李佳 任文娟 高春燕 賀金娥 姜華

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，陜西 延安 716000)

嬰兒腸絞痛是功能性胃腸道疾病(FGIDs)的早期表現(xiàn)之一，也是3個月以下嬰兒的常見病，發(fā)病率高達(dá)20%[1]。典型的癥狀表現(xiàn)為突然發(fā)作且不易安撫的劇烈哭鬧，常伴有陣發(fā)性的肢體動作以及大量的排氣。研究[2]表明，腸絞痛隨著嬰兒的生長常常在3個月之后消失，但是其可與某些長期的功能性胃腸道疾病有關(guān)。相關(guān)研究[3-4]表明，改善腸道菌群組成和服用益生菌對腸絞痛和腸易激綜合征有治療效果。益生菌治療的的作用機(jī)制包括干擾腸道菌群的生長和活性以及增強(qiáng)粘膜屏障功能和粘膜免疫系統(tǒng)。本文主要探討嬰兒腸絞痛是否引起腸道菌群組成變化以及是否關(guān)聯(lián)某些免疫標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年5月至2018年5月在本院就診的96名嬰兒腸絞痛患兒作為實驗組，采用包括鼠李糖乳酸桿菌(LGG)作為益生菌的介入治療，另選取46名健康嬰兒為對照組。實驗組患兒，男54例,女42例，日齡(37±9)d，順產(chǎn)75例出生體重(3 521±473)g，出生身高(49±3)cm，母乳喂養(yǎng)63例、人工喂養(yǎng)33例，新生兒評分-5分鐘(9±0.8)，家族有過敏史87例、圍產(chǎn)期抗生素暴露45例、發(fā)病日齡<14 d 18例、首次抗生素使用<28 d 12例、首次使用益生菌<28 d 12例；對照組嬰兒日齡(37±9)d，順產(chǎn)32例出生體重(3 701±592)g，出生身高(49±3)cm，母乳喂養(yǎng)16例、人工喂養(yǎng)30例，新生兒評分-5分鐘(9±0.6)，家族有過敏史28例、圍產(chǎn)期抗生素暴露10例、發(fā)病日齡<14 d 0例、首次抗生素使用<28 d 0例、首次使用益生菌<28 d 0例。納入患兒均通過電話交談或當(dāng)面問診時，監(jiān)護(hù)人描述嬰兒哭鬧或煩躁每天持續(xù)≥3 h，每周≥3 d有癥狀發(fā)作或持續(xù)4周以上者；24 h內(nèi)哭鬧和煩躁時間≥3 h；臨床表現(xiàn)為陣發(fā)性腹痛，呈突然發(fā)作狀；患兒監(jiān)護(hù)人均知情同意。已排除急腹癥患兒、腹痛型癲癇或其他疾病所致腹痛。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2血液樣品的采集處理 收集參與本研究嬰兒3～5周齡時的外周靜脈血樣。所有血樣均在益生菌干預(yù)實驗開始前進(jìn)行，將全血樣品收集在EDTA管中并離心，保存血清-70℃留用。分析測定前，先解凍血清樣品，然后以3 000 g離心10 min。取上清液，使用Merck Millipore測定試劑盒檢測其細(xì)胞因子和趨化因子(IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、MCP-1、MIP-1β、TNF-α)的濃度。使用Luminex 200系統(tǒng)進(jìn)行分析，用xPONENT3.1軟件計算細(xì)胞因子和趨化因子濃度。批內(nèi)變異系數(shù)為1.8%。通過酶聯(lián)免疫吸附測定(R&D Systems ELISA試劑盒)測定趨化因子CXCL16濃度，通過Zonulin ELISA試劑盒測定連蛋白(Zonulin)濃度以及通過Hycult Biotech ELISA試劑盒測定腸細(xì)胞損傷生物標(biāo)志物I-FABP的濃度。批內(nèi)變異系數(shù)均<3.4%。所有的血清樣品都進(jìn)行了三組平行測定。

