李賽男 呂怡娜 姜煥煥 黃麟淇 區(qū)炳明 劉文華

摘要：【目的】構建表達甜菜夜蛾核多角體病毒（Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus，SeMNPV） VP39蛋白的vp39假型苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒（Autographa californica MNPV，AcMNPV），明確SeMNPV VP39是否能取代AcMNPV VP39在AcMNPV中行使功能，為深入探究桿狀病毒的核衣殼裝配機理打下理論基礎?！痉椒ā坷肂ac-to-Bac桿狀病毒表達載體系統(tǒng)在AcMNPV vp39缺失型重組bacmid（bAcvp39KO）的基礎上構建攜帶SeMNPV vp39基因、綠色熒光蛋白基因（Enhanced green fluorescence protein，egfp）和多角體蛋白基因（Polyhedrin，polh）的重組病毒（vAcSevp39：FLAG）。利用Western blotting檢測分析SeMNPV vp39在vAcSevp39：FLAG轉染的草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）IPLB-Sf21-AE clonal isolate 9（Sf9）細胞中的表達情況，通過熒光顯微鏡觀察vAcSevp39：FLAG在Sf9中的感染和擴散情況，采用病毒滴度測定并繪制病毒生長曲線檢測vAcSevp39：FLAG的感染性芽生型病毒粒子產量，并以電子顯微鏡觀察vAcSevp39：FLAG轉染的Sf9細胞中的形態(tài)發(fā)生情況?！窘Y果】Western blotting檢測結果表明，SeMNPV VP39能在vAcSevp39：FLAG轉染的Sf9細胞中獲得表達;熒光顯微鏡觀察和病毒生長曲線測定結果表明，在vAcSevp39：FLAG轉染的Sf9細胞中無感染性的芽生型病毒粒子產生，與AcMNPV vp39缺失型重組病毒（vAcvp39KO）的現(xiàn)象一致;電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與vAcvp39KO不同的是，在vAcSevp39：FLAG轉染的細胞中雖然未產生核衣殼，但在感染細胞的核中存在大量空的透明長管狀衣殼結構，表明SeMNPV VP39能挽救vAcvp39KO的衣殼結構裝配，但在AcMNPV中不具備裝配核衣殼的能力?！窘Y論】 SeMNPV VP39在AcMNPV中雖能形成衣殼結構，但不能有效裝配核衣殼，導致無芽生型病毒粒子和包埋型病毒粒子產生。

關鍵詞： 苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒; vp39; 甜菜夜蛾核多角體病毒; 芽生型病毒粒子; 核衣殼裝配

