孫帥，吳曉順

（鄭州人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003）

結(jié)腸癌在老年患者中發(fā)病率較高，目前主要通過(guò)手術(shù)進(jìn)行治療。為了減輕手術(shù)過(guò)程中患者的痛苦，患者一般都需要使用麻醉劑，但全身麻醉后會(huì)導(dǎo)致患者的認(rèn)知能力下降，并引起免疫功能障礙和其他不良反應(yīng)，進(jìn)而降低患者的生活質(zhì)量并影響其預(yù)后。目前，七氟烷在臨床常用于麻醉。小鼠體內(nèi)和體外研究已顯示，七氟烷對(duì)細(xì)胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、突觸形成障礙、線粒體功能障礙和神經(jīng)炎癥影響，這些作用可能會(huì)對(duì)老鼠出現(xiàn)認(rèn)知障礙并產(chǎn)生影響［1］。然而七氟醚對(duì)神經(jīng)認(rèn)知損害的潛在機(jī)制仍然大部分未知。

磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB）信號(hào)通路在生理?xiàng)l件下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和存活起著至關(guān)重要的作用，有文獻(xiàn)顯示，PI3K/PKB信號(hào)通路與神經(jīng)保護(hù)作用密切相關(guān)，其能夠通過(guò)調(diào)控PI3K/PKB 信號(hào)通路，抑制炎癥、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，改善神經(jīng)發(fā)生和認(rèn)知能力［2］。自噬是一種分解代謝過(guò)程，其中錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和細(xì)胞器被吞噬在雙膜囊泡中，以平衡其在細(xì)胞中的合成。處在壓力下，細(xì)胞死亡具有立即/壞死細(xì)胞死亡和延遲/凋亡細(xì)胞死亡兩種潛在途徑。近年來(lái)已有證據(jù)表明，自噬的上調(diào)可以預(yù)防神經(jīng)退行性變［3］。而且已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，自噬可以在七氟醚暴露下降解錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)并改善凋亡，改善神經(jīng)退行性衰老大鼠的認(rèn)知障礙［4］。多種分子和信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬中起著至關(guān)重要的作用，例如自噬相關(guān)基因家族和PI3K/PKB 信號(hào)通路。

已有研究表明，七氟烷對(duì)術(shù)后認(rèn)知功能的保護(hù)具有積極作用［5］，但是關(guān)于七氟烷是否通過(guò)PI3K-Akt 通路和自噬影響結(jié)腸癌手術(shù)患者認(rèn)知功能的研究較少。本研究重點(diǎn)探討七氟烷麻醉結(jié)腸癌手術(shù)患者自噬和PI3K/PKB 通路的變化及其與患者認(rèn)知功能的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年1 月至2019 年1 月在鄭州人民醫(yī)院接受腹腔鏡下結(jié)腸癌根治術(shù)治療的100 例老年結(jié)腸癌患者作為研究對(duì)象，并隨機(jī)分為SEV 組（麻醉通過(guò)七氟醚）和ISO 組（麻醉通過(guò)異氟烷），每組50 例。ISO 組男性31 例，女性19 例；年齡65～79 歲，平均（70.48±6.28）歲；TNM 分期：Ⅰ期21 例，Ⅱ期29 例；合并疾病類型：高血壓15 例；糖尿病16 例；高血脂18 例；吸煙史31例；飲酒史35 例。SEV 組男性31 例，女性19例；年 齡65～79 歲，平 均（70.48±6.28）歲。TNM 分期：Ⅰ期24 例，Ⅱ期26 例；合并疾病類型：高血壓17 例，糖尿病14 例，高血脂19 例，吸煙史33 例，飲酒史32 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范》中結(jié)腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②早期單發(fā)病灶；③符合美國(guó)麻醉醫(yī)師協(xié)會(huì)分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)；④自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①接受過(guò)化療或免疫治療；②合并內(nèi)分泌疾病或免疫性疾病；③合并其他惡性腫瘤或精神性疾病或語(yǔ)言交流障礙。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

手術(shù)前半小時(shí)，所有患者肌肉注射阿托品0.3 mg。監(jiān)測(cè)血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，包括心率、收縮期血壓、舒張壓和脈搏氧飽和度。若發(fā)現(xiàn)任何異常，立即終止麻醉。靜脈注射咪達(dá)唑侖（0.05 mg/kg）、維庫(kù)溴銨（0.1 mg/kg）、丙泊酚（1.0 mg/kg）和瑞芬太尼（2 μg/kg）進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)，在此期間密切觀察對(duì)患者的麻醉效果。此外，患者通過(guò)氣管插管進(jìn)行機(jī)械通氣，并設(shè)定相關(guān)參數(shù)：在正常情況下，呼吸頻率設(shè)為12 次/min，機(jī)械通氣潮氣量約為8 mL/kg，呼氣二氧化碳分壓為35～40 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），吸氣/呼氣比約為0.5。SEV組使用七氟醚維持麻醉，ISO 組使用異氟烷維持麻醉。設(shè)定最低肺泡濃度，手術(shù)結(jié)束后終止麻醉。

