甄宏，胡洪玻，榮國(guó)杰，黃秀秀，譚嫦，余新圓

（廣西醫(yī)大開(kāi)元埌東醫(yī)院 兒科，廣西 南寧 530021）

支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia,BPD）是早產(chǎn)兒中常見(jiàn)的一種慢性肺部疾病，同時(shí)也是引起早產(chǎn)兒死亡并導(dǎo)致其后遺癥的最主要因素［1-3］。BPD 是一種復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，涉及多種病變不成熟的肺，導(dǎo)致肺泡不同程度的簡(jiǎn)單化和細(xì)支氣管的結(jié)構(gòu)和功能改變［4］。細(xì)菌脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）可引起肺炎癥，導(dǎo)致新生大鼠的高死亡率并且隨后阻滯肺泡的形成，這是BPD 的經(jīng)典動(dòng)物模型之一［5-6］。巨噬細(xì)胞是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)分化的最終細(xì)胞，存在于組織中的巨噬細(xì)胞是防御外來(lái)入侵的第一道屏障，并在先天免疫中協(xié)調(diào)白細(xì)胞的滲透；其在特異性免疫中作為抗原提呈細(xì)胞和重要的炎癥細(xì)胞發(fā)揮著始動(dòng)作用［7］。巨噬細(xì)胞激活后可發(fā)生表型變化，其稱為巨噬細(xì)胞極化。

一般來(lái)說(shuō)，經(jīng)典激活途徑極化的M1 型巨噬細(xì)胞具有促炎作用，而替代激活途徑極化的M2 型巨噬細(xì)胞具有促進(jìn)組織修復(fù)和再生作用。M1/M2 表型的巨噬細(xì)胞常在促炎/抑炎作用間保持平衡［8-9］。本研究通過(guò)LPS 作用于新生SD 大鼠建立BPD 動(dòng)物模型，觀察不同時(shí)間點(diǎn)的肺部組織病理變化及巨噬細(xì)胞M1/M2 表型的變化，探討B(tài)PD 發(fā)病與巨噬細(xì)胞激活和極化的相關(guān)性，為BPD 的輔助治療開(kāi)辟新途徑?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前購(gòu)入SD 大鼠23 只。其中，雌性15 只和雄性8 只，12 周齡，每只大鼠體重180～220 g，平均（190.37±5.29）g，均購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002］。所有大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)（濕度60%，溫度23～25℃），飼喂自由飲水、日常光照，所有操作遵守動(dòng)物倫理法。將性成熟的SD 大鼠按照雌雄比2∶1 進(jìn)行合籠，觀察并記錄雌鼠生產(chǎn)日期，出生幼鼠用于實(shí)驗(yàn)。使用腹腔注射LPS 的方法構(gòu)造新生大鼠支氣管肺發(fā)育不良模型，并在其出生后第1、3、5 天分別注射LPS 劑量為1 mg/kg、1 mg/kg 和2 mg/kg。選取成功造模的27 只作為L(zhǎng)PS 組，并選取27 只新生大鼠腹腔在其出生后第1、3、5 天注射等量生理鹽水作為對(duì)照組。本研究所納入的54 只4 日齡SD 大鼠，每只體重約為6～10 g，平均（8.37±1.29）g。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

細(xì)菌脂多糖LPS（美國(guó)Sigma 公司），小鼠抗大鼠CD68 抗體、兔抗CD163、FITC 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（英國(guó)Abcam 公司），兔抗大鼠Arg-1 抗體、兔抗大鼠iNOS 抗體（美國(guó)Affinity 公司），Cy3 標(biāo)記山羊抗兔IgG、RNA 提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），流式細(xì)胞術(shù)抗體CD68-FITC、PE 標(biāo)記抗兔IgG 抗體（美國(guó)Thermofisher 公司），抗CD45 PerCP/Cy5.5、抗CD86-PE（美國(guó)Biolegend 公司），熒光顯微鏡（日本OLYMPUS 株式會(huì)社），NovoCyte?流式細(xì)胞儀（杭州艾森生物有限公司），CFX Connect?實(shí)時(shí)熒光PCR 儀（上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）。