0 引言

【研究意義】桿狀病毒是一類專一性感染節(jié)肢動物的病原微生物，其外形呈桿狀，外具囊膜，基因組為雙鏈閉合環(huán)狀DNA（Rohrmann，2019）。在桿狀病毒的一個感染周期中會產生2種功能形態(tài)各異的病毒粒子：芽生型病毒粒子（Budded virion，BV）和包埋型病毒粒子（Occlusion-derived virion，ODV），二者的囊膜組分和來源各不相同，但遺傳物質和核衣殼結構相近。迄今為止，桿狀病毒核衣殼結構的裝配機理尚不清楚。VP39蛋白是桿狀病毒衣殼的主要結構蛋白，開展VP39蛋白功能研究對深入探究桿狀病毒核衣殼的裝配機制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】桿狀病毒科（Baculoviridae）可分為4個屬，分別是Alphabaculovirus、Betabaculovirus、Gammabaculovirus和Deltabaculovirus（Jehle et al.，2006），其中，Alphabaculovirus又可進一步分為Group I和Group II核多角體病毒（Nucleopolyhedrovirus，NPV）（de A Zanotto et al.，1993）。Group I NPVs與Group II NPVs的核衣殼組成和結構相似，但BV的膜融合蛋白不同，Group I NPVs以GP64為膜融合蛋白，而Group II NPVs以F蛋白為膜融合蛋白。此外，Group I NPVs中存在含gp64在內的12個基因，在Group II NPVs中沒有同源基因（Rohrmann，2019）。桿狀病毒的核衣殼由基底結構、圓柱形的鞘和頂冠3部分組成（Fraser，1986）。新的病毒DNA在病毒發(fā)生基質（Virogenic stroma，VS）中合成后被壓縮包裝入衣殼形成核衣殼，衣殼裝配過程可能不依賴于病毒DNA的壓縮包裝（Fraser，1986;Wang et al.，2016）。苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒（Autographa californica multiple NPV，AcMNPV）是桿狀病毒的代表種，也是目前研究最廣泛和最清楚的桿狀病毒（Ayres et al.，1994）。AcMNPV基因組大小約134 kb，約編碼150個開放閱讀框（Open reading frame，ORF）（Ayres et al.，1994;Harrison and Bonning，2003;Maghodia et al.，2014;Rohrmann，2019）。AcMNPV vp39（orf89）的同源基因存在于所有已測序的桿狀病毒基因組中，是桿狀病毒的核心基因。vp39的特征最早在AcMNPV（Thiem and Miller，1989）和黃杉毒蛾核多角體病毒（Orgyia pseudotsugata MNPV）（Pearson et al.，1988）中被研究。在AcMNPV中，vp39位于AcMNPV基因組75534～76577 nt之間，全長1044 bp，編碼347個氨基酸殘基（Ayres et al.，1994）。已有研究表明，桿狀病毒主要衣殼結構蛋白VP39以單體形式環(huán)狀排列在核蛋白核心的周圍（Pearson et al.，1988;Blissard et al.，1989;Thiem and Miller，1989;Wang et al.，2010b）。家蠶核多角體病毒（Bombyx mori NPV，BmNPV）vp39的缺失，導致BmNPV不能產生BV（Ono et al.，2012）。AcMNPV vp39的缺失導致核衣殼裝配受阻（Bai et al.，2019），BmNPV VP39第276位保守甘氨酸位點的突變導致病毒核衣殼不能正確裝配，病毒DNA不能正確包裝進入衣殼（Katsuma and Kokusho，2017）。最近有研究表明，BmNPV VP39 C-末端的第192～286位氨基酸區(qū)域在核內肌動蛋白的聚合中具有關鍵作用（Zhang et al.，2020）?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組前期通過利用構建的C端融合FLAG標簽的AcMNPV vp39全長補回型重組病毒（vAcvp39：FLAG）和AcMNPV vp39缺失型重組病毒（vAcvp39KO），發(fā)現(xiàn)VP39為病毒核衣殼裝配的必需蛋白（Li et al.，2021），但其作用機理未明確。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，Group II NPVs的甜菜夜蛾核多角體病毒（Spodoptera exigua MNPV，SeMNPV）VP39氨基酸序列與AcMNPV VP39氨基酸序列的相似性約43%，但SeMNPV VP39能否替代AcMNPV VP39在AcMNPV的生活周期中行使功能有待進一步探究。【擬解決的關鍵問題】利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達載體系統(tǒng)在AcMNPV vp39缺失型重組bacmid（bAcvp39KO）的基礎上構建攜帶SeMNPV vp39基因、綠色熒光蛋白基因（Enhanced green fluorescence protein，egfp;本研究簡寫為gfp）和多角體蛋白基因（Polyhedrin，polh）的重組病毒（vAcSevp39：FLAG），以該重組病毒為基礎，通過熒光顯微鏡觀察、病毒滴度測定和電子顯微鏡觀察分析SeMNPV VP39取代AcMNPV VP39對AcMNPV的感染性BV產量和核衣殼裝配的影響，為深入探究桿狀病毒的核衣殼裝配機理打下理論基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 質粒、病毒和昆蟲細胞 含有SV40多聚腺苷酸化序列的質粒pUC18-SV40及攜帶gfp和polh雙標記的質粒pFB1-PH-GFP為中山大學有害生物控制與資源利用國家重點實驗室構建（Wu et al.，2006;Cai et al.，2012）。缺失vp39基因的重組bacmid bAcvp39KO、攜帶polh和gfp雙標記的vp39 C端融合FLAG標簽的vp39全長補回型重組病毒vAcvp39：FLAG及攜帶polh和gfp雙標記的vp39基因缺失型重組病毒vAcvp39KO由肇慶學院生命科學學院微生物資源開發(fā)與利用實驗室構建（Li et al.，2021）。來源于草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的IPLB-Sf21-AE clonal isolate 9（Sf9）細胞株由中山大學有害生物控制與資源利用國家重點實驗室饋贈。Sf9細胞培養(yǎng)于添加有胎牛血清（10%）、青霉素（100 μg/mL）和鏈霉素（30 μg/mL）的TNM-FH培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為27 ℃。

