姚 嘉，李冠喬，楊時(shí)平，蘇慧鑾

1.海南省人民醫(yī)院乳腺外科，海南 ?？?570311；

2.海南省人民醫(yī)院放療科，海南 ?？?570311；

3.海南省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，海南 ?？?570311

乳腺癌是發(fā)生于女性的常見(jiàn)癌癥，美國(guó)每年有25萬(wàn)多例新發(fā)病例和4萬(wàn)多例死亡病例［1-2］。目前，手術(shù)切除、化療或放療仍然是乳腺癌的主要治療方法［3］。然而，這些治療方法不能有效地抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移，這被認(rèn)為是乳腺癌患者死亡的主要原因［4-5］。此外，許多患者確診時(shí)已為癌癥晚期，這在很大程度上限制了這種疾病的治療［6］。因此，了解乳腺癌進(jìn)展的機(jī)制至關(guān)重要。最近，高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法已經(jīng)確定了許多與癌癥進(jìn)展相關(guān)的異常表達(dá)蛋白編碼基因和非編碼基因［7-9］。

微小RNA（micro RNA，miRNA）是含有18～22個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，其可以通過(guò)靶向信使RNA（messenger RNA，mRNA）進(jìn)行切割或抑制翻譯進(jìn)而導(dǎo)致其同源靶基因的沉默［10］。miRNA具有促癌或抑癌的作用。miRNA在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)譜非常不同，并且miRNA與特定的臨床生物學(xué)特征相關(guān)［11］。miRNA表達(dá)譜分析已經(jīng)用來(lái)揭示人類乳腺癌中特有的miRNA的特征。應(yīng)用miRNA微陣列技術(shù)研究［12］發(fā)現(xiàn)，人miR-99a可抑制乳腺癌的進(jìn)展，miR-99a在乳腺腫瘤組織中的表達(dá)與癌旁正常組織相比表達(dá)下調(diào)。

本研究計(jì)劃從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取測(cè)序數(shù)據(jù)，進(jìn)而構(gòu)建乳腺癌中miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)對(duì)miRNA靶點(diǎn)的分析，構(gòu)建與乳腺癌進(jìn)展相關(guān)的miRNA-Hub mRNA網(wǎng)絡(luò)，最終進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)下載及差異miRNAs的篩選

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載乳腺癌相關(guān)miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)，使用R語(yǔ)言中的DEM Limma包鑒定癌組織和正常組織間的差異miRNA。

1.2 差異miRNA靶基因的預(yù)測(cè)

miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://mirdb.org/）是一個(gè)用于miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和功能注釋的在線數(shù)據(jù)庫(kù)，其中的所有靶點(diǎn)都是由一個(gè)生物信息學(xué)工具miRTarget預(yù)測(cè)的。miRTarget是通過(guò)分析高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)中數(shù)千個(gè)miRNA靶點(diǎn)的相互作用而開(kāi)發(fā)的。miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)（http://mirtarbase.cuhk.edu.cn/php/index.php）已經(jīng)積累了36萬(wàn)多個(gè)miRNA-靶點(diǎn)相互關(guān)系，通常收集的miRNA-靶點(diǎn)相互關(guān)系通過(guò)報(bào)告基因分析、蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）、微陣列和測(cè)序?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)（http://starbase.sysu.edu.cn/）是一個(gè)開(kāi)源平臺(tái)，可用于研究miRNA-mRNA相互作用，本研究使用這3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)查找差異miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因，并將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶基因取交集，將交集靶基因作為最終的研究對(duì)象。

1.3 靶基因的基因本體（Gene Ontology，GO）及京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析

GO數(shù)據(jù)庫(kù)把基因的功能分成3個(gè)部分，分別是細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物學(xué)過(guò)程（biological process,BP）。利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)，可以得到目標(biāo)基因在CC、MF和BP三個(gè)層面上主要與什么有關(guān)。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因的功能及其參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行注釋。本研究使用R語(yǔ)言中的ClusterProfiler包對(duì)交集靶基因進(jìn)行富集分析。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析及Hub基因的篩選

