李學(xué)思，王 楊，曹振華，詹 勝

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院（酒業(yè)學(xué)院），河南鄭州 450046；2.河南省食品工業(yè)科學(xué)研究所有限公司，河南鄭州 450053；3.河南省宋河酒業(yè)股份有限公司，河南鹿邑 477265）

窖泥質(zhì)量的好壞以及窖泥內(nèi)微生物對(duì)白酒質(zhì)量?jī)?yōu)劣有著極其重要的影響[1]。傳統(tǒng)的濃香型大曲白酒生產(chǎn)方法主要依靠自然接種窖泥，自然馴化，自然老熟[2-3]。生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)濃香型白酒可能需要很長(zhǎng)的時(shí)間。隨著人們對(duì)優(yōu)質(zhì)白酒需求的高速發(fā)展，采用窖泥自然老熟法生產(chǎn)濃香型白酒已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不適應(yīng)社會(huì)的發(fā)展。因此，培養(yǎng)窖泥功能菌并利用其加速窖泥老熟已成為現(xiàn)代企業(yè)的當(dāng)務(wù)之急。

然而，要人為提升窖泥品質(zhì)或人為加速窖泥老熟，其本質(zhì)就是調(diào)整窖泥內(nèi)的微生物結(jié)構(gòu)與分布。對(duì)于白酒企業(yè)而言，研究窖泥微生物群落和窖泥功能菌，實(shí)現(xiàn)窖泥微生物的有效人工干預(yù)調(diào)節(jié)，使窖泥加快轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)質(zhì)窖泥，養(yǎng)護(hù)窖泥并影響其微生物種類(lèi)及含量，是提高窖泥質(zhì)量的關(guān)鍵[4-5]。本項(xiàng)目主要以宋河酒業(yè)不同窖齡濃香型白酒發(fā)酵窖池為研究對(duì)象，通過(guò)感官評(píng)定與氣相色譜分析不同窖池所產(chǎn)出原酒質(zhì)量，探索優(yōu)質(zhì)原酒與窖池主要有益功能微生物的關(guān)系，研究濃香型白酒不同窖齡窖池泥的微生物含量及多樣性對(duì)酒質(zhì)的影響。本課題結(jié)合窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)與酒質(zhì)的優(yōu)劣，對(duì)窖泥窖齡與各窖泥微生物的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，判斷窖泥各類(lèi)微生物對(duì)窖泥的影響。為強(qiáng)化窖池有益微生物，加強(qiáng)窖池養(yǎng)護(hù)提供科學(xué)依據(jù)，為提高產(chǎn)品質(zhì)量打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

原酒取樣：選擇各窖窖底酒醅蒸餾的前50 kg原酒混合樣。

窖池：選擇宋河酒業(yè)窖齡3 年、5 年、10 年具有代表性的窖池，取其窖池中部的窖壁泥及窖池底部的窖底泥，其中窖底泥取窖池底部中心與窖池底部四角（約100 g/份），即五點(diǎn)取樣法，同一窖齡窖池選取4 口窖池。將窖泥均勻混合后立即低溫保存，然后進(jìn)行后續(xù)微生物分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)采用窖泥與酒樣均由宋河酒業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑（表1）

表1 實(shí)驗(yàn)試劑

1.1.3 儀器設(shè)備（表2）

表2 實(shí)驗(yàn)儀器

1.2 培養(yǎng)基配方

1.2.1 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[6]

成分：蛋白胨5 g，牛肉膏1.5 g，氯化鈉1.5 g，瓊脂8.5 g，蒸餾水500 mL，pH7.2。

將除瓊脂外的各類(lèi)成分溶于無(wú)菌蒸餾水中，校正pH 值至7.2，融入瓊脂，分裝于準(zhǔn)備好的燒瓶中，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2.2 YEPD培養(yǎng)基

成分：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂粉。

溶解5 g 酵母膏,10 g 蛋白胨于450 mL 水中，加入10 g 瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌20 min，加入50 mL含10 g葡萄糖的溶液。

1.2.3 PDA培養(yǎng)基

成分：馬鈴薯（去皮）100 g，葡萄糖10 g，瓊脂10 g，水500 mL。

簡(jiǎn)單處理馬鈴薯，然后稱(chēng)取100 g 加入500 mL蒸餾水，煮沸20 min，冷卻后用紗布過(guò)濾，濾液補(bǔ)足水至500 mL，溶解相應(yīng)糖和瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

1.2.4 高氏一號(hào)培養(yǎng)基

成分：可溶性淀粉4 g，KNO20.8 g，NaCl 0.2 g，K2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.004 g，融入瓊脂8 g，蒸餾水400 mL，pH7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。