1. 1. 2 主要試劑 克隆載體pMD18-T為TaKaRa公司產品;限制性內切酶和預染標準蛋白Marker購自Thermo Scientific公司;氯霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)霉素、IPTG和X-gal均購自Sigma公司;DNA電泳Marker購自廣州東盛生物科技有限公司;Anti-FLAG鼠單克隆抗體購自Abmart公司;bacmid DNA堿法提取試劑（Solution I、Solution II和Solution III）、質粒小量提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自OMEGA公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 vp39假型AcMNPV（vAcSevp39：FLAG）構建參照Daimon等（2005）的方法進行重疊PCR。以AcMNPV基因組DNA為模板，采用引物對Acvp39PF1（5'-GAGCTCCAAATTTGATTTCAATTTTATCGTG TTGGT-3'）/Acvp39PR1（5'-GAGGAGACAGGCGTC AGAGCCATATTGTTGCCGTTATAAATATGGA-3'）擴增得到AcMNPV vp39基因的啟動子區(qū)域（76578～76977 nt）;以SeMNPV基因組DNA為模板，采用引物對Acvp39PF2（5'-TCCATATTTATAACGGCAACAAT ATGGCTCTGACGCCTGTCTCCTC-3'）/Acvp39PR2（5'-GGTACCCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAA TCGACGACGGCCGTGGGCCGAAGC-3'）擴增得到在C端融合有FLAG標簽的SeMNPV vp39 ORF片段（73243～74223 nt）。PCR反應體系50.0 μL：2×PrimeSTAR Max DNA聚合酶25.0 μL，20 ng DNA模板，正、反向引物各10 pmol，滅菌雙蒸水補足至50.0 μL。擴增程序：98 ℃預變性4 min;98 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。分別回收PCR片段，以2個PCR擴增片段的混合物為模板進行重疊PCR。PCR反應體系48.0 μL：2×PrimeSTAR Max DNA聚合酶25.0 μL，回收的2個PCR擴增片段各600 ng，滅菌雙蒸水補足至48.0 μL。擴增程序：98 ℃預變性4 min;98 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，進行4個循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。在上述PCR管中加入引物Acvp39PF1和Acvp39PR2各10 pmol，重新進行PCR擴增，擴增程序：98 ℃預變性4 min;98 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，進行30個循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。回收重疊PCR擴增產物，克隆至pMD18-T載體，經Sac I/Kpn I雙酶切鑒定正確后，委托北京睿博興科生物技術有限公司廣州分公司對插入的DNA片段進行測序鑒定。從測序正確的質粒上以Sac I/Kpn I雙酶切下插入的Sevp39：FLAG片段，連接至經Sac I/Kpn I雙酶切且含有SV40多聚腺苷酸化序列的pUC18-SV40質粒上（Cai et al.，2012），即得到重組質粒pUC18-Sevp39：FLAG，使用Sac I/Xba I雙酶切下攜帶SV40多聚腺苷酸化序列的Sevp39：FLAG線性片段，克隆至攜帶polh啟動子啟動表達的polh基因及AcMNPV ie1啟動子啟動表達的gfp基因的pFB1-PH-GFP載體（Wu et al.，2006），得到轉座載體pFB1-Sevp39：FLAG。

將轉座載體pFB1-Sevp39：FLAG轉化到CaCl2法制備的含重組bacmid bAcvp39KO的DH10Bac感受態(tài)細胞中。通過轉座子Tn7介導的轉座（Luckow et al.，1993），將AcMNPV vp39基因啟動子控制下的SeMNPV vp39基因及SV40多聚腺苷酸化信號序列、polh和gfp基因一起插入bAcvp39KO的polh位點，構建攜帶polh和gfp雙標記的vp39假型AcMNPV（vAcSevp39：FLAG）。分別使用引物對Acvp39PF1/Acvp39PR2、Acvp39PF1/M13R（5'-CAGGAAACAG CTATGAC-3'）、M13F（5'-GTTTTCCCAGTCACGA C-3'）/Acvp39PR2和M13F/M13R對構建的重組病毒進行PCR鑒定及測序驗證。