1.3 支氣管肺發(fā)育不良模型構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組

使用腹腔注射LPS 的方法構(gòu)造新生大鼠支氣管肺發(fā)育不良模型，在其出生后第1、3、5 天分別注射LPS 劑量為1 mg/kg、1 mg/kg 和2 mg/kg。利用病理切片蘇木精-伊紅（HE）染色驗(yàn)證其模型是否成功，染色后顯微鏡下觀察到放射狀肺泡計(jì)數(shù)較小、呼吸膜厚度增厚、肺纖維化加重則為造模成功［10］。選取成功造模的27 只作為L(zhǎng)PS 組，并選取27 只新生大鼠腹腔在其出生后第1、3、5日齡注射等量生理鹽水作為對(duì)照組。兩組大鼠分別于10 日齡、14 日齡、21 日齡時(shí)各取9 只幼鼠進(jìn)行觀察：3 只做病理學(xué)形態(tài)檢查；3 只做流式細(xì)胞儀檢查；3 只做PCR 檢查。

1.4 肺部組織病理切片HE 染色

取出鼠肺組織常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、水化后進(jìn)行HE 染色，顯微鏡下觀察。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

組織切片經(jīng)抗原修復(fù)后與小鼠抗大鼠CD68 抗體（1∶200）4℃孵育過(guò)夜，在室溫靜置45 min。PBS 浸洗玻片后滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶200）37℃孵育30 min，PBS 充分淋洗。DAB 顯色5～10 min，蘇木精復(fù)染、返藍(lán)、脫水、透明、封片、鏡檢。

1.6 免疫熒光

組織切片水化、抗原修復(fù)、通透后予5%BSA封閉30 min。M1 型巨噬細(xì)胞染色為小鼠抗大鼠CD68抗體（1∶300）和兔抗大鼠Arg-1抗體（1∶200）。M2 型巨噬細(xì)胞染色為小鼠抗大鼠CD68抗體（1∶300）和兔抗大鼠iNOS 抗體（1∶200），4℃孵育過(guò)夜。玻片復(fù)溫至室溫后，PBS 浸片后滴加FITC 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶200），Cy3 標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶200），濕盒中37℃孵育30 min。滴加DAPI 避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片、鏡檢。

1.7 流式檢測(cè)

收集大鼠肺泡灌洗液，用100 μm 濾網(wǎng)過(guò)濾去除組織塊，收集濾液1 500 r/min 離心棄上清，PBS洗滌兩遍。加入100 μL PBS 重懸細(xì)胞，并平分為A、B 兩管。A 管加入CD68-FITC、CD45 PerCP/Cy5.5、CD86-PE 抗 體；B 管 加 入CD68-FITC、CD45 PerCP/Cy5.5、CD163 抗體，常規(guī)孵育染色后。A 管加入500 μL PBS 液重懸細(xì)胞混勻后上流式儀檢測(cè)；B 管加入PE 熒光標(biāo)記的抗CD163 二抗，孵育染色、重懸細(xì)胞混勻后上流式儀檢測(cè)。A管先以CD45 陽(yáng)性設(shè)門、再以CD68 陽(yáng)性設(shè)門，分析CD45/CD68/CD86 三陽(yáng)性細(xì)胞在CD45/CD68 雙陽(yáng)性細(xì)胞中的比例，即為M1 型巨噬細(xì)胞占巨噬細(xì)胞的比例（M1%）；B 管同樣以CD45 陽(yáng)性和CD68陽(yáng)性設(shè)門后，分析CD45/CD68/CD163 三陽(yáng)性細(xì)胞在CD45/CD68 雙陽(yáng)性細(xì)胞中的比例，即為M2 型巨噬細(xì)胞占巨噬細(xì)胞的比例（M2%）。M1% 和M2%的數(shù)值相加為極化巨噬細(xì)胞占總巨噬細(xì)胞的比例（M 極化%）。

1.8 熒光定量PCR 檢測(cè)

各組進(jìn)行RNA 的提取，提取RNA 后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA 為模板，在熒光定量PCR 儀上進(jìn)行檢測(cè)。以β-actin 為內(nèi)參，以對(duì)照組的相應(yīng)基因表達(dá)為基數(shù)1，2-△△Ct法計(jì)算出各組腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α），白細(xì)胞介素-10（interleukin-10,IL-10），一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）和精氨酸酶-1（arginase-1,Arg-1）基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)條件：95℃預(yù)變性10min，95℃變性10 s，54.3℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)（見(jiàn)表1）。融解曲線分析：95℃15 s，54.3℃1 min，95℃15 s，54.3℃15 s，54.3℃15 s。

表1 各指標(biāo)引物序列情況

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，作圖采用Graphpadprism 8.0 軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較用t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理HE 染色結(jié)果