1.2.1 樣本采集 收集患者手術(shù)前、手術(shù)后1 d 血液4 mL，抗凝處理后，其中2 mL 以3 000 r/min 離心8 min，取上清液，剩余血液采用RIPA 裂解液提取蛋白。

1.2.2 Western blotting 法檢測(cè)LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表達(dá)水平 血液標(biāo)本經(jīng)RIPA 裂解緩沖液冰上處理15 min。以12 000 g 離心10 min 后收集上清液，并通過(guò)BCA 試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過(guò)13.5% 的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶封閉2 h 后，將膜與LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的一抗在4°C 下孵育過(guò)夜。將膜用帶有Tween 20 的Tris 緩沖鹽水洗滌，并在室溫下與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗孵育2 h。使用ECL Plus 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)Perkin Elmer 公司）對(duì)條帶進(jìn)行可視化，并在C-DiGit 印跡掃描儀上顯影膜。使用Image Studio 1.1 版本軟件進(jìn)行量化。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較兩組手術(shù)前、手術(shù)后1 d 的血清PI3K和PKB 表達(dá)水平；②比較兩組簡(jiǎn)易智力狀態(tài)檢查（MMSE）量表評(píng)分：MMSE 評(píng)分用于評(píng)估患者的認(rèn)知能力。術(shù)后MMSE 評(píng)分比術(shù)前MMSE 評(píng)分降低2 分或更多，被認(rèn)為是認(rèn)知功能障礙。③比較兩組不良反應(yīng)數(shù)量：認(rèn)知功能障礙、低血壓和心動(dòng)過(guò)緩。低血壓標(biāo)準(zhǔn)為收縮壓<90 mmHg。竇性心室心動(dòng)過(guò)緩標(biāo)準(zhǔn)是心率<每分鐘55 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Pearson 相關(guān)分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組術(shù)前和術(shù)后1 d 血清PI3K 和PKB 表達(dá)水平比較

兩組術(shù)后1 d 血清PI3K 和PKB 表達(dá)水平較術(shù)前增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。SEV 組術(shù)后1 d 血清PI3K 和PKB 表達(dá)水平較ISO 組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組術(shù)前和術(shù)后1 d 血清PI3K 和PKB 表達(dá)水平比較（n=50,,pg/L）

表1 兩組術(shù)前和術(shù)后1 d 血清PI3K 和PKB 表達(dá)水平比較（n=50,,pg/L）

2.2 兩組術(shù)前和術(shù)后1 d 血液LC3 Ⅰ和LC3 Ⅱ表達(dá)水平比較

兩組術(shù)后1 d 血液LC3 Ⅱ表達(dá)水平較術(shù)前降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。SEV 組術(shù)后1 d血液LC3 Ⅱ表達(dá)水平較ISO 組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖1 和表2。

圖1 兩組LC3 Ⅰ和LC3 Ⅱ表達(dá)水平

表2 兩組術(shù)前和術(shù)后1 d 血液LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表達(dá)水平比較（n=50,）

表2 兩組術(shù)前和術(shù)后1 d 血液LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表達(dá)水平比較（n=50,）

2.3 兩組術(shù)前和術(shù)后1 d 的MMSE 評(píng)分比較

兩組術(shù)后1 d 的MMSE 評(píng)分較術(shù)前降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。SEV 組術(shù)后1 d 的MMSE 評(píng)分較ISO 組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 兩組術(shù)前和術(shù)后1 d 的MMSE 評(píng)分比較（n=50,,分）

表3 兩組術(shù)前和術(shù)后1 d 的MMSE 評(píng)分比較（n=50,,分）

2.4 兩組術(shù)后不良反應(yīng)率比較

SEV 組術(shù)后1 d 發(fā)生認(rèn)知功能障礙發(fā)生率低于ISO 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。兩組術(shù)后低血壓、心動(dòng)過(guò)緩發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表4。

表4 兩組術(shù)后不良反應(yīng)發(fā)生情況 ［n=50,n(%)］

2.5 MMSE 評(píng)分與PI3K 和PKB 表達(dá)水平及與LC3 Ⅰ和LC3 Ⅱ水平的相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果顯示MMSE 評(píng)分與PI3K 和PKB 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.412和-0.398，均P<0.001），而與LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.452 和0.427，均P<0.001）。