1. 2. 2 轉染昆蟲細胞 參照Bac-to-Bac表達系統(tǒng)操作手冊和Wu等（2006）的方法，定量1 μg vAcvp-39KO、vAcSevp39：FLAG和vAcvp39：FLAG bacmid DNA分別轉染Sf9細胞單層（1.0×106），以添加新鮮含胎牛血清細胞培養(yǎng)基的時間點記為0 h。利用熒光倒置顯微鏡（Nikon ECLIPSE TE2000-U）在轉染后（Post-transfection，p.t.）24、48、72和96 h觀察病毒的復制和擴散情況。參照OReilly等（1992）的方法，收集0、24、48、72、96和120 h p.t.的細胞培養(yǎng)上清液，用半數(shù)組織培養(yǎng)物感染劑量法（50% tissue culture infective dose，TCID50）測定病毒滴度。

1. 2. 3 Western blotting檢測分析 分別定量1 μg vAcvp39KO和vAcSevp39：FLAG bacmid DNA轉染Sf9細胞單層（1.0×106），在96 h p.t.收集細胞，使用12% SDS-PAGE進行電泳，以anti-FLAG鼠單克隆抗體進行Western blotting檢測分析，以檢測病毒感染Sf9細胞中SeMNPV VP39的表達。

1. 2. 4 透射電鏡觀察 分別定量2 μg vAcvp39KO、vAcSevp39：FLAG和vAcvp39：FLAG bacmid DNA轉染Sf9細胞單層（1.0×106），于72 h p.t.以細胞刮輕輕刮下細胞，4 ℃下2000 r/min離心10 min，收集Sf9細胞，透射電鏡樣品的制備參照Yuan等（2008）的方法。以120 kV的加速電壓在透射電子顯微鏡（JEOL JEM-1400）下對樣品進行觀察，拍照記錄試驗結果。

2 結果與分析

2. 1 vAcSevp39：FLAG的構建和驗證結果

以AcMNPV基因組DNA為模板，采用引物對Acvp39PF1/Acvp39PR1擴增出AcMNPV vp39基因啟動子區(qū)域;同時以SeMNPV基因組DNA為模板，采用引物對Acvp39PF2/Acvp39PR2擴增出在C端融合有FLAG標簽的SeMNPV vp39 ORF片段。分別回收PCR片段，以PCR片段的混合物為模板，以引物對Acvp39PF1/Acvp39PR2進行重疊PCR，擴增片段1405 bp（圖1，泳道1）?；厥赵撝丿BPCR的產物，克隆至pMD18-T載體上，經Sac I/Kpn I雙酶切鑒定，獲得2692 bp的pMD18-T載體片段和約1405 bp的目的片段（圖1，泳道2），與預期結果一致。將測序正確的克隆子命名為T-Sevp39：FLAG。用Sac I/Kpn I從T-Sevp39：FLAG切下目的片段，連接至經同樣酶切的pUC18-SV40質粒上（Cai et al.，2012），得到重組質粒pUC18-Sevp39：FLAG，用Sac I/Kpn I進行酶切鑒定，獲得約2927 bp的pUC18-SV40載體片段和約1405 bp的目的片段，與預期結果一致（圖1，泳道3）。采用Sac I/Xba I從pUC18-Sevp39：FLAG切下目的片段，插入經同樣酶切的pFB1-PH-GFP載體（Wu et al.，2006），得到轉座載體pFB1-Sevp39：FLAG，使用Sac I/Xba I進行雙酶切鑒定，獲得的片段與預期結果相符（載體pFB1-PH-GFP片段約7300 bp，帶有SV40多聚腺苷酸化序列的Sevp39線性片段約1652 bp），表明轉座載體pFB1-Sevp39：FLAG構建成功（圖1，泳道4）。