使用String（https://string-db）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI分析，之后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.2軟件進(jìn)行可視化構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，并使用Cytoscape 3.6.2軟件的CytohHubba插件篩選該網(wǎng)絡(luò)圖中的前10位基因，并繪制miRNA-Hub基因網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.5.1 實(shí)驗(yàn)材料

人乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A，以及人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDAMB-453、SV40T轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，DMEM/F12培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)、L15培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司（貨號(hào)：11320033、12800082、11415064），TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司（貨號(hào)15596026），PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR染料法熒光定量試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司（貨號(hào)：RR036A、RR82LR），LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司（貨號(hào)：11668-019），micrON hsa-miR-98-5p mimic（5 nmol）、micrOFFhsa-miR-98-5p inhibitor（5 nmol）均購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)miR10000096-1-5、miR20000096-1-5），Annexin Ⅴ-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司（貨號(hào)：640914），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）、結(jié)晶紫水溶液均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司（貨號(hào)：CA1210、G1064），吉姆薩染色液（Giemsa）購(gòu)自上海創(chuàng)賽科技有限公司（貨號(hào)：PM10631），pGL4.10質(zhì)粒、pRL-SV40質(zhì)粒、Dual-Glo Luciferase Assay System（貨號(hào)E2920）均購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.5.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將MCF-10A細(xì)胞培養(yǎng)于含1%非必需氨基酸、5%硫酸乙酰肝素、10 μg/mL胰島素、20 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子、100 ng/mL霍亂毒素、0.5 μg/mL氫化可的松、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中。將HEK-293T、MCF7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中。將MDA-MB-231、MDA-MB-453細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的L15培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞均在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測(cè)hsa-miR-98-5p和DKK3的表達(dá)

采用T R I z o l 一步法提取總R N A，使用PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR Green RTFQPCR試劑盒的說(shuō)明書(shū)建立終體積為20 μL的PCR體系。PCR熱循環(huán)參數(shù)設(shè)置為：95 ℃、5 min，然后進(jìn)行3步反應(yīng)：94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，反應(yīng)進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。引物對(duì)由Primer Premier Software 5.0（美國(guó)Premier Biosoft International公司）設(shè)計(jì)并合成，在ABI 7500系統(tǒng)進(jìn)行RTFQ-PCR。實(shí)驗(yàn)以GAPDH和U6作為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

表1 基因引物序列Tab.1 Gene primer sequence

1.5.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和凋亡分析

細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1天，將細(xì)胞接種于96孔板中，接種密度為1×106個(gè)細(xì)胞/孔，待細(xì)胞密度達(dá)到50%～80%時(shí)，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將miR-NC mimics、miR-98-5p mimics、miR-NC inhibitor和miR-98-5p inhibitor轉(zhuǎn)染于細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞并用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）沖洗2次。將細(xì)胞與500 μL預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液和5 μL Annexin Ⅴ-FITC混合，室溫避光溫育15 min，于上機(jī)前5 min加入2.5 μl PI，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

由于每個(gè)國(guó)家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展實(shí)際和財(cái)政收支計(jì)劃不同，因此國(guó)債的發(fā)行規(guī)模也有很大差異。我國(guó)改革開(kāi)放至今，經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)迅速，其中，國(guó)債的發(fā)行在我國(guó)基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)、項(xiàng)目資金籌集以及產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整過(guò)程中都起著非常重要的作用，但同時(shí)，由于我國(guó)的特色社會(huì)主義道路是符合我國(guó)國(guó)情、難以被復(fù)制的發(fā)展道路。因此，在評(píng)估我國(guó)國(guó)債規(guī)模和現(xiàn)狀時(shí)，應(yīng)當(dāng)結(jié)合我國(guó)的經(jīng)濟(jì)實(shí)際，而不是片面地進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析。

