張軼涵，張浩然，李婉亭，馬文博

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 黑龍江，齊齊哈爾 161099）

在口腔黏膜疾病中，復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍（recurrent aphthous ulcer,RAU）作為常見(jiàn)的發(fā)病率高的潰瘍類疾病，其容易反復(fù)發(fā)作，使患者深受困擾。該發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前多數(shù)認(rèn)為因口腔潰瘍免疫功能異常、致病因素與遺傳基因、細(xì)菌病毒感染、過(guò)敏、微量元素缺乏、系統(tǒng)性疾病與激素失調(diào)、情緒壓力等因素相關(guān)，但確切因素尚不明確。近年來(lái)RAU 的發(fā)生和復(fù)發(fā)普遍認(rèn)為其因免疫功能異常引起。當(dāng)前RAU 與T 細(xì)胞免疫等作為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，已經(jīng)證實(shí)RAU 與T細(xì)胞免疫方面具有一定的關(guān)聯(lián)性。

銀杏葉提取物對(duì)于人體脾細(xì)胞抗體具有促進(jìn)生成作用，并能通過(guò)調(diào)整CD4+/CD8+T 細(xì)胞亞群比值提高小鼠免疫功能。本實(shí)驗(yàn)主要研究從銀杏提取物—銀杏黃酮對(duì)于RAU 大鼠外周血T 淋巴細(xì)胞亞群的影響，其不僅可以進(jìn)一步證明銀杏提取物—銀杏黃酮對(duì)于免疫功能增強(qiáng)的作用，還可以憑此降低口腔潰瘍的復(fù)發(fā)率，減少患者對(duì)于RAU 反復(fù)發(fā)作所帶來(lái)的痛苦。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取體重為180～220 g 的SPF 級(jí)SD 大鼠50 只、雌雄參半，由遼寧省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供，分籠飼養(yǎng)，室溫22℃～25℃，允許適當(dāng)進(jìn)食。

1.1.2 主要藥物和試劑 24% 銀杏葉提取物—銀杏黃酮（批號(hào)：SQYX20150415）購(gòu)自西安圣青生物科技有限公司，五氟尿嘧啶購(gòu)自合肥巴斯夫生物科技有限公司，左旋咪唑購(gòu)自廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，10%水合氯醛購(gòu)自美國(guó)WABCAN 公司，F(xiàn)ITC-CD3、APC-CD4、PE-CD8 單克隆抗體均購(gòu)自Thermo-Fisher Scientific-CN 有限公司，紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，PBS 緩沖液購(gòu)自江蘇凱吉生物科技有限公司，EDTA 購(gòu)自廣州邦標(biāo)醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將50 只SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照左旋咪唑組、低劑量銀杏黃酮組［5 mg/（2 mL·d）］、高劑量銀杏黃酮組［20 mg/（2 mL·d）］，每組10只。除空白組外，其余各組大鼠進(jìn)行口腔潰瘍模型制造，通過(guò)觀察傷口直徑，判斷造模成功與否。

1.2.2 潰瘍模型制備 使用化學(xué)灼燒法進(jìn)行潰瘍模型制備：適應(yīng)性飼養(yǎng)后，在造模前2 天和造模當(dāng)天分別注射5-氟尿嘧啶（劑量50 mg/kg）。造模當(dāng)天給大鼠腹腔注射10%水合氯醛，按0、3 mL/100 g劑量麻醉，使用止血鉗將大鼠上下頜撐開、固定。將直徑5～10 mm 的氫氧化鈉晶體準(zhǔn)確放置于右側(cè)頰黏膜處，維持接觸5～10 s，以口腔頰部黏膜潰瘍出血為造模完成。48 h 后形成口腔潰瘍模型，本模型可維持7～14 d。見(jiàn)圖1、2。

圖1 大鼠造模后口腔潰瘍面積

圖2 銀杏黃酮高劑量治療4 d 后口腔潰瘍面積

1.2.3 藥物干預(yù) 銀杏黃酮低高劑量組組別分別按照5 mg/（2ml·d）、20 mg/（2 mL·d）每日1 次灌胃，左旋咪唑陽(yáng)性對(duì)照組按照2 mg/（2ml·d）每日1 次灌胃。常組和模型組每日1 次分別使用等體積生理鹽水1 次/d 灌胃，共計(jì)灌胃14 d。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲水，給予適當(dāng)飲食，每日測(cè)量黏膜潰瘍面直徑1 次。

1.2.4 標(biāo)本采集 連續(xù)給藥兩周，末次給藥后進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，采取2 mL 血液置于EDTA 抗凝管。各組取抗凝管內(nèi)保存的血液100 μL 置于離心管內(nèi)，分別依次滴加FITC-CD3、APC-CD4 和PE-CD8單克隆抗體10 μL，20 min 后滴加紅細(xì)胞裂解液1.5 mL 裂解紅細(xì)胞，避光孵育10 min 后以1 200 r/min離心5 min。取沉淀經(jīng)PBS 充分沖洗滴加PBS 500 μL重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞水平，并計(jì)算CD4+/CD8+比值（用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定外周血T 淋巴細(xì)胞亞群）。用ELISA 檢測(cè)血清白細(xì)胞介素-2（IL-2）水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，比較用方差分析，組間比較用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠IL-2 水平與潰瘍愈合天數(shù)比較

