常高表達并與患者預(yù)后不良相關(guān)，有希望成為卵巢癌靶向治療的新靶點。