1.3糞便樣品采集處理 在鼠李糖乳酸桿菌(LGG)干預(yù)之前，從腸絞痛患兒的尿布中取出糞便樣品并轉(zhuǎn)移到-20℃且在24 h內(nèi)將儲存在-70℃留用。對樣品進(jìn)行預(yù)處理，通過InviMag Stool DNA試劑盒(Stratec Molecular)和Thermo Fisher Scientific KingFisher Flex全自動磁珠提取純化系統(tǒng)提取DNA。提取的DNA樣品儲存在-20℃留用。將上述提取的DNA采用定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)來研究的腸道菌群組成與嬰兒腸絞痛的關(guān)聯(lián)。從Saureus、Ecoli、Bbifidum、Badolescentis、Bcatenulatum、Bbreve、Binfantis、Bdentium、Blactis、Bacteroidesfragilis、Blongum、Cdifficile、Ccoccoides、Cperfringens及Cleptum等菌株的菌株懸浮液中提取的DNAs作為qPCR的定量標(biāo)準(zhǔn)品，用以對糞便樣品中提取的DNAs進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒別和定量。用實時Roche Light Cycler 480Ⅱ熒光定量PCR(Roche)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和定量檢測。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，連續(xù)變量表示為平均值，取95%置信區(qū)間或標(biāo)準(zhǔn)偏差及分類值的數(shù)量和比例。通過卡方檢驗分類變量，正態(tài)分布連續(xù)變量的獨(dú)立樣本t檢驗或非正態(tài)分布連續(xù)變量的Mann-WhitneyU檢驗比較研究組之間的差異。采用Spearman檢測其相關(guān)性，采用逐步回歸法對單因素分析中具有顯著性意義變量進(jìn)行線性回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1免疫標(biāo)記物的分析 與對照組相比，實驗組血清中MIP-1β、MCP-1、IL-8和I-FABP濃度差異性顯著(P<0.05)；實驗組血清中的TNF-α濃度高于對照組(P<0.05)。兩組的I-FABP、IL-1β、CXCL16、IL-6、IL-10、IFN-γ和連蛋白的各濃度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。糞便樣品中的的Cleptum菌群水平與促炎標(biāo)志物MIP-1β、MCP-1、TNF-α呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。雙歧桿菌亞群)水平與CXCL 16呈正相關(guān)(P<0.05)，而球形梭菌群水平與MCP-1呈負(fù)相關(guān)。其他免疫生物標(biāo)志物和腸道菌群水平之間無顯著相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1 兩組血清中免疫腫瘤標(biāo)志物的濃度

2.2多元線性回歸分析 以腸道菌群水平作為因變量，采用多元線性回歸將單因素分析中具有統(tǒng)計學(xué)意義指標(biāo)作為調(diào)整變量一起納入分析，結(jié)果顯示，MIP-1β與腸道菌群水平呈現(xiàn)正相關(guān)，TNF-α與腸道菌群水平呈正相關(guān)，而IL-8、MCP-1和I-FABP與腸道菌群水平無顯著統(tǒng)計學(xué)相關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 腸道菌群水平相關(guān)因素多元線性回歸分析

3 討 論

在嬰兒發(fā)育的關(guān)鍵階段，腸道菌群失衡與低度全身性炎癥將一起誘導(dǎo)免疫和代謝表型的持久改變，并且可能增加在以后生活中發(fā)展非傳染性疾病的風(fēng)險[5-6]。已有研究[7]證實，患有腸絞痛的嬰兒糞便中鈣防衛(wèi)蛋白濃度有所升高，表明這與小腸炎癥有關(guān)。研究[8-9]表明，腸絞痛患兒在生后早期菌群多樣性缺乏，乳酸菌水平低下，影響腸道脂肪酸合成，并且更多定植了產(chǎn)氣的艱難梭菌屬、大腸桿菌屬和克雷伯菌屬，因此，腸道菌群改變是一個潛在的重要因素，也成為益生菌治療的理由之一。早期有研究[10]表明，Cleptum和Cccocoides菌群可能在通過誘導(dǎo)、擴(kuò)增和調(diào)節(jié)T細(xì)胞來維持腸道菌群平衡和促進(jìn)免疫系統(tǒng)成熟方面發(fā)揮重要作用；此外動物模型實驗證實了口服特定梭菌屬菌株(Clostridiumspp.)可以減輕結(jié)腸炎和過敏性腹瀉型疾病，而糞便樣本Cleptum菌群的低水平與哮喘和炎性腸病相關(guān)。

本文免疫標(biāo)記物的分析結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組血清中MIP-1β、MCP-1、IL-8和I-FABP濃度差異性顯著；實驗組血清中的TNF-α濃度也高于對照組。兩組的I-FABP、IL-1β、CXCL16、IL-6、IL-10、IFN-γ和連蛋白的各濃度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。糞便樣品中的的Cleptum菌群水平與促炎標(biāo)志物MIP-1β、MCP-1、TNF-α呈負(fù)相關(guān)。雙歧桿菌亞群水平與CXCL 16呈正相關(guān)，而球形梭菌群水平與MCP-1呈負(fù)相關(guān)。其他免疫生物標(biāo)志物和腸道菌群水平之間無顯著相關(guān)性?；貧w分析顯示，MIP-1β與腸道菌群水平呈現(xiàn)正相關(guān)，TNF-α與腸道菌群水平呈正相關(guān)，而IL-8、MCP-1和I-FABP與腸道菌群水平無顯著統(tǒng)計學(xué)相關(guān)。

綜上所述，本研究的結(jié)果可支撐特定的菌群在嬰兒期可能發(fā)揮著有益的免疫調(diào)節(jié)作用這一理論。本研究結(jié)果還表明，不同于常規(guī)益生菌，Cleptum和Ccoccoides可能具有抗炎特性并有助于減輕與腸絞痛相關(guān)的炎癥和癥狀，因此該菌株的開發(fā)可以作為新型益生菌的發(fā)展方向。功能性胃腸疾病存在著腸道菌群紊亂，腸道菌群多樣性發(fā)生變化，這些變化或許是原因，或許是結(jié)果。臨床上，依據(jù)菌株特異性，及時、足量、合理補(bǔ)充益生菌制劑，有利于兒童胃腸道疾病的康復(fù)。