3 討論

老年患者手術(shù)后常發(fā)生認(rèn)知障礙，術(shù)后認(rèn)知障礙的機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，其涉及麻醉刺激、手術(shù)創(chuàng)傷和其他因素。一旦發(fā)生認(rèn)知障礙，患者會(huì)出現(xiàn)記憶力減退和言語(yǔ)障礙等癥狀，并導(dǎo)致患者住院時(shí)間延長(zhǎng)，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。七氟醚吸入麻醉是手術(shù)麻醉的重要方法，具有獨(dú)特的鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用，且不會(huì)引起呼吸抑制，對(duì)術(shù)后具有穩(wěn)定的血液動(dòng)力學(xué)和神經(jīng)保護(hù)作用，并能夠促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。已有研究顯示，PI3K/PKB 信號(hào)通路和自噬在麻醉藥物所導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷中起著重要作用［6-7］。

PI3K/PKB 信號(hào)通路不僅在細(xì)胞增殖和凋亡中起著關(guān)鍵作用，而且在調(diào)節(jié)人體的炎癥反應(yīng)中也起著重要作用。有研究顯示，抑制PI3K/PKB/GSK-3β信號(hào)通路的激活可以有效改善神經(jīng)性疼痛大鼠的病情和認(rèn)知障礙［8］，而七氟烷可以改善大鼠反復(fù)受到麻醉刺激引起的神經(jīng)認(rèn)知損害［9］。本研究結(jié)果顯示，兩組術(shù)前PI3K 和PKB 水平比較無(wú)差異，兩組術(shù)后1 d 血清PI3K 和PKB 水平較術(shù)前增加。SEV 組術(shù)后1 d 血清PI3K 和PKB 水平低于ISO組，比較有差異，提示七氟烷可有效降低患者血清中PI3K 和PKB 水平，七氟烷參與了PI3K/PKB通路在患者中的作用。有研究表明，七氟烷后處理可以通過(guò)PI3K/PKB/eNOS 和PI3K/PKB/GSK-3β通路對(duì)新生大鼠的缺氧、缺血性腦損傷產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用［10］。

自噬是細(xì)胞中功能障礙的細(xì)胞器或聚集蛋白更新的降解途徑，作為對(duì)細(xì)胞凋亡的防御反應(yīng)，自噬被激活以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)并通過(guò)阻斷細(xì)胞凋亡途徑促進(jìn)細(xì)胞存活。近年來(lái)已有證據(jù)表明，自噬的上調(diào)可以預(yù)防神經(jīng)退行性變。因此，自噬的調(diào)節(jié)可能是某些神經(jīng)退行性疾病（如阿爾茨海默病、亨廷頓病和帕金森?。┑囊环N新的治療策略［11］。已有研究顯示，暴露在七氟烷下的老年大鼠在麻醉誘導(dǎo)的應(yīng)激可能會(huì)改變海馬水平和認(rèn)知功能［12］。本研究中，兩組術(shù)前LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平比較無(wú)差異；兩組術(shù)后1 d 的LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平低于手術(shù)前，且SEV 組術(shù)后1 d 的LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平高于ISO 組，比較有差異，提示七氟烷可有效增加患者LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平。PI3K/PKB 通路與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和存活有關(guān)，PI3K/PKB 通路激活原則上將損傷神經(jīng)元并抑制自噬；與此相反，自噬的誘導(dǎo)（mTOR 的抑制）可能會(huì)由于持續(xù)自噬去除損傷的神經(jīng)細(xì)胞。本研究中，SEV 組術(shù)后1 d 血清PI3K和PKB 水平低于ISO 組，LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明七氟烷可能通過(guò)抑制PI3K/PKB通路，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞自噬，改善神經(jīng)功能。

本研究結(jié)果還顯示，SEV 組認(rèn)知功能障礙數(shù)量明顯低于ISO 組，而ISO 組MMSE 評(píng)分顯著低于SEV 組，表明七氟烷在提高M(jìn)MSE 評(píng)分、減少認(rèn)知功能障礙和減少術(shù)后不良反應(yīng)有積極作用。相關(guān)分析結(jié)果表明，MMSE 評(píng)分與PI3K 和PKB 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平呈正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明七氟烷可以降低血清PI3K 和PKB，上調(diào)LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平，從而改善MMSE評(píng)分。

綜上所述，七氟烷可以通過(guò)PI3K/PKB 信號(hào)通路調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞自噬，改善結(jié)腸癌手術(shù)患者術(shù)后的認(rèn)知功能，其可以為臨床應(yīng)用提供參考。