各組大鼠IL-2 水平與潰瘍愈合天數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠IL-2 水平與潰瘍愈合天數(shù)比較（n=10,）

表1 各組大鼠IL-2 水平與潰瘍愈合天數(shù)比較（n=10,）

注：1）與正常組比較，P<0.05；2）與模型組比較，P<0.05。

2.2 各組大鼠外周血T 淋巴細(xì)胞亞群水平比較

各組大鼠外周血T 淋巴細(xì)胞亞群水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠外周血T 淋巴細(xì)胞亞群水平比較（n=10,）

表2 各組大鼠外周血T 淋巴細(xì)胞亞群水平比較（n=10,）

注：1）與正常組比較，P<0.05；2）與模型組比較，P<0.05。

3 討論

輕型RAU 是一種周期性、復(fù)發(fā)性、自限性疾病，其發(fā)病因素并非單一因素所致，而是由復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的及多種因素共同作用導(dǎo)致。李瑞澤等［1］認(rèn)為，細(xì)菌病毒感染、微量元素缺乏、過(guò)敏、系統(tǒng)性疾病和激素失調(diào)、情緒壓力及局部因素等原因均是可以引發(fā)口腔潰瘍的明顯癥狀。目前被更多學(xué)者們普遍接受的觀點(diǎn)是在RAU 中免疫因素有著十分強(qiáng)大的作用。目前認(rèn)為在RAU 的發(fā)病過(guò)程中，不管是細(xì)胞免疫功能低下還是細(xì)胞因子水平紊亂，其都對(duì)RAU 的發(fā)生、發(fā)展起到重要影響。對(duì)于細(xì)胞免疫來(lái)說(shuō)，T 淋巴細(xì)胞總值（CD3+）及其亞群（CD4+、CD8+）的相對(duì)比例決定了在面對(duì)RAU 疾病時(shí)，其免疫功能發(fā)揮的作用。有文獻(xiàn)已經(jīng)表明，RAU 患者均為細(xì)胞免疫低下狀態(tài)，且以CD4+指標(biāo)低下為主［2］。

白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、干擾素等均是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的重要細(xì)胞因子。在RAU 患者外周血中，尤其發(fā)現(xiàn)IL-2 水平較健康人明顯下降，其導(dǎo)致了患者免疫功能的異常，進(jìn)而為口腔潰瘍致病菌群提供了機(jī)會(huì)［3］。在T 淋巴細(xì)胞中，CD4所分泌的IL-2 具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用［4］，通過(guò)增強(qiáng)T 細(xì)胞的活性從而加速自身清除炎癥的速度，全面促進(jìn)潰瘍愈合［5］。

由于RAU 的復(fù)發(fā)率可高達(dá)50%，目前認(rèn)為終止復(fù)發(fā)>1 年即可表示輕型RAU 痊愈。目前為止，無(wú)徹底根治RAU 的特效方法。傳統(tǒng)的具有消炎止痛作用的口腔黏膜貼劑、氯己定含漱液等方法無(wú)法延長(zhǎng)該病的發(fā)病間期。銀杏黃酮作為口腔潰瘍免疫方向的研究熱點(diǎn)之一，多種現(xiàn)象表明研究可從減少?gòu)?fù)發(fā)率的角度入手。降低復(fù)發(fā)率可以有效控制口腔潰瘍的再次發(fā)生，減少患者的疼痛不適感。銀杏黃酮作為近年來(lái)所發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)免疫的藥物，有文獻(xiàn)已經(jīng)表明，其可以增強(qiáng)IL-2 的分泌作用，進(jìn)而提高人體免疫力［6］。還有就是給患者應(yīng)用銀杏黃酮一段時(shí)間后，患者外周血的T 淋巴細(xì)胞亞群CD3+CD4+比值明顯升高，從而證明銀杏黃酮有增強(qiáng)細(xì)胞免疫的功能。

綜上所述，本研究以銀杏黃酮作為主要藥物、以大鼠外周血T 淋巴細(xì)胞亞群免疫細(xì)胞CD4+/CD8+比值作為主要指標(biāo)對(duì)銀杏黃酮治療口腔潰瘍的效果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，得出結(jié)論就是銀杏黃酮可使大鼠T 淋巴細(xì)胞中CD4+/CD8+比值升高，且使IL-2水平升高，說(shuō)明銀杏黃酮可使機(jī)體特異性免疫功能增強(qiáng)。因此證明銀杏黃酮對(duì)治療口腔潰瘍有明顯療效，其可減少口腔黏膜潰瘍面積和潰瘍愈合時(shí)間，提高機(jī)體的免疫功能，進(jìn)而減少RAU 復(fù)發(fā)率。所以銀杏黃酮在治療口腔潰瘍、減少?gòu)?fù)發(fā)率、減輕癥狀等方面存在重大研究?jī)r(jià)值與潛能。目前對(duì)口腔潰瘍的治療研究依然有限，還需要更高質(zhì)量的臨床研究驗(yàn)證其作用；另外在免疫抑制人群中更應(yīng)當(dāng)注意銀杏黃酮的謹(jǐn)慎使用，避免其不良反應(yīng)的發(fā)生［7］。