安崇佑 趙奕暄 劉彩艷

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一。宮旁侵犯及淋巴轉(zhuǎn)移是其主要轉(zhuǎn)移途徑，與治療、預(yù)后密切相關(guān)。早期宮頸癌(Ⅰ～Ⅱ期)治愈率可達(dá)80%，而Ⅲ期患者治愈率可達(dá)60%[1]。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是宮頸癌主要的致死原因。隨著對(duì)人乳頭瘤病毒(human papillomaviruses,HPVs)與宮頸癌發(fā)病之間的關(guān)系的研究逐步深入，免疫微環(huán)境的改變?cè)贖PVs致宮頸癌的過程中具有舉足輕重的作用。因此，由于免疫發(fā)生是一個(gè)極為復(fù)雜的過程，故勢必有眾多免疫相關(guān)因子在各個(gè)環(huán)節(jié)扮演著不同的角色，找出其中起關(guān)鍵作用的因子理論上可以在早期阻斷、輔助治療及預(yù)防復(fù)發(fā)三個(gè)層面均起到至關(guān)重要的作用，實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早治療、早預(yù)防，或可進(jìn)一步提高宮頸癌的治愈率。本研究應(yīng)用UALCAN數(shù)據(jù)庫對(duì)相關(guān)性篩選功能，對(duì)TCGA中305例宮頸癌樣本進(jìn)行篩選，篩選出對(duì)宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后具有顯著影響的潛在生物標(biāo)志物。同時(shí)，對(duì)不同分期的宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的基因表達(dá)情況、CCR7和SELL基因共表達(dá)情況和生存曲線進(jìn)行比較和分析，探索宮頸鱗狀細(xì)胞癌的潛在生物標(biāo)志物，為宮頸惡性腫瘤的快速診斷和精準(zhǔn)治療奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 用以分析SELL和CCR7表達(dá)關(guān)系的305例宮頸鱗癌患者數(shù)據(jù)均來自UALCAN平臺(tái)(http://ualcan.path.uab.edu)。UALCAN是一個(gè)基于互聯(lián)網(wǎng)的交互式網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，可以用于分析來源于TCGA的轉(zhuǎn)錄組和臨床數(shù)據(jù)。

1.2 方法 通過UALCAN在線工具可以得到腫瘤患者組織中基因的表達(dá)情況、共表達(dá)情況和生存分析等信息，包括箱線圖、基因熱圖和生存曲線[2]。

2 結(jié)果

2.1 CCR7和SELL 在宮頸鱗癌中的表達(dá)情況 宮頸癌患者組的CCR7和SELL基因的表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組。同時(shí)，在不同分期的宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者組中，CCR7和SELL的表達(dá)隨分期進(jìn)展出現(xiàn)先升高后降低的過程，基因表達(dá)的高值出現(xiàn)在Stage2、Stage3兩個(gè)階段。其中SELL的表達(dá)在正常對(duì)照組和Stagel的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)，其余各組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1，表1、2。

圖1 CCR7和SELL 在正常對(duì)照組和宮頸鱗癌患者組中的表達(dá)情況；a CCR7在正常對(duì)照組和宮頸鱗癌患者組中的表達(dá)情況；b SELL在正常對(duì)照組和宮頸鱗癌患者組中的表達(dá)情況；c CCR7在正常對(duì)照組和不同分期宮頸鱗癌患者組中的表達(dá)情況；d SELL在正常對(duì)照組和不同分期宮頸鱗癌患者組中的表達(dá)情況

