李鵬飛 肖賀賀 劉明珠 李夢夢 黃亞明 余慶

摘要：【目的】探究桑葉提取物成分對石斑魚虹彩病毒（SGIV）的抑制作用，并對其抗病毒機制進行研究，為利用桑葉提取物成分研發(fā)抗SGIV藥物提供理論依據(jù)，也為開發(fā)高效安全的新型抗病毒漁用藥物提供新思路。【方法】利用石斑魚脾臟組織細胞系（GS），通過光學(xué)顯微鏡觀察及CCK-8檢測分析桑葉水提物（Morus alba L. water extracts，MAE）及其活性成分異槲皮苷（Isoquercetin，IQ）的安全工作濃度，然后使用實時熒光定量PCR及核酸適配體熒光分子探針技術(shù)（Q2-AFMP）分析MAE和IQ對SGIV的抗病毒效果;通過分析SGIV感染GS細胞中MCP基因和VP19基因的表達水平，分析IQ對SGIV的粒子結(jié)構(gòu)及其與宿主細胞表面結(jié)合、侵入宿主細胞和在宿主細胞中復(fù)制的影響，探究IQ體外抗SGIV的作用機制?！窘Y(jié)果】桑葉源化合物成分（MAE和IQ）對GS細胞的最高安全工作濃度為：MAE≤10.0 mg/mL，IQ≤1000.0 μg/mL。與接入SGIV的GS細胞相比，在以安全工作濃度的MAE（10.0 mg/mL）和IQ（1000.0 μg/mL）分別接入SGIV孵育感染的GS細胞后細胞病變（CPEs）明顯減少，MCP基因和VP19基因的相對表達量均呈極顯著下降趨勢（P<0.01，下同），GS細胞熒光值也極顯著降低，表明桑葉源化合物成分能有效抑制SGIV感染。以IQ處理SGIV孵育感染的GS細胞，其細胞內(nèi)MCP基因和VP19基因的相對表達量均呈極顯著下降趨勢，提示IQ能破壞SGIV的粒子結(jié)構(gòu)，并干擾SGIV對宿主細胞的吸附、侵入和復(fù)制?！窘Y(jié)論】MAE和IQ對SGIV具有良好的抗病毒效果，其中IQ能在病毒吸附、侵入和復(fù)制階段發(fā)揮抗病毒作用，即桑葉源化合物成分在防治SGIV感染方面具有潛在的應(yīng)用價值，可作為研發(fā)抗SGIV感染的有效藥用成分。

關(guān)鍵詞： 石斑魚虹彩病毒（SGIV）;桑葉水提物（MAE）;異槲皮苷（IQ）;抗病毒機制

Abstract：【Objective】This study aimed to explore the antiviral effects and mechanisms of Morus alba L. extracts on grouper iridovirus（SGIV）， and provide data support and theoretical basis for developing anti-SGIV drugs with Morus alba extracts and offer new ideas for developing efficient and safe antiviral fishing drugs. 【Method】The safe working concentrations of M. alba water extracts（MAE） and its active component isoquercetin（IQ） were determined on grouper spleen tissue cell line（GS） by light microscope observation and CCK-8 cell viability assay. Then， real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR） and aptamer Q2-based fluorescent molecular probe assay（Q2-AFMP） were used to analyze the antiviral effects of MAE and IQ against SGIV in vitro. RT-qPCR was further applied to detect the expression level of MCP gene and VP19 gene in SGIV infected cells， and explore the antiviral mechanism of IQ， including the effects of IQ onSGIV particles， SGIV bound to host cell surface， SGIV invasion and replication in host cells. 【Result】The safe working concentrations of M. alba extracts on GS cells were that， MAE≤10.0 mg/mL，IQ≤1000.0 μg/mL. The research results of MAE and IQ against SGIV showed that， compared to GS cells only incubated with SGIV， the cytopathic effects（CPEs） of GS cells incubated with both SGIV and M. alba extracts（10.0 mg/mL MAE and 1000.0 μg/mL IQ） in the experimental groups were greatly reduced. MCP gene and VP19 gene in experimental group cells decreased extremely significantly（P<0.01， the same below）， and the fluorescence intensity of GS cells decreased significantly. The above results indicated that MAE and IQ could effectively combat SGIV infection. GS cells incubated with SGIV treated with IQ showed extremely significant decrease in the relative expression of both the intracellular MCP gene and the VP19 gene， it showed that， IQ could destroy the SGIV particles structure and interfere with the adsorption， invasion and replication of SGIV to host cells. 【Conclusion】MAE and IQ have great antiviral effects on SGIV， and IQ plays an antiviral role in the stages of virus adsorption， invasion and replication.M. alba extracts have potentials in the treatments of SGIV infection， and can be used in the development of fishery drugs for inhibiting SGIV infection.