1.5.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

實(shí)驗(yàn)前1 d，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF7細(xì)胞以1000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中，并將細(xì)胞置于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第2天轉(zhuǎn)染miR-NC mimics、miR-98-5p mimics、miR-NC inhibitor和miR-98-5p inhibitor，轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72和96 h后，向培養(yǎng)孔內(nèi)加入10 μL CCK-8溶液，于37 ℃溫育1 h，用酶標(biāo)儀于450 nm下檢測(cè)吸光度（D）值，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.5.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔500個(gè)細(xì)胞，并設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。細(xì)胞置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每3 d更換1次培養(yǎng)基，培養(yǎng)15 d后，培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基上清液，使用4 ℃預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2～3次，加純甲醇5 mL室溫固定15 min后，PBS清洗3次，加適量Giemsa染色液染色15 min，用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥，拍照留存。在顯微鏡（低倍鏡）下計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。計(jì)算克隆形成率。將對(duì)照組的克隆形成率設(shè)為100%，其余組別與對(duì)照組比較。

1.5.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC mimics、miR-98-5p mimics、miR-NC inhibitor和miR-98-5p inhibitor后，每組取1×105個(gè)細(xì)胞重懸于500 μL無(wú)血清培養(yǎng)基中，并置于transwell板的上室中，下室中加入2 mL完全培養(yǎng)基，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，擦去上層細(xì)胞，侵入的下層細(xì)胞用甲醛固定，并用0.1%結(jié)晶紫溶液染色。在顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)獨(dú)立的視野。

全基因合成DKK3野生型與突變型3’非翻譯區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR），之后插入pGL4.10質(zhì)粒中，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后，提取質(zhì)粒備用。HEK-293T細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后，按照LipofectamineTM2000試劑說(shuō)明書(shū)將miR-98-5p mimics或miR-NC mimics（50 nmol/L）與DKK3野生型或突變型質(zhì)粒（0.5 μg）及10 ng pRL-SV40海腎熒光素酶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，采用Dual-Glo Luciferase Assay System進(jìn)行檢測(cè)，具體操作為：從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，恢復(fù)至室溫（20～25 ℃），加入Dual-Glo試劑，室溫溫育10～120 min，檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性；加入Dual-Glo終止反應(yīng)液和Glo試劑，再次室溫溫育10～120 min，采用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)海腎熒光素酶活性。相對(duì)熒光素酶活性=螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩兩比較應(yīng)用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異miRNAs篩選

將處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，其篩選的標(biāo)準(zhǔn)值設(shè)定為|log2(FC)|＞4，P＜0.05。之后得到兩個(gè)差異miRNAs，分別為hsa-miR-133b和hsa-miR-98-5p，且兩個(gè)差異miRNAs均上調(diào)（表2）。

表2 差異miRNAsTab.2 Differential miRNAs

2.2 差異miRNAs靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果分析

在miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得到1574個(gè)靶基因，在miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得到863個(gè)靶基因，在StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得到3993個(gè)靶基因。將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到的靶基因取交集后，結(jié)果顯示，2個(gè)差異miRNAs共有278個(gè)靶基因（圖1），將結(jié)果繪制成miRNA-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。

圖2 miRNA-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 miRNA-target network

2.3 靶基因GO和KEGG通路分析結(jié)果

對(duì)靶基因進(jìn)行富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靶基因未富集到MF，其中BP主要富集于positive regulation of cell cycle process、cellular response to amyloid-beta和positive regulation of cell cycle等，CC主要富集于transferase complex、transfering phosphorus-containing groups、heterochromatin和protein kinase complex等。KEGG通路富集分析顯示，主要富集在microRNAs in cancer、signaling pathways regulating pluripotency of stem cells、FoxO signaling pathways和Wnt signaling pathways（圖3）。