重組病毒vAcSevp39：FLAG的構建如圖2所示。以轉座載體pFB1-Sevp39：FLAG轉化bAcvp39KO感受態(tài)細胞，通過位點特異性重組，polh、gfp及在AcMNPV vp39啟動子控制下且在C端融合表達FLAG標簽（圖2中以灰色三角符號標識）的SeMNPV vp39基因一起插入重組bacmid bAcvp39KO的polh基因位點，即獲得攜帶SeMNPV vp39基因的vp39假型AcMNPV（vAcSevp39：FLAG）。

對獲得的重組病毒vAcSevp39：FLAG進行PCR驗證，引物對Acvp39PF1/Acvp39PR2、M13F/Acvp39-PR2、Acvp39PF1/M13R和M13F/M13R在重組病毒中可分別擴增出大小約1405、4150、3450和6000 bp的條帶，產物大小與預期結果相符（圖3），而在bAcvp39KO中未擴增出任何條帶（文中未顯示）?；厥誔CR產物，進行測序鑒定，結果表明重組病毒構建成功。

2. 2 SeMNPV vp39在AcMNPV中的表達檢測結果

分別定量1 μg vAcvp39KO和vAcSevp39：FLAG bacmid DNA轉染Sf9細胞，在96 h p.t.收集細胞，進行SDS-PAGE電泳，并以anti-FLAG鼠單克隆抗體進行Western blotting檢測分析，結果（圖4）顯示，在vAcSevp39：FLAG bacmid DNA轉染的Sf9細胞樣品中能特異性檢測到SeMNPV VP39的條帶，而在vAcvp39KO轉染的Sf9細胞樣品中未檢測出任何條帶，表明SeMNPV VP39能在vAcSevp39：FLAG轉染的Sf9細胞中表達。

2. 3 重組病毒轉染Sf9細胞的顯微鏡觀察和病毒生長曲線測定結果

定量1 μg vAcSevp39：FLAG的bacmid DNA轉染Sf9細胞，以AcMNPV vp39缺失型重組病毒vAcvp-39KO為陰性對照，以AcMNPV vp39補回型重組病毒vAcvp39：FLAG為陽性對照，利用熒光顯微鏡觀察病毒的感染和擴散情況，結果如圖5所示。24 h p.t.，在vAcvp39KO、vAcSevp39：FLAG和vAcvp39：FLAG等3種重組病毒轉染的Sf9細胞中約有20%的細胞產生熒光，熒光分布情況也基本一致，表明三者具有基本一致的轉染效率。72 h p.t.，在vAcvp39KO和vAcSevp39：FLAG轉染的Sf9細胞中產生熒光的細胞數(shù)與24 h p.t.相比未見增加，而vAcvp39：FLAG轉染Sf9細胞中幾乎所有的細胞均可觀察到綠色熒光，說明vAcSevp39：FLAG不能產生可感染性的BV。96 h p.t.，普通光鏡觀察結果顯示，在vAcvp39KO、vAcSevp39：FLAG和vAcvp39：FLAG等3種重組病毒轉染的Sf9細胞中均能產生包涵體（Occlusion body，OB）（圖5），表明3種重組病毒感染Sf9細胞的進程基本一致。

為進一步確定vAcSevp39：FLAG的感染性BV產生能力，分別定量1 μg vAcvp39KO、vAcSevp39：FLAG和vAcvp39：FLAG等3種重組病毒bacmid DNA轉染Sf9細胞，收取轉染后不同時間點的細胞培養(yǎng)上清液，測定病毒滴度，繪制病毒生長曲線，結果如圖6所示。在vAcvp39KO和vAcSevp39：FLAG轉染的細胞中，從24 h p.t.到120 h p.t.均未檢測到感染性病毒粒子BV產生，而在vAcvp39：FLAG轉染的細胞中，從24 h p.t.開始檢測到病毒滴度，至96 h p.t.達高峰，表明其產生BV的能力較高。