表1 CCR7和SELL 在正常對(duì)照組和宮頸鱗癌患者組中的表達(dá)情況

表2 CCR7和SELL在正常對(duì)照組和不同分期宮頸鱗癌患者組中的表達(dá)情況

2.2 CCR7和SELL 在宮頸鱗癌中表達(dá)的相關(guān)性 顯示SELL與CCR7在宮頸鱗癌中的表達(dá)具有較強(qiáng)的正相關(guān)性(r=0.84)。SELL高表達(dá)的宮頸癌患者，其CCR7表達(dá)水平也相對(duì)較高，SELL 低表達(dá)患者，其CCR7的表達(dá)水平也較低。從CCR7和SELL 在宮頸鱗癌中表達(dá)相關(guān)性熱圖可以得知，CCR7和SELL位列彼此顯著相關(guān)的基因列表的第一和第二位，反映了這兩個(gè)基因之間緊密的共表達(dá)關(guān)系。這種基因之間的相關(guān)性在發(fā)揮生物學(xué)功能方面很可能存在密切的聯(lián)系。除了CCR7和SELL外，CD6、LY9、IL16、CD27和CD48等基因也存在著較為緊密的互作關(guān)系，但它們之間的相關(guān)程度低于CCR7和SELL。見圖2。

圖2 CCR7和SELL 在宮頸鱗癌中表達(dá)的相關(guān)性結(jié)果；a、b CCR7和SELL 在宮頸鱗癌中表達(dá)的相關(guān)性曲線；c、d CCR7和SELL 在宮頸鱗癌中表達(dá)相關(guān)性熱圖

2.3 CCR7和SELL表達(dá)水平與宮頸鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系 CCR7和SELL表達(dá)水平與宮頸鱗癌患者生存曲線，從圖中可以看出，CCR7高表達(dá)組的生存情況優(yōu)于低表達(dá)組，SELL高表達(dá)組的生存情況優(yōu)于低表達(dá)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。由此可見，CCR7和SELL高表達(dá)患者相較于低表達(dá)患者有更好的生存預(yù)期，反映了CCR7和SELL與宮頸鱗癌患者的生存有著潛在的聯(lián)系。見圖3。

圖3 CCR7和SELL表達(dá)水平與宮頸鱗癌患者生存曲線;a CCR7表達(dá)水平與宮頸鱗癌患者生存曲線；b SELL表達(dá)水平與宮頸鱗癌患者生存曲線

3 討論

宮頸癌作為婦科三大惡性腫瘤之一，仍嚴(yán)重威脅著無數(shù)女性生命。早期宮頸癌術(shù)后病理并不總是符合“理想情況”，一些特殊的病理表現(xiàn)仍提示著可能潛在的轉(zhuǎn)移可能，比如腫瘤大小、浸潤深度以及脈管內(nèi)癌栓等，因此Sedlis標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)運(yùn)而生。于是對(duì)于具有病理高風(fēng)險(xiǎn)的患者，追加放化療常作為補(bǔ)充治療以期達(dá)到降低復(fù)發(fā)、改善預(yù)后的目的。

UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)是一個(gè)生物信息學(xué)中常用的可以有效篩選和分析癌癥信息的平臺(tái)，主要是基于TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫中的癌癥數(shù)據(jù)構(gòu)建的，它可以幫助科研人員實(shí)現(xiàn)對(duì)相關(guān)基因的生物標(biāo)志物鑒定、表達(dá)譜分析和生存分析等功能[3]。TCGA(The cancer genome atlas，癌癥基因組圖譜)由 National Cancer Institute(NCI，美國國家癌癥研究所)和 National Human Genome Research Institute(NHGRI，美國國家人類基因組研究所)于 2006 年聯(lián)合啟動(dòng)的項(xiàng)目，收錄了各種人類癌癥(包括亞型在內(nèi)的腫瘤)的臨床數(shù)據(jù)，基因組變異，mRNA表達(dá)，miRNA表達(dá)，甲基化等數(shù)據(jù)，是癌癥研究者很重要的數(shù)據(jù)來源。通過UALCAN平臺(tái)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)的整合分析，研究人員可以獲得基因表達(dá)分析、共表達(dá)分析和生存分析等數(shù)據(jù)分析結(jié)果，提升了腫瘤生物學(xué)研究的工作效率和研究結(jié)果的可靠性。