圖3 靶基因GO分析和KEGG分析結(jié)果圖Fig.3 Results of GO analysis and KEGG analysis of target gene

2.4 Hub基因篩選及miRNA-Hub基因網(wǎng)絡(luò)圖繪制結(jié)果分析

使用String數(shù)據(jù)庫(kù)得到靶基因PPI數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行可視化（圖4），篩選Hub前10位基因，得到的前10位Hub基因包括DKK1、WIF1、WNT2B、WNT6、DKK3、DVL3、SFRP1、SFRP5、DKK2和FZD3（圖5A），繪制的miRNA-Hub基因網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，hsa-miR-133b和hsa-miR-98-5p共同作用于DKK3基因，且作用于hsa-miR-98-5p的Hub基因較多（圖5B），以上結(jié)果提示hsa-miR-98-5p/DKK3軸可能在乳腺癌的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此，本研究選擇hsamiR-98-5p/DKK3信號(hào)軸進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 靶基因PPI分析結(jié)果圖Fig.4 PPI analysis results of target gene

圖5 前10位Hub基因篩選網(wǎng)絡(luò)圖和miRNA-Hub基因網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Top 10 Hub gene screening network and miRNA-Hub gene network

2.5 Hsa-miR-98-5p在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及其對(duì)DKK3表達(dá)的影響

在人正常乳腺細(xì)胞和人乳腺癌細(xì)胞系中檢測(cè)hsa-miR-98-5p的表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常乳腺細(xì)胞相比，乳腺癌細(xì)胞系中hsa-miR-98-5p的表達(dá)水平均升高，且MCF-7細(xì)胞系升高的水平較高（圖6A），后期實(shí)驗(yàn)均在MCF-7細(xì)胞上進(jìn)行。過(guò)表達(dá)hsa-miR-98-5p后，DKK3表達(dá)下降；干擾hsamiR-98-5p后，DKK3表達(dá)上升，說(shuō)明hsa-miR-98-5p與DKK3存在負(fù)性調(diào)控關(guān)系，DKK3可能為hsamiR-98-5p的下游靶基因（圖6B）。

圖6 Hsa-miR-98-5p在人正常乳腺細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及其對(duì)DKK3表達(dá)的影響Fig.6 Expression of hsa-miR-98-5p in human normal breast cells and breast cancer cell lines and its effect on DKK3 expression

2.6 Hsa-miR-98-5p對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡、增殖、遷移的影響

細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果表明，與NC對(duì)照組比較，hsa-miR-98-5p的過(guò)表達(dá)顯著抑制MCF-7細(xì)胞凋亡，hsa-miR-98-5p的干擾促進(jìn)細(xì)胞凋亡（圖7A、7B）。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與NC對(duì)照組比較，hsa-miR-32-5p的過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖，hsa-miR-98-5p的干擾使細(xì)胞增殖能力顯著下降（圖7C）。平板克隆實(shí)驗(yàn)表明，與NC對(duì)照組比較，hsa-miR-98-5p的過(guò)表達(dá)能夠顯著增加MCF-7細(xì)胞克隆形成率，hsa-miR-98-5p的干擾使MCF-7細(xì)胞克隆形成率下降（圖7D）。Transwell實(shí)驗(yàn)表明，與NC對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)hsa-miR-98-5p的MCF-7細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，hsa-miR-98-5p的干擾使MCF-7細(xì)胞侵襲能力下降（圖7E）。

圖7 hsa-miR-98-5p對(duì)MCF7細(xì)胞凋亡、增殖、遷移的影響Fig.7 Effect of hsa-miR-98-5p on apoptosis,proliferation and migration of breast cancer cells