Key words： grouper iridovirus（SGIV）; Morus alba L. water extracts（MAE）; isoquercetin（IQ）; antiviral mechanism

0 引言

【研究意義】石斑魚（Epinephelus spp.）隸屬于鱸形目（Perciformes）鮨科（Serranidae），是水產(chǎn)業(yè)中的一種重要海水養(yǎng)殖魚類，其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，具有蛋白含量高、脂肪含量低的食用優(yōu)點，是海水養(yǎng)殖最名貴的品種之一（王大鵬等，2012）。我國的石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)量需求一直居高不下，早在2017年就達13萬t（李鵬飛等，2018）。我國石斑魚養(yǎng)殖以南方地區(qū)為主，主要分布在南海附近，近年來隨著人工苗種繁育技術(shù)的迅速發(fā)展、養(yǎng)殖環(huán)境的不斷優(yōu)化及養(yǎng)殖方式的優(yōu)良改進，石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)逐步進入蓬勃發(fā)展階段（肖賀賀等， 2019）。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴大，導(dǎo)致魚類疾病的暴發(fā)率不斷上升，嚴重威脅著石斑魚養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。石斑魚虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus，SGIV）是石斑魚養(yǎng)殖生產(chǎn)中最嚴重的病毒性病原之一，給石斑魚養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失（Li et al.，2015，2018）。SGIV是一種致病性高、傳染速度快的魚類病原微生物，在掃描電鏡下觀察其結(jié)構(gòu)呈六邊形，直徑約200 nm（Qin et al.，2003;Chao et al.，2004;Lü et al.，2005;Huang et al.，2015）。感染SGIV的石斑魚表現(xiàn)出食欲不振及肝脾臟腫大的典型癥狀，且在感染后短期內(nèi)即出現(xiàn)大批量死亡（Qin et al.，2003），因此研發(fā)可有效抗SGIV感染的藥物對保障石斑魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】藥物防治仍是目前控制水產(chǎn)病害的主要手段，但長期使用抗生素等化學(xué)藥物極易產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留問題，且許多國家已嚴令禁止抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中濫用。疫苗接種是預(yù)防和控制病毒傳染最有效的途徑。Ouyang等（2012）研發(fā)出SGIV滅活疫苗，通過對石斑魚進行腹腔注射SGIV滅活疫苗，發(fā)現(xiàn)在疫苗接種后30 d內(nèi)可對人工感染SGIV的石斑魚產(chǎn)生保護作用，石斑魚存活率在90%以上。疫苗作為控制病毒性病害的預(yù)防策略，必須在魚體感染病毒之前進行預(yù)防性接種，而不能用于治療魚類病毒性疾病。此外，全病毒滅活疫苗尚存在一定缺陷，如疫苗具有未完全滅活的風(fēng)險，且水生動物的免疫劑量較陸生動物更大、使用成本更高等（Davis and McCluskie，1999;Sommerset et al.，2005）。因此，研發(fā)新型高效的抗病毒功能產(chǎn)品對控制石斑魚養(yǎng)殖中SGIV感染勢在必行。藥用植物中通常含有黃酮類、苷類、有機酸、糖類、揮發(fā)油、生物堿及氨基酸等多種生物活性成分，這些生物活性成分不僅發(fā)揮抑菌和抗病毒等功效，還能促進動物生長及增加體重，同時具有增強機體免疫的能力（Shang et al.，2011;Shi et al.，2012;Kwon et al.，2015;Wang et al.，2015）。已有研究證實，綠茶（Wang et al.，2016）、紫花地丁（Yu et al.，2019b）、番石榴葉（陳小龍，2020）、廣西莪術(shù)（Liu et al.，2020b）、八角茴香（Liu et al.，2020c）及金銀花（Liu et al.，2020d）等多種藥用植物提取物對水生病毒具有顯著的抑制效果。桑葉（Morus alba L.）是我國傳統(tǒng)的中藥，安全且無毒副作用，異槲皮苷（Isoquercetin，IQ）是桑葉的主要活性成分之一，具有良好的抑菌、抗病毒及抗腫瘤等功效，藥用價值極高（穆春旭等，2012;楊永玉，2012）。近年來，利用桑葉活性化學(xué)成分抗病毒的研究已有較多報道，如桑葉提取物能有效抑制單純皰疹病毒（HSV）（鄭民實，1990）、人類免疫缺陷病毒（HIV）（Tierney et al.，1995）及呼吸道合胞病毒（RSV）（戴開金等，2009）等，但尚缺乏系統(tǒng)的作用機制研究?！颈狙芯壳腥朦c】SGIV是嚴重威脅石斑魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的病毒性病原之一，其感染致死率在90%以上，因此迫切需要研發(fā)出能有效抵抗SGIV感染的藥物以確保石斑魚養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。【擬解決的關(guān)鍵問題】基于已知的桑葉提取物藥理作用及其抗病毒活性，探究桑葉水提物成分對SGIV的抑制作用，并對其抗病毒機制進行深入研究，為利用桑葉提取物成分研發(fā)抗SGIV藥物提供理論依據(jù)，也為開發(fā)高效安全的新型抗病毒漁用藥物提供新思路。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