SELL(L-selectin，CD62L)是Ⅰ型跨膜凝集素受體，是選擇素家族成員之一，表達(dá)于絕大多數(shù)循環(huán)白細(xì)胞表面的細(xì)胞黏附分子。SELL最著名的作用為誘導(dǎo)T細(xì)胞歸巢，并且通過多種通路發(fā)揮抗腫瘤作用，在多種惡生腫瘤動(dòng)物模型中，CD62L+T細(xì)胞比CD62L-T細(xì)胞可以更高的控制腫瘤細(xì)胞的生長[4，5]。然而，最近H.Angharad Watson等人研究發(fā)現(xiàn)，L-Selectin控制實(shí)體腫瘤細(xì)胞生長并不是來自于對(duì)T細(xì)胞的歸巢作用，而是通過激活腫瘤內(nèi)部的治療性T細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的[5]。這一發(fā)現(xiàn)為研究SELL在惡性腫瘤中的作用提供了新的角度與思路。

CCR7(C-C chemokine receptor 7)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，通常表達(dá)于T細(xì)胞亞組中央記憶細(xì)胞(T-cell subset central memory cell)、胸腺T細(xì)胞、B細(xì)胞和成熟樹突狀細(xì)胞。CCL21和CCL19成組型表達(dá)于淋巴管起始及淋巴結(jié)中，常出現(xiàn)于基質(zhì)細(xì)胞和高內(nèi)皮小靜脈。文獻(xiàn)顯示，CCL19和CCL21二者刺激CCR7可誘導(dǎo)G蛋白活性、EKR 1/2信號(hào)通路、鈣動(dòng)員以及細(xì)胞移行[6]。CCR7/CCL21軸的過表達(dá)主要與腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[7]。同時(shí)，CCR7與包括多重惡性腫瘤進(jìn)展相關(guān)，CCR7高表達(dá)往往意味著更大的腫瘤體積以及更深的組織侵犯。這一點(diǎn)與宮頸癌的臨床病理分期標(biāo)準(zhǔn)相契合。

然而，放化療的副反應(yīng)、副損傷目前愈來愈受到重視，在生存率提高已達(dá)到瓶頸的今天，提高生存質(zhì)量可以從另一方面為患者帶來的巨大收益。盡量避免不必要的放化療是提高生存治療的重要途徑之一。Sedlis不可否認(rèn)在一定程度上解決了補(bǔ)充治療的問題，但此單純從局部病理結(jié)果推測患者潛在淋巴轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)仍存在一定不足。如果可以從循環(huán)系統(tǒng)中尋找可靠的生物標(biāo)志物，多角度、多層次評(píng)估轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，將能夠更加準(zhǔn)確、可靠。

近年來，最新研究證實(shí)了通過檢測循環(huán)中SELL水平來發(fā)現(xiàn)腫瘤的可行性[8]。雖然SELL在宮頸癌中表達(dá)情況研究較少，但其在大腸癌、肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)的研究相對(duì)較成熟，武欣等[9]對(duì)大腸癌患者不同組織中SELL表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)大腸癌組織SELL表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，同時(shí)，伴有淋巴轉(zhuǎn)移者SELL表達(dá)水平會(huì)進(jìn)一步升高。在肺癌中同樣有類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)論[10]。而在婦科腫瘤中亦有人關(guān)注SELL的作用，相關(guān)研究證實(shí)了卵巢癌術(shù)前、術(shù)后以及術(shù)后復(fù)發(fā)、未復(fù)發(fā)患者血清中SELL水平的差異具有顯著性[11]，從而一定程度上證明了其在婦科惡性腫瘤中的潛在意義。

另一方面，CCR7在宮頸癌形成及淋巴轉(zhuǎn)移中也起著至關(guān)重要的作用。高危型人乳頭瘤病毒(human papillomaviruses,HPVs)感染是宮頸癌最主要的致病因素。隨著近年來研究逐漸深入，人們發(fā)現(xiàn)HPV感染的細(xì)胞會(huì)主動(dòng)改變免疫微環(huán)境[12，13]，通過抑制樹突狀細(xì)胞CCR7的誘導(dǎo)作用，損害淋巴結(jié)歸巢趨化因子，進(jìn)而影響到相應(yīng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，CCR7在伴有淋巴轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中呈現(xiàn)明顯高表達(dá)[14]。有研究也發(fā)現(xiàn)CCR7與腫瘤的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15]。本研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)于宮頸癌患者CCR7總體呈高表達(dá)，然而通過不同宮頸癌分期對(duì)實(shí)驗(yàn)組分層比較后不難看出，CCR7表達(dá)在宮頸癌Ⅰ期和Ⅱ期呈明顯遞增趨勢，宮頸癌Ⅲ期患者則升高減緩甚至略有下降趨勢，而在Ⅳ期患者中則明顯下降。雖然宮頸癌被人為分成4個(gè)大的期別，然而宮頸癌發(fā)生發(fā)展的過程是連續(xù)的。最初自發(fā)的免疫增強(qiáng)作用和宮頸癌免疫抑制作用尚可相互制衡，但隨著疾病進(jìn)展，此消彼長，最終實(shí)現(xiàn)免疫逃避。