綜合顯微鏡觀察和轉染生長曲線的結果，SeMNPV VP39不能替代AcMNPV VP39在AcMNPV BV產生中行使功能。

2. 4 重組病毒轉染Sf9細胞的透射電鏡觀察結果

為確定SeMNPV VP39替代AcMNPV VP39對病毒形態(tài)發(fā)生的影響，分別定量2 μg vAcvp39KO、vAcSevp39：FLAG和vAcvp39：FLAG bacmid DNA轉染Sf9細胞，于72 h p.t.收集Sf9細胞，制備電鏡樣品，使用透射電子顯微鏡對樣品進行電鏡觀察，結果如圖7所示。在vAcvp39：FLAG轉染的Sf9細胞中顯示出桿狀病毒感染的典型特征，包括含有大量正常形態(tài)核衣殼的VS在核內形成（圖7-a），在細胞核中VS外的環(huán)帶區(qū)域可觀察到大量病毒誘導產生的微囊泡（文中未顯示）、大量含有核衣殼的ODV（圖7-b）和包埋有大量ODV的OB（圖7-c）。在vAcvp39KO轉染的Sf9細胞中，雖然能形成與vAcvp39：FLAG形態(tài)相似的VS，但在VS和環(huán)帶區(qū)域未觀察到任何衣殼結構，大量不正常的電子致密小體（圖7-d中以白色箭頭標識）出現(xiàn)在VS中（圖7-d），在環(huán)帶區(qū)域可觀察到大量的微囊泡，但無ODV出現(xiàn)在環(huán)帶區(qū)域（圖7-e）和OB中（圖7-f）。在vAcSevp39：FLAG轉染的Sf9細胞中，與vAcvp39KO現(xiàn)象類似，可觀察到無任何衣殼結構但具有大量的電子致密小體（圖7-g中以白色箭頭標識）的VS（圖7-g），而這些電子致密小體常存在于不能產生正常核衣殼的AcMNPV感染的細胞中（Olszewski and Miller，1997;Zhu et al.，2013;Guan et al.，2016）;環(huán)帶區(qū)域有大量的微囊泡，但無ODV（圖7-h），OB中無ODV包埋（圖7-i）;但與vAcvp39KO不同的是，在vAcSevp39：FLAG轉染的Sf9細胞核中可觀察到大量異常的缺乏電子致密核心即含有病毒DNA的核蛋白的電子透明的長衣殼結構（圖7-h中以白色三角形標識）。

綜合上述觀察結果，SeMNPV VP39在AcMNPV的衣殼結構裝配中具有功能，但不能挽救vAcvp39KO的核衣殼形成。

3 討論

VP39是桿狀病毒核衣殼最主要的結構蛋白，在所有已測序的桿狀病毒基因組中保守（Pearson et al.，1988;Blissard et al.，1989;van Oers and Vlak，2007;Wang et al.，2010b）。本課題組前期通過構建C端融合FLAG標簽的AcMNPV vp39全長補回型重組病毒vAcvp39：FLAG和vp39缺失型重組病毒vAcvp39KO，并證實AcMNPV vp39的缺失導致病毒核衣殼裝配受阻（Li et al.，2021）。本研究在bAcvp39KO的基礎上構建表達C端融合FLAG標簽的SeMNPV VP39的vp39假型AcMNPV，并利用該重組病毒探究SeMNPV VP39取代AcMNPV VP39對AcMNPV的病毒產生和核衣殼裝配的影響，結果表明，SeMNPV VP39取代AcMNPV VP39導致病毒不能產生可感染性的病毒粒子BV，也未能裝配產生核衣殼，但能產生大量電子透明的不含病毒DNA的長管狀衣殼類似結構，即SeMNPV VP39能挽救vAcvp39KO的衣殼裝配，但在AcMNPV中不具備裝配核衣殼的能力。