1.2.5 麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基

將葡萄糖0.5 g，KCl 0.9 g，酵母汁1.25 g，醋酸鈉4.1 g，瓊脂8.5 g，放入蒸餾水500 mL，滅菌30 min，pH值自然。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 平板稀釋計(jì)數(shù)[7-8]

根據(jù)不同微生物生長(zhǎng)習(xí)性的不同，我們針對(duì)不同微生物采用不同培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，選用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為細(xì)菌用培養(yǎng)基，選用YEPD 培養(yǎng)基作為酵母菌用培養(yǎng)基，采用PDA 培養(yǎng)基作為霉菌用培養(yǎng)基，選用高氏一號(hào)培養(yǎng)基作為放線菌用培養(yǎng)基，采用麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基作為芽孢菌用培養(yǎng)基。

取新鮮準(zhǔn)備好的窖泥40 g，放入360 mL 帶有玻璃珠的無(wú)菌蒸餾水中，在30 ℃條件下于搖瓶中振蕩30 min，靜置30 min，然后吸取上清液1 mL，將其混于含有9 mL 無(wú)菌蒸餾水的試管中進(jìn)行稀釋?zhuān)来蜗♂尩?0-4，從適當(dāng)?shù)南♂屢褐腥?00 μL 菌液，涂布在相應(yīng)的平板上，均勻涂布，每個(gè)稀釋度做2 個(gè)平行樣。細(xì)菌選擇10-3～10-4稀釋度進(jìn)行涂布，絲狀真菌選擇10-1～10-2稀釋度進(jìn)行涂布，放線菌選擇10-1～10-2稀釋度進(jìn)行涂布，酵母菌選擇10-1～10-2稀釋度進(jìn)行涂布。在恒溫培養(yǎng)箱中按照各類(lèi)菌種最適溫度倒置培養(yǎng)涂布好的平板樣品。細(xì)菌在35 ℃條件下恒溫培養(yǎng)1～2 d，絲狀真菌在28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)2～3 d，酵母在28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)2～3 d，放線菌在28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)3～4 d。

根據(jù)芽孢菌具有耐熱性，取40 g 新鮮準(zhǔn)備好的窖泥并將它們置入360 mL 含有玻璃珠的無(wú)菌蒸餾水中，置于80 ℃條件下水浴中20 min，置30 ℃條件下振動(dòng)臺(tái)中30 min，靜置30 min 后，吸取1 mL 處理好之后的菌液，將其添加在含有9 mL 無(wú)菌蒸餾水的試管中混合均勻，用相同的方法依次稀釋至10-3，在制備好的醋酸鈉培養(yǎng)基上均勻涂布200 μL稀釋液，均勻涂布后將適當(dāng)?shù)囊后w石蠟注入板中，以密封氧氣。恒溫培養(yǎng)箱控制在35 ℃條件下，在此條件下正置培養(yǎng)剛制作完成的平板。

1.3.2 氣相色譜分析

目前評(píng)定白酒質(zhì)量?jī)?yōu)劣有多種方法，常用的方法主要是感官品評(píng)和理化分析，本實(shí)驗(yàn)理化分析主要以氣相色譜法測(cè)定白酒中己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯四大酯含量[9-11]。

樣品預(yù)處理：白酒樣品采用直接進(jìn)樣法進(jìn)行分析，進(jìn)樣時(shí)取100 μL內(nèi)標(biāo)和5 mL酒樣。

內(nèi)標(biāo)的配制：準(zhǔn)確量取5.00 mL乙酸正丁酯，然后用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液定容至250 mL，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

色譜條件：色譜條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱溫箱升溫程序：40 ℃保持1 min，2 ℃/min 升至70 ℃，然后以4 ℃/min 升溫至160 ℃，再以10 ℃/min 升溫至250 ℃，保持5 min；載氣：99.999%高純度氮?dú)猓d氣流速：1 mL/min，不分流進(jìn)樣。

1.3.3 感官評(píng)定

感官質(zhì)量由具有品酒師職業(yè)資格專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行品評(píng)，對(duì)不同窖齡窖池所產(chǎn)酒樣進(jìn)行感官評(píng)定，以色、香、味、格4 種指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)定；最后匯總評(píng)分結(jié)果，計(jì)算出平均得分。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥微生物數(shù)量變化結(jié)果分析

2.1.1 酵母菌(表3)