2.7 DKK3和hsa-miR-98-5p的結(jié)合驗(yàn)證

根據(jù)Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果，DKK3和hsa-miR-98-5p有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其具體序列詳見(jiàn)圖8A。通過(guò)熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了野生型及突變型重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果表明，共轉(zhuǎn)WT-DKK3和hsamiR-98-5p的細(xì)胞熒光素酶報(bào)告基因的活性較其他組明顯降低（P＜0.01），而共轉(zhuǎn)hsa-miR-98-5p和MUT-DKK3組的熒光素酶活性與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），證實(shí)hsa-miR-98-5p可直接作用于WT-DKK3（圖8B）。

3 討 論

目前，乳腺癌進(jìn)展的確切分子機(jī)制尚未完全闡明，miRNA的發(fā)現(xiàn)和鑒定可能會(huì)為癌癥研究開(kāi)辟一條新的途徑。有研究［13］顯示，miRNA-382-5p/MXD1軸與乳腺癌進(jìn)展相關(guān)，并促進(jìn)細(xì)胞惡性表現(xiàn)。miRNA通過(guò)靶向FOXO3影響乳腺癌的進(jìn)展［14］，miRNA-99a靶向FGFR3抑制乳腺癌進(jìn)展［15］。高通量生物檢測(cè)技術(shù)可以同時(shí)獲得癌癥發(fā)生過(guò)程中大量基因的表達(dá)信息。通過(guò)生物信息學(xué)的方法分析這些基因表達(dá)信息，可以了解活細(xì)胞中的生物分子及其相互作用，從而確定疾病發(fā)生的關(guān)鍵因素，為臨床治療中的靶向設(shè)計(jì)提供參考［16］。

本研究通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析乳腺癌相關(guān)的miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)，得到兩個(gè)差異miRNAs，分別為hsa-miR-133b和hsa-miR-98-5p。通過(guò)對(duì)差異miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，共獲得靶基因278個(gè)。進(jìn)一步對(duì)靶基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析，發(fā)現(xiàn)靶基因大多富集在癌癥相關(guān)的途徑中。結(jié)合String和Cytoscape，鑒定出PPI網(wǎng)絡(luò)中前10位的Hub基因，并構(gòu)建miRNA-Hub基因網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)靶向hsa-miR-98-5p的基因較多，且Hub基因中DKK3同時(shí)靶向hsa-miR-133b和hsa-miR-98-5p，因此對(duì)hsa-miR-98-5p/DKK3軸進(jìn)行進(jìn)一步研究。

研究［17-18］表明，hsa-miR-98-5p在人類癌癥中的作用有爭(zhēng)議，其可以作為抑癌基因或癌基因發(fā)揮作用。研究［17］顯示，hsa-miR-98-5p下調(diào)可通過(guò)反向調(diào)節(jié)MAP4K4的表達(dá)促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌的進(jìn)展，表明hsa-miR-98-5p具有腫瘤抑制作用。相反，Wang等［18］的研究顯示，hsa-miR-98-5p在上皮性卵巢癌中表達(dá)增強(qiáng)，并且調(diào)節(jié)癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。DKK3是DKK家族的一員，被廣泛地認(rèn)為具有腫瘤抑制作用［19］，有研究［20］報(bào)道，DKK3基因的缺失會(huì)促進(jìn)基底細(xì)胞樣乳腺癌的發(fā)生。

基于以上分析，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了hsamiR-98-5p/DKK3軸在乳腺癌中的存在。首先，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-98-5p在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)增加，這與之前的生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。此外，利用熒光素酶活性報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證hsa-miR-98-5p與DKK3的結(jié)合作用，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-98-5p降低了攜帶WT-DKK3的乳腺癌細(xì)胞的熒光素酶活性，表明hsa-miR-98-5p與DKK3有直接聯(lián)系。細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，hsa-miR-98-5p過(guò)表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，提示hsa-miR-98-5p在乳腺癌中發(fā)揮重要作用。

本研究初步探討了hsa-miR-98-5p/DKK3軸對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。后續(xù)將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)hsa-miR-98-5p/DKK3軸在乳腺癌中的作用進(jìn)行研究；其次，還需進(jìn)一步明確DDK3的潛在下游分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。