黎皆佳 謝海輝 杜笑興

研究表明，麻醉劑、麻醉技術(shù)和其他圍術(shù)期因素是影響惡性腫瘤手術(shù)后長(zhǎng)期轉(zhuǎn)歸的潛在因素，麻醉藥物與腫瘤患者術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有關(guān)[1,2]。七氟醚是一種常用吸入麻醉藥，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的惡性生物學(xué)行為有關(guān)，對(duì)不同癌細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響不同[3]。研究報(bào)道七氟醚可促進(jìn)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移，侵襲和集落形成能力[4]。而有研究報(bào)道七氟醚呈濃度依賴(lài)性抑制肺癌A549細(xì)胞侵襲和遷移[5]。七氟醚通過(guò)上調(diào)miR-203抑制乳腺癌細(xì)胞增殖[6]。七氟醚通過(guò)下調(diào)斯坦尼鈣調(diào)節(jié)蛋白1(stanniocalcin 1，STC1)抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[7]。七氟醚通過(guò)調(diào)節(jié)c-Jun NH2-末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAPK)信號(hào)通路抑制人卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。研究表明，miR-143-3p在卵巢癌組織中表達(dá)水平降低；miR-143-3p上調(diào)顯著抑制了卵巢癌細(xì)胞系SKOV3，ES2和OVCAR3的增殖，遷移和侵襲[9]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)1通過(guò)調(diào)控miR-143-3p/胱抑素B(cystatin B，CSTB)影響卵巢癌細(xì)胞的增殖和凋亡[10]。然而七氟醚是否通過(guò)調(diào)控miR-143-3p影響卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移侵襲和凋亡筆者目前尚未發(fā)現(xiàn)明確結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)旨在研究七氟醚是否通過(guò)調(diào)控miR-143-3p影響卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移侵襲和凋亡，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 組織來(lái)源 選取本院2017年1月至2019年1月經(jīng)病理檢測(cè)為卵巢癌且具有完整臨床病理資料的患者30例，經(jīng)手術(shù)切除癌組織及其癌旁組織，患者手術(shù)前未進(jìn)行過(guò)手術(shù)及放化療，距離癌組織邊緣2～5 cm 處切除的為癌旁組織，所有患者均知情且同意。

1.2 試劑 卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；七氟醚購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；Trizol試劑、RT-qPCR試劑盒購(gòu)自北京麥瑞博生物科技有限公司；MTT試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海圻明生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel購(gòu)自美國(guó)BD公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒購(gòu)自上海研生實(shí)業(yè)有限公司；抗體購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞處理與分組 卵巢癌細(xì)胞SKOV3培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分別用1%、1.5%、2%的七氟醚處理24 h，記為不同濃度七氟醚組；正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組；miR-NC、miR-143-3p轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞中，記為miR-NC組、miR-143-3p組；anti-miR-NC、anti-miR-143-3p轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞后用2%的七氟醚處理，記為2%七氟醚+anti-miR-NC組、2%七氟醚+anti-miR-143-3p組。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)miR-143-3p表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA，以U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。miR-143-3p上游引物序列：5’-GGGGTGAGATGAAGCACTG-3’，下游引物序列：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性 細(xì)胞培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μl的MTT溶液，孵育4 h，每孔加入150 μl DMSO，振蕩反應(yīng)10 min使沉淀溶解，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)吸光度(OD)值。

1.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞調(diào)整密度為5×105個(gè)/ml，上室加入100 μl懸浮液，下室加入600 μl培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定30 min，PBS溶液沖洗2次，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，用PBS輕輕清洗兩次后，然后用倒置顯微鏡拍攝染色細(xì)胞的照片，計(jì)算細(xì)胞遷移數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：Transwell小室的上室加入適量基質(zhì)膠，按上述方法操作，計(jì)算細(xì)胞侵襲數(shù)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h，用預(yù)冷的PBS漂洗2次，用結(jié)合緩沖液重懸，加入10 μl 的Annexin V-FITC和5 μl的PI，混勻后避光孵育10 min；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.8 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，提取總蛋白，定量后煮沸變性；電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再加入一抗4℃孵育過(guò)夜；加入二抗室溫孵育2 h，ECL發(fā)光液顯影，成像后檢測(cè)蛋白條帶的灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 miR-143-3p在卵巢癌組織中的表達(dá) 與癌旁組織比較，卵巢癌組織中miR-143-3p表達(dá)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 miR-143-3p在卵巢癌組織中的表達(dá)