隨著日齡的增長(zhǎng)，對(duì)照組大鼠肺泡逐漸分化成熟，各時(shí)間點(diǎn)的肺泡大小均勻、形態(tài)規(guī)則，肺泡間隔無(wú)增厚，肺泡腔內(nèi)未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。隨著日齡的增長(zhǎng)，LPS 組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔明顯增厚，并伴肺泡腔及肺間隔周圍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，21 d 時(shí)可見(jiàn)明顯的肺泡簡(jiǎn)單化。見(jiàn)圖1。

圖1 病理HE 染色（×200）

2.2 免疫組織化學(xué)染色CD68 表達(dá)結(jié)果

染色后CD68 陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)胞漿褐色，10 日齡、14 日齡、21 日齡時(shí)LPS 組大鼠的CD68 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組。見(jiàn)圖2。

圖2 免疫組織化學(xué)染色肺組織中CD68 表達(dá)結(jié)果

2.3 免疫熒光染色M1 和M2 型巨噬細(xì)胞結(jié)果

CD68（FITC 標(biāo)記呈現(xiàn)綠色熒光）與iNOS（Cy3 標(biāo)記呈現(xiàn)紅色熒光）M1 型巨噬細(xì)胞，CD68與Arg-1（Cy3 標(biāo)記呈現(xiàn)紅色熒光）標(biāo)記M2 型巨噬細(xì)胞，陽(yáng)性結(jié)果呈現(xiàn)橙色。10 日齡、14 日齡、21 日齡時(shí)LPS 組大鼠的M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞多于對(duì)照組，且21 d 時(shí)LPS 組M2 型巨噬細(xì)胞增加比M1 型更明顯。見(jiàn)圖3。

圖3 免疫熒光染色肺組織中M1 和M2 型巨噬細(xì)胞表達(dá)結(jié)果（×200）

2.4 流式檢測(cè)各組各時(shí)間點(diǎn)肺泡灌洗液中M1 和M2 型巨噬細(xì)胞表達(dá)結(jié)果

對(duì)照組第10、14 和21 天中巨噬細(xì)胞極化的比率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)。而LPS 組第10 天已處于較高的極化率值。兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.150,P=0.047）。LPS 組第14 天與對(duì)照組數(shù)值接近（t=-0.803,P=0.434），但在第21 天較對(duì)照組稍低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.811,P=0.089）。M1%∶M2%比值分析結(jié)果顯示，對(duì)照組第10 天以M1 極化為主，之后演變?yōu)镸2 極化為主。而LPS 組一直以M2 極化為主，第10 天和第21 天M1%∶M2% 比值均較對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.654 和4.465，均P<0.001）。見(jiàn)圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺泡灌洗液中M1 和M2 型巨噬細(xì)胞結(jié)果

2.5 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)TNF-α、IL-10、iNOS 和Arg-1 表達(dá)結(jié)果

以對(duì)照組基因表達(dá)為1，2-△△Ct法計(jì)算LPS 組各基因的相對(duì)表達(dá)量。LPS 組Arg-1 基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組有1 倍以上差異：LPS 組第10 天Arg-1 mRNA 表達(dá)減少至對(duì)照組（0.43±0.21）倍，而在第21 天表達(dá)明顯增加至（2.33±0.75）倍。兩組TNF-α、IL-10、iNOS 的mRNA 表達(dá)差 異<1 倍。見(jiàn)圖5。

圖5 LPS 組TNF-α、IL-10、NOS 和Arg-1 基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量

3 討論

常用的BPD 造模方法有高氧暴露、機(jī)械通氣損傷誘導(dǎo)、宮內(nèi)炎癥誘導(dǎo)、低氧誘導(dǎo)或復(fù)合因素誘導(dǎo)等，由于炎癥被認(rèn)為是BPD 發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的基石［11］，因此模擬炎癥誘導(dǎo)模型鼠肺泡發(fā)育受阻，更符合BPD 的病理生理變化及臨床本質(zhì)，其是研究BPD 的理想動(dòng)物模型。肺發(fā)育可分為胚胎期、假腺期、微管期、囊狀期和肺泡期等五個(gè)階段。容易出現(xiàn)BPD 的早產(chǎn)兒出生時(shí)常處于微管期晚期或囊狀期的早期，而在嚙齒動(dòng)物中，囊狀期則發(fā)生在宮內(nèi)直到出生后5 d。因此采用新生鼠進(jìn)行BPD 造模，能夠較好地模擬人類早產(chǎn)兒的病理生理狀態(tài)［6］。