表3 不同窖齡窖泥中酵母菌數(shù)量變化（×103cfu/g）

由表3 可以看出：伴隨著窖池窖齡的增長(zhǎng)，窖泥中無(wú)論是池底還是池壁酵母菌總數(shù)也隨之增長(zhǎng)，且窖壁酵母菌數(shù)量增長(zhǎng)速度較池底快。在同一窖齡窖池中，池壁的酵母菌數(shù)量總是高于窖底的酵母菌數(shù)量。無(wú)論是池底酵母菌數(shù)量還是池壁酵母菌數(shù)量都與窖齡呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步表明了隨著窖齡的提升，無(wú)論是池底酵母菌還是池壁酵母菌數(shù)量同時(shí)提升。

2.1.2 細(xì)菌(表4)

表4 不同窖齡窖泥中細(xì)菌數(shù)量變化（×103cfu/g）

由表4 可以看出：隨著不同窖池窖齡的增加，不同窖池窖泥中細(xì)菌的含量也在增高，且同一窖齡池底窖泥細(xì)菌數(shù)量增長(zhǎng)速度高于池壁，池底細(xì)菌總數(shù)基本高于池壁細(xì)菌總數(shù)。無(wú)論是池底細(xì)菌數(shù)量還是池壁細(xì)菌數(shù)量都與窖齡呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步表明了隨著窖齡的提升，無(wú)論是池底細(xì)菌還是池壁細(xì)菌數(shù)量同時(shí)提升。

推測(cè)這是由于窖泥中的環(huán)境由于缺乏氧氣，所以更加符合兼性細(xì)菌和厭氧性細(xì)菌最適生存環(huán)境，隨著窖池的老化和窖齡的不斷增加，窖泥中的缺氧條件使得越來(lái)越多的兼性細(xì)菌和嚴(yán)格厭氧細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，相對(duì)的，一些好氧性細(xì)菌被淘汰[12-13]；窖池底部的含氧量相對(duì)窖壁更低，所以更加適合兼性及厭氧細(xì)菌的生長(zhǎng)，所以窖池底部的細(xì)菌總數(shù)增長(zhǎng)相對(duì)窖壁細(xì)菌總數(shù)較快。

2.1.3 霉菌(表5)

由表5 可以看出：窖泥中的霉菌相對(duì)其他菌類(lèi)含量較少，不同窖齡的窖泥中霉菌隨窖齡變化幅度較小，且同一窖池的不同部位霉菌數(shù)量相差較小。無(wú)論是池底霉菌還是池壁霉菌數(shù)量與窖齡未出現(xiàn)顯著關(guān)聯(lián)性。

表5 不同窖齡窖泥中霉菌數(shù)量變化（cfu/g）

2.1.4 放線菌(表6)

由表6 可以看出：伴隨著窖池窖齡的增長(zhǎng)放線菌含量也在不斷增加，池壁放線菌均多于池底放線菌，且池壁放線菌隨窖齡增長(zhǎng)而增長(zhǎng)速率大于池底放線菌隨窖齡增長(zhǎng)速率。無(wú)論是池底放線菌還是池壁放線菌含量都與窖齡呈顯著正相關(guān)性。進(jìn)一步表明了隨著窖齡的提升，無(wú)論是池底還是池壁放線數(shù)量同時(shí)提升。推測(cè)可能是因?yàn)榉啪€菌以好氧型放線菌為主，最適環(huán)境為含水量較低，具有豐富有機(jī)物的中性或堿性環(huán)境。池壁含水量相對(duì)池底較低，且酸度接近中性，符合放線菌最適環(huán)境，所以同一窖池池壁放線菌相對(duì)池底較高。

2.1.5 芽孢菌(表7)

由表7 可以看出，無(wú)論是好氧芽孢菌還是厭氧芽孢菌，其池底與池壁含量均隨著窖齡的增加而增加。厭氧芽孢菌隨窖齡增長(zhǎng)其增長(zhǎng)速率快于好氧芽孢菌，同一窖池池壁的好氧芽孢菌含量多于池底好氧芽孢菌，同一窖池池壁的厭氧芽孢菌含量少于池底厭氧芽孢菌。無(wú)論在窖池何部位，厭氧芽孢菌和好氧芽孢菌均與窖池窖齡呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性，進(jìn)一步表明了隨著窖齡的提升，無(wú)論是好氧芽孢菌還是厭氧芽孢菌在窖泥中數(shù)量增加。

2.2 原酒質(zhì)量分析

2.2.1 理化分析

根據(jù)窖池窖泥微生物分析結(jié)果，取對(duì)應(yīng)窖池所產(chǎn)兩個(gè)級(jí)別原酒進(jìn)行色譜分析，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 酒樣色譜分析結(jié)果 （g/L）