同時(shí)，SELL的表達(dá)情況與CCR7類似，但不同的是SELL在Ⅳ期宮頸癌患者中仍有較高表達(dá)，甚至在宮頸癌Ⅰ～Ⅳ期中變化不是很大。這說明了二者作用途徑的差異。有學(xué)者提出SELL控制實(shí)體腫瘤細(xì)胞生長并不是來自于對(duì)T細(xì)胞的歸巢作用，而是通過激活腫瘤內(nèi)部的殺傷性T細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的[7]。這一觀點(diǎn)或許可以解釋本研究結(jié)果，宮頸癌以實(shí)體腫瘤為主，可激活的內(nèi)部殺傷性T細(xì)胞理論上應(yīng)與腫瘤體積呈正比，所以，宮頸癌惡化可能無法嚴(yán)重影響來自腫瘤內(nèi)部的潛在殺傷力。這一假設(shè)仍需要進(jìn)一步研究證實(shí)。因此，CCR7和SELL有望成為宮頸癌復(fù)發(fā)監(jiān)測及預(yù)后評(píng)估的有效新指標(biāo)，而且可能成為免疫治療的新靶點(diǎn)。

再者，CCR7和SELL在宮頸鱗癌患者組織樣本中表達(dá)上調(diào)在宮頸癌不同分期中差異的相似性，提示CCR7和SELL在存在一定的互作關(guān)聯(lián)，反映了機(jī)體對(duì)兩種基因在表達(dá)水平上的協(xié)同調(diào)節(jié)，與此相關(guān)的調(diào)控機(jī)制和通路值得進(jìn)一步研究。除了分子水平的表達(dá)上調(diào)和基因互作，CCR7和SELL在機(jī)體表征方面也表現(xiàn)出對(duì)生存預(yù)期的影響，提示CCR7和SELL可能作為判斷宮頸鱗癌患者生存時(shí)間和生存質(zhì)量等預(yù)后情況的重要標(biāo)志物，這也印證了之前討論中的判斷。二者均具有臨床和科研應(yīng)用價(jià)值。

最后，已有學(xué)者提出慢性炎癥會(huì)影響腫瘤的生長[16]。同時(shí)，免疫治療作為新的替換治療方案，在臨床上已經(jīng)在多種惡性腫瘤的治療上已經(jīng)取得了較明顯效果。免疫抑制劑單藥治療復(fù)發(fā)難治性宮頸癌具有較好的安全性，但總體緩解率仍偏低。SELL作為細(xì)胞黏附因子，可以誘導(dǎo)T細(xì)胞歸巢作用，并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的T細(xì)胞的殺傷作用，達(dá)到控制腫瘤細(xì)胞生長的目的[7]，而CCR7在腫瘤免疫微環(huán)境改變中起著至關(guān)重要的作用，對(duì)實(shí)現(xiàn)腫瘤進(jìn)展的早期阻斷有重要意義。

綜上所述，本研究通過對(duì)UALCAN數(shù)據(jù)庫中對(duì)宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后具有顯著影響的基因的分析，篩選出對(duì)疾病的診斷和治療具有潛在價(jià)值的生物標(biāo)志物。結(jié)果顯示，SELL和CCR7的高表達(dá)均能明顯改善宮頸癌患者生存率，因此，它們有可能成為控制宮頸癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移的藥物治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)，并為宮頸惡性腫瘤的防治提供新的思路和借鑒。