與vAcSevp39：FLAG表型相似，一些桿狀病毒核衣殼相關基因的缺失會導致AcMNPV的核衣殼裝配受阻及產生大量不正常的空的長管狀衣殼類似結構，這些基因包括vlf-1（Vanarsdall et al.， 2006）、38k（Wu et al.，2006）、ac53（Liu et al.，2008）、BV/ODV-C42（Li et al.，2010）、p6.9（Wang et al.， 2010a）、pk-1（Liang et al.，2013）、vp91（Zhu et al.， 2013）、vp1054（Guan et al.，2016）和ac102（Hepp et al.，2018）。核衣殼基底結構蛋白P78/83是Wiskott-Aldrich蛋白家族成員（Russell et al.，1997;Goley et al.，2006），在桿狀病毒感染細胞內絲狀肌動蛋白（Filamentous actin，F(xiàn)-actin）的形成過程中具有重要作用，F(xiàn)-actin為核衣殼的正確組裝提供支架（Goley et al.，2006;Ohkawa et al.，2010;Rohrmann，2019）。BV/ODV-C42基因編碼的BV/ODV-C42蛋白是新合成的P78/83從細胞質進入細胞核行使功能的必需蛋白，同時，BV/ODV-C42蛋白還通過抑制P78/83的降解而使其保持性能穩(wěn)定（Wang et al.，2008;Wang et al.，2015）。近年來，有研究表明，BV/ODV-C42蛋白能與P78/83、ODV-EC27和ac102編碼的Ac102蛋白相互作用形成P78/83-BV/ODV-C42-ODV-EC27-Ac102蛋白復合物（Hepp et al.，2018）。Ac102通過與BV/ODV-C42蛋白相互作用而抑制BV/ODV-C42的泛素化，降低BV/ODV-C42的蛋白酶降解，從而保證P78/83啟動actin聚合形成F-actin的活性（Zhang et al.，2018）。此外，p6.9基因編碼的P6.9蛋白能與桿狀病毒DNA結合，并負責桿狀病毒新合成DNA的壓縮以利于包裝進衣殼形成核衣殼（Funk and Consigli，1993;Liu et al.，2012），38k基因編碼的蛋白38K在P6.9去磷酸化從而行使此功能中發(fā)揮關鍵作用（Lai et al.，2018）。

核衣殼裝配是一個需要大量蛋白共同參與的復雜過程。有研究表明，VP39與其自身及核衣殼相關蛋白38K、ODV-EC27、BV/ODV-C42、P78/83和宿主細胞蛋白actin間存在相互作用（Lanier and Volkman，1998;Lu et al.，2004;Braunagel and Summers，2007;Wu et al.，2008），暗示VP39與這些蛋白通過相互作用共同參與核衣殼的裝配，且這些相互作用在核衣殼的裝配中發(fā)揮關鍵作用。蛋白發(fā)生相互作用后，其空間構象與單個蛋白相比可能會發(fā)生轉變（Makalliwa et al.，2018）。本研究發(fā)現(xiàn)，以SeMNPV VP39替代AcMNPV VP39導致病毒核衣殼裝配受阻，盡管在感染細胞的核中出現(xiàn)許多缺乏病毒DNA的空的長管狀衣殼類似結構，考慮到SeMNPV VP39與AcMNPV VP39的氨基酸序列相似性只有43%，相對偏低。因此，在vAcSpltvp39：FLAG感染Sf9細胞中SeMNPV VP39可能不被AcMNPV的38K、ODV-EC27、BV/ODV-C42、P78/83或其他相關蛋白充分識別而產生相互作用或相互作用較弱，從而可能影響這些蛋白的構象轉變。蛋白構象的不完全轉變可能導致蛋白不能充分行使功能，如SeMNPV VP39與AcMNPV 38K較弱的相互作用可能引起38K構象發(fā)生不完全轉變，從而導致38K的活性降低，活性較低的38K可能不足以適當介導P6.9的去磷酸化，致使在vAcSpltvp39：FLAG中無病毒DNA包裝進入衣殼形成正常的核衣殼。這些結果也暗示vp39雖然是桿狀病毒核心基因，存在于所有桿狀病毒中，但vp39基因已進化以適應每種病毒與宿主的相互作用，從而有利于病毒在宿主中的復制和擴增。

4 結論

本研究成功構建能表達C端融合FLAG標簽的SeMNPV VP39的vp39假型AcMNPV，且發(fā)現(xiàn)SeMNPV VP39雖然在AcMNPV的衣殼裝配中具有功能，但在AcMNPV中不具有裝配形成核衣殼的能力，導致vp39假型AcMNPV不能產生BV和ODV。本研究結果不僅為進一步探究桿狀病毒核衣殼的裝配機制打下基礎，還為探究保守基因進化以適應每種病毒與宿主的相互作用提供了信息。

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（責任編輯 麻小燕）