巨噬細(xì)胞M1 極化、M2 極化能夠促使巨噬細(xì)胞在炎癥部位聚集、增生和活化，進(jìn)而分泌大量的炎癥因子，活化的炎癥因子又會(huì)對(duì)巨噬細(xì)胞的釋放起到促進(jìn)作用，因此炎癥部位聚集大量的炎癥因子，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)［12］。當(dāng)肺部出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時(shí)，大量的炎癥因子和炎癥細(xì)胞在肺毛細(xì)血管和肺泡腔內(nèi)聚集，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，對(duì)正常肺組織造成損壞，增加毛細(xì)血管的通透性和肺泡的受損程度，最終導(dǎo)致肺部炎癥反應(yīng)失調(diào)、阻礙肺發(fā)育，造成支氣管肺發(fā)育不良［13］。有體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS 可引起巨噬細(xì)胞M1 極化，其特征是誘導(dǎo)iNOS 和TNF-ɑ 的產(chǎn)生［14］；或在低LPS 濃度時(shí)引起M2 表型極化、高LPS 濃度時(shí)引起M1 表型極化［15］。本研究基于動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)LPS 引起肺內(nèi)巨噬細(xì)胞以M2 極化為優(yōu)勢(shì)，這一發(fā)現(xiàn)與ZARAMELLA 等［16］在人體中的觀察結(jié)果有吻合之處。該研究在發(fā)展為BPD 的早產(chǎn)兒肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)了巨噬細(xì)胞以M2 極化為優(yōu)勢(shì)。目前被較廣泛接受的觀點(diǎn)認(rèn)為巨噬細(xì)胞M1/M2 極化的平衡影響著器官炎癥/外傷后的結(jié)局。其在感染或炎癥之初，巨噬細(xì)胞常以M1 極化為主，釋放TNF-α、IL-1b等因子；但如果M1 時(shí)相持續(xù)，則可能導(dǎo)致組織損傷。因此在M1 應(yīng)激后繼之以M2 極化為優(yōu)勢(shì)，分泌IL-10 和TGF-b 等來(lái)抑制炎癥，有助于促進(jìn)組織修復(fù)、回歸穩(wěn)態(tài)［8-9］。因此本研究結(jié)果顯示天時(shí)，LPS 組出生后第21 天肺內(nèi)Arg-1 基因表達(dá)明顯上調(diào)，分析原因可能與巨噬細(xì)胞的M2 極化優(yōu)勢(shì)有關(guān)。

由于精氨酸酶（Arg）與一氧化氮合酶（NOS）共用底物L(fēng)-精氨酸，兩種酶具有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，而兩者的作用正好相反。NOS 作用產(chǎn)生NO（一氧化氮），促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1 型分化、促進(jìn)血管舒張。因此除了影響M1/M2 巨噬細(xì)胞極化的平衡所致的炎癥和修復(fù)外，Arg-1 和NOS 還是一對(duì)影響肺血管收縮/舒張和增殖的因子，其比值（平衡）可能對(duì)發(fā)育中的肺血管網(wǎng)形成產(chǎn)生影響。有研究發(fā)現(xiàn)，Arg-1 基因的單核苷酸多態(tài)性影響NOS 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而可以影響支氣管肺發(fā)育不良繼發(fā)的肺動(dòng)脈高壓［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激后，新生鼠出生后第21 天Arg-1 mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)，而NOS 表達(dá)相對(duì)無(wú)明顯變化。這樣的Arg-1/NOS 表達(dá)失衡可能對(duì)肺血管的發(fā)生產(chǎn)生影響，進(jìn)而加速BPD 的病理進(jìn)展。BPD 特征性的病理生理學(xué)改變中，表現(xiàn)除了肺泡簡(jiǎn)單化和數(shù)量減少外，肺泡血管形成不良［4］，甚至可繼發(fā)肺動(dòng)脈高壓［18］，其已日益為人們所重視。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，LPS 引起新生大鼠肺中Arg-1 的異常增高表達(dá)，可能成為探索BPD 發(fā)病機(jī)制的重要線索。

綜上所述，LPS 引起新生大鼠的肺損傷在14～21 日齡后發(fā)展為支氣管肺發(fā)育不良表型，伴隨著巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)增加和M1/M2 型極化，巨噬細(xì)胞激活及M1/M2 型極化可通過(guò)肺炎癥反應(yīng)失調(diào)而阻礙肺發(fā)育。巨噬細(xì)胞高表達(dá)提示可能存在支氣管肺發(fā)育不良，其可用于提前診斷。