桑葉粉碎制成粉末，稱量25 g桑葉粉末浸泡于500 mL水中，4 ℃浸泡過夜，次日將桑葉藥包及浸泡液置于鍋中煎煮獲得桑葉水提物（M. alba L. water extrasts，MAE）母液，并定容至初始母液濃度為250.0 mg/mL。MAE經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩ＩＨ~主要活性化合物成分異槲皮苷（IQ）購自成都瑞芬思生物科技有限公司，以二甲硫亞砜（DMSO）溶解，并定容至初始濃度為100.0 mg/mL。石斑魚脾臟組織細胞系（Grouper spleen，GS）由廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點實驗室建立，石斑魚虹彩病毒廣西株（SGIV-GX）分離自廣西人工養(yǎng)殖的珍珠龍膽石斑魚（Xiao et al.，2019）。

1. 2 細胞安全工作濃度確定

將GS細胞接種至96孔細胞培養(yǎng)板，28 ℃培養(yǎng)18 h。試驗組GS細胞加入稀釋至不同濃度的MAE和IQ進行孵育培養(yǎng)，對照組GS細胞不作任何處理。培養(yǎng)24和48 h時，分別于光學(xué)顯微鏡下進行細胞形態(tài)觀察。培養(yǎng)48 h后向各處理組GS細胞中加入10 μL CCK-8溶液，室溫避光孵育4 h，然后采用全波長掃描酶標(biāo)儀檢測各處理組GS細胞在450 nm處的吸光值，設(shè)3個重復(fù)。將測得的吸光值帶入公式（1）計算各處理組GS細胞的存活率：

1. 3 實時熒光定量PCR檢測SGIV感染情況

將GS細胞接種至12孔細胞培養(yǎng)板，28 ℃培養(yǎng)18 h后收集各孔細胞及其上清液，3000×g離心3 min，收集細胞沉淀并提取各處理組GS細胞樣品總RNA，再用HiFiScript cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板、β-actin基因為內(nèi)參基因，利用實時熒光定量PCR檢測SGIV主要衣殼蛋白MCP基因和囊膜蛋白VP19基因的表達情況，每組樣品均設(shè)3個重復(fù)。實時熒光定量PCR擴增引物序列信息見表1。