由表8 可以看出，隨著窖齡的延長(zhǎng)，四大酯的含量呈上升趨勢(shì)，且四大酯中含量最高的為己酸乙酯，濃香型白酒的香氣成分以己酸乙酯為主要成分，己酸乙酯含量的增長(zhǎng)有益于塑造濃香型白酒酒香的典型性。而乳酸乙酯含量一般是低于己酸乙酯的，適當(dāng)濃度乳酸乙酯能夠使白酒呈現(xiàn)糟香味，口感綿軟柔和，但若含量過(guò)多時(shí)，則白酒會(huì)呈現(xiàn)出苦澀和不爽的口感，香氣受到抑制呈現(xiàn)悶感。

2.2.2 感官品評(píng)

取對(duì)應(yīng)窖池所產(chǎn)調(diào)味酒和優(yōu)級(jí)酒，對(duì)所產(chǎn)基酒進(jìn)行感官嘗評(píng)[14]，由5 位國(guó)家級(jí)品酒師和10 位省級(jí)品酒師根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[15-16]進(jìn)行共同品評(píng)打分，從香氣、口感、風(fēng)格等方面進(jìn)行綜合評(píng)定，結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 酒樣感官評(píng)定結(jié)果

由表9 感官評(píng)定結(jié)果能夠看出：隨著窖池窖齡的提升，窖池所產(chǎn)原酒的感官質(zhì)量呈上升趨勢(shì)，主要原因是隨著窖池窖齡的提升，窖池窖泥內(nèi)微生物數(shù)量及分布發(fā)生變化，從而使窖池所產(chǎn)原酒品質(zhì)更加醇厚豐滿。

3 結(jié)論

窖池窖泥中富含多種微生物并形成了一個(gè)復(fù)雜且豐富的微生物生態(tài)系統(tǒng)，窖池窖泥在窖池窖齡增長(zhǎng)的過(guò)程中由于受到內(nèi)在或外在各種不同因素的影響，窖池窖泥中各種微生物在窖泥中的含量和分布也在發(fā)生變化，窖池隨著窖泥內(nèi)微生物的變化所產(chǎn)原酒的品質(zhì)同時(shí)會(huì)發(fā)生改變。

3.1 通過(guò)對(duì)宋河酒業(yè)窖池窖泥微生物進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著窖池窖齡的增加，窖池酵母菌含量、細(xì)菌含量和放線菌含量無(wú)論其池底還是池壁均隨窖池窖齡而增長(zhǎng)，同一窖齡窖池酵母菌和放線菌含量窖池池壁多于窖池池底，窖池池壁細(xì)菌含量少于窖池池底；霉菌在窖池中含量較少，隨窖池窖齡變化不明顯；窖池池底和窖池池壁好氧芽孢菌和厭氧芽孢菌含量均隨窖池窖齡增長(zhǎng)而增高，厭氧芽孢菌隨窖齡增長(zhǎng)速率快于好氧芽孢菌，同一窖齡窖池好氧芽孢菌窖池池壁含量多于窖池池底，厭氧芽孢菌窖池池壁含量少于窖池池底；除霉菌外其他菌種均與窖池窖齡呈顯著正相關(guān)性。

3.2 對(duì)不同窖齡窖池所產(chǎn)原酒質(zhì)量進(jìn)行感官品評(píng)和理化分析等綜合評(píng)定，白酒中主要風(fēng)味物質(zhì)隨著窖池窖齡的增長(zhǎng)而提高，其感官質(zhì)量也隨著窖池窖齡的延長(zhǎng)而明顯提高。

3.3 比對(duì)窖泥微生物的變化與所產(chǎn)原酒質(zhì)量，隨著窖池窖齡的提升，窖池內(nèi)窖泥所含放線菌、細(xì)菌、酵母菌、芽孢菌等主要功能菌的數(shù)量有所增加，所產(chǎn)原酒質(zhì)量也呈明顯提高趨勢(shì)，說(shuō)明原酒質(zhì)量與窖池窖齡以及窖池泥中有益功能菌數(shù)量成正相關(guān)。窖池窖泥中放線菌、細(xì)菌、酵母菌以及芽孢菌這4類(lèi)菌種在窖泥中的數(shù)量分布在一定程度上可以作為衡量該窖池窖泥是否達(dá)到成熟的標(biāo)志，這為進(jìn)一步研究窖池窖泥中各有益菌種、窖池養(yǎng)護(hù)以及人工培養(yǎng)窖泥供了理論依據(jù)。