2.2 七氟醚對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響 與對(duì)照組比較，1%、1.5%、2%七氟醚組細(xì)胞活性降低，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)降低，細(xì)胞凋亡率升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達(dá)水平降低，p21、Bax表達(dá)水平升高，且呈劑量依賴(lài)性(P<0.05)。見(jiàn)表2、3，圖1、2。

表2 七氟醚對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

表3 七氟醚對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白的影響

圖1 七氟醚對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞遷移侵襲和凋亡的影響/A 卵巢癌SKOV3細(xì)胞的遷移侵襲(結(jié)晶紫染色×200)；B 細(xì)胞凋亡流式圖

圖2 增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.3 七氟醚對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞中miR-143-3p的影響 與對(duì)照組相比，1%、1.5%、2%七氟醚組miR-143-3p升高，且呈劑量依賴(lài)性(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 七氟醚對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞中miR-143-3p的影響

2.4 上調(diào)miR-143-3p對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-143-3p組miR-143-3p表達(dá)水平升高，細(xì)胞活性降低，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)降低，細(xì)胞凋亡率升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達(dá)水平降低，p21、Bax表達(dá)水平升高(P<0.05)。見(jiàn)表5、6，圖3、4。

表5 上調(diào)miR-143-3p對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

表6 上調(diào)miR-143-3p對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白的影響

圖3 上調(diào)miR-143-3p對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞遷移侵襲和凋亡的影響;A 卵巢癌SKOV3細(xì)胞的遷移侵襲(結(jié)晶紫染色×200)；B 細(xì)胞凋亡流式圖

2.5 下調(diào)miR-143-3p逆轉(zhuǎn)了七氟醚對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響 與2%七氟醚+anti-miR-NC組比較，2%七氟醚+anti-miR-143-3p組細(xì)胞活性升高，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)升高，細(xì)胞凋亡率降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達(dá)水平升高，p21、Bax表達(dá)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表7、8，圖5。

圖4 增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖5 下調(diào)miR-143-3p逆轉(zhuǎn)了七氟醚對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞遷移侵襲和凋亡的影響;A 卵巢癌SKOV3細(xì)胞的遷移侵襲(結(jié)晶紫染色×200)；B 細(xì)胞凋亡流式圖

表7 下調(diào)miR-143-3p逆轉(zhuǎn)了七氟醚對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

表8 下調(diào)miR-143-3p逆轉(zhuǎn)了七氟醚對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白的影響

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)麻醉藥可影響卵巢癌的惡性生物學(xué)行為[11,12]。麻醉藥物或麻醉方法影響腫瘤患者預(yù)后及轉(zhuǎn)歸[13]。研究報(bào)道七氟烷可降低細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)水平，抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲[14,15]。七氟醚可通過(guò)上調(diào)miR-203或miR-34a抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲[16,17]。七氟醚通過(guò)在體外激活缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)抑制頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的惡性生物學(xué)行為[18]。且已有研究報(bào)道七氟醚可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度七氟醚后的SKOV3細(xì)胞中，細(xì)胞活性降低，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)降低，細(xì)胞凋亡率升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達(dá)水平降低，p21、Bax表達(dá)水平升高，且呈劑量依賴(lài)性。表明七氟醚可劑量依賴(lài)性的抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

研究報(bào)道上調(diào)miR-143-3p通過(guò)下調(diào)RalA結(jié)合蛋白1(RalA-binding protein 1，RALBP1)表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]。miR-143-3p還通過(guò)靶向FOS樣抗原2(Fos-like antigen 2，F(xiàn)OSL2)抑制骨肉瘤的增殖，遷移和侵襲[20]。miR-143-3p的上調(diào)通過(guò)靶向Musashi RNA結(jié)合蛋白2(Musashi RNA binding protein 2，MSI2)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞的增殖，侵襲和遷移[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，卵巢癌組織中miR-143-3p表達(dá)水平降低；上調(diào)miR-143-3p抑制了卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖、遷移和侵襲，且促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度七氟醚后的SKOV3細(xì)胞中，miR-143-3p表達(dá)水平升高；而下調(diào)miR-143-3p逆轉(zhuǎn)了七氟醚對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。提示，七氟醚可能通過(guò)影響miR-143-3p的表達(dá)調(diào)控卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡。

綜上所述，七氟醚可通過(guò)上調(diào)miR-143-3p的表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。