1. 4 基于核酸適配體Q2的熒光分子探針檢測SGIV感染情況

核酸適配體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)篩選獲得能高特異性識別結(jié)合靶標(biāo)物質(zhì)的單鏈核酸（Li et al.，2018;Yu et al.，2019a）。Q2是本課題組篩選獲得能高特異性高親和性識別SGIV感染細胞的核酸適配體（Li et al.，2015，2018），其5'端用6-羧基熒光素（FAM）進行標(biāo)記。核酸適配體FAM-Q2序列信息為5'-FAM-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCGTATGTCCATGGCCGCATATTGGGAAGGTTGG TTTGGACTATGTGGAAGTTCGAAGGACGCAGAT GAAGTCTC-3'。將GS細胞接種至12孔細胞培養(yǎng)板，對各處理組GS細胞進行處理后收集各孔細胞，GS細胞與FAM-Q2探針在4 ℃避光條件下孵育30 min，3000×g離心3 min，棄上清液，以PBS輕輕漂洗后將細胞沉淀重懸于200 μL PBS中，使用流式細胞儀檢測分析各處理組GS細胞熒光值（495/535 nm）的變化情況。每組樣品均設(shè)3個重復(fù)。

1. 5 MAE和IQ體外抗SGIV效果分析

將GS細胞接種至12孔細胞培養(yǎng)板，28 ℃培養(yǎng)18 h。具體分組如下：對照組1（CK1）GS細胞正常培養(yǎng);對照組2（CK2）GS細胞接入4 μL SGIV-GX（107 TCID50/mL），28 ℃繼續(xù)培養(yǎng);試驗組GS細胞接入安全工作濃度的藥物（MAE和IQ）及SGIV-GX，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后于光學(xué)顯微鏡下觀察各處理組的GS細胞，同時收集各處理組細胞樣品分別進行實時熒光定量PCR和Q2-AFMP檢測，分析MAE和IQ體外抗SGIV的效果。每組樣品均設(shè)3個重復(fù)。

1. 6 IQ體外抗SGIV作用機制研究

1. 6. 1 IQ對SGIV-GX粒子結(jié)構(gòu)的影響 將SGIV-GX與稀釋至安全工作濃度的IQ在4 ℃下孵育2 h，然后在4 ℃下25000×g離心2 h，棄上清液，將離心得到的SGIV-GX粒子重懸于TN緩沖液中;對照組為SGIV-GX與L15培養(yǎng)基共同孵育、離心收集并重懸。然后將SGIV-GX懸液接入12孔細胞培養(yǎng)板的GS細胞中，28 ℃感染48 h，收集各孔的細胞樣品進行實時熒光定量PCR檢測。每組樣品均設(shè)3個重復(fù)。

1. 6. 2 IQ對SGIV-GX吸附于GS細胞表面的影響

將GS細胞接種至12孔細胞培養(yǎng)板，28 ℃培養(yǎng)18 h。稀釋至安全工作濃度的IQ與SGIV-GX混勻后接入12孔細胞培養(yǎng)板的GS細胞中，4 ℃下孵育1 h;對照組僅接入SGIV-GX。孵育結(jié)束后棄上清液，以L15培養(yǎng)基清洗GS細胞2次，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)12 h。收集各孔細胞樣品進行實時熒光定量PCR檢測。每組樣品均設(shè)3個重復(fù)。

1. 6. 3 IQ對SGIV-GX侵入宿主細胞的影響 將GS細胞接種至12孔細胞培養(yǎng)板，28 ℃培養(yǎng)18 h。SGIV-GX與冰上預(yù)冷的L15培養(yǎng)基混勻，然后接入12孔細胞培養(yǎng)板的GS細胞中，4 ℃下孵育1 h，使SGIV-GX吸附于宿主細胞表面。孵育1 h后棄上清液，將稀釋至安全工作濃度的IQ加入到各孔細胞中;對照組則接入L15培養(yǎng)基進行處理。28 ℃培養(yǎng)2 h后棄上清液，用L15培養(yǎng)基清洗GS細胞;28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)10 h，收集各孔細胞樣品進行實時熒光定量PCR檢測。每組樣品均設(shè)3個重復(fù)。

1. 6. 4 IQ對SGIV-GX在宿主細胞中復(fù)制的影響

將GS細胞接種至12孔細胞培養(yǎng)板，28 ℃培養(yǎng)18 h。SGIV-GX與冰上預(yù)冷的L15培養(yǎng)基混勻，然后接入12孔細胞培養(yǎng)板的GS細胞中，4 ℃下孵育1 h，移除含SGIV-GX的L15培養(yǎng)基，再加入L15培養(yǎng)基，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使SGIV-GX進入宿主細胞。28 ℃培養(yǎng)2 h后棄上清液，加入稀釋至安全工作濃度的IQ;對照組則接入L15培養(yǎng)基進行處理。28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)10 h后，收集各孔細胞樣品進行實時熒光定量PCR檢測。每組樣品均設(shè)3個重復(fù)。

1. 7 統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 6和Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行處理并制圖，并利用SPSS 17.0分別進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncans多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 MAE和IQ對GS細胞的安全工作濃度

以不同濃度的MAE和IQ分別與GS細胞孵育48 h，通過光學(xué)顯微鏡觀察GS細胞形態(tài)，并采用全波長掃描酶標(biāo)儀檢測GS細胞存活率。由圖1-A可看出，在安全工作濃度范圍（MAE≤10.0 mg/mL，IQ≤1000.0 μg/mL）內(nèi)，桑葉源化合物成分（MAE和IQ）與GS細胞孵育培養(yǎng)48 h后，GS細胞基本能保持正常生長，細胞形態(tài)與對照組的正常GS細胞一致，但桑葉源化合物成分濃度高于安全工作濃度后，GS細胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)變化，具體表現(xiàn)為細胞呈不同程度的皺縮、逐漸變圓或脫離細胞培養(yǎng)板等。使用CCK-8溶液進一步檢測各處理組GS細胞的存活率，結(jié)果（圖1-B）顯示，MAE≤10.0 mg/mL時GS細胞的存活率與對照組的正常GS細胞無顯著差異（P>0.05，下同），但MAE>10.0 mg/mL后GS細胞的存活率極顯著低于對照組正常GS細胞（P<0.01，下同）;IQ≤1000.0 μg/mL時，試驗組GS細胞的存活率雖然極顯著低于對照組的正常GS細胞，但光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果顯示GS細胞保持正常生長。因此，確定桑葉源化合物成分對GS細胞的最高安全工作濃度為：MAE≤10.0 mg/mL，IQ≤1000.0 μg/mL。

2. 2 MAE和IQ體外抗SGIV-GX的效果

2. 2. 1 光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果 光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果（圖2）顯示，在僅接入SGIV-GX的CK2組GS細胞中出現(xiàn)大量典型細胞病變（Cytopathic effects，CPEs）。與CK2組的GS細胞相比，將安全工作濃度的MAE（10.0 mg/mL）和IQ（1000.0 μg/mL）分別接入經(jīng)SGIV-GX孵育感染的GS細胞后，CPEs均明顯減少，說明桑葉源化合物成分（MAE和IQ）能有效抑制SGIV感染GS細胞。

2. 2. 2 實時熒光定量PCR檢測結(jié)果 如圖3所示，與僅接入SGIV-GX的CK2組GS細胞相比，試驗組GS細胞接入安全工作濃度的桑葉源化合物成分（MAE和IQ）共同孵育后，GS細胞中MCP基因和VP19基因的相對表達量均呈極顯著下降趨勢，表明桑葉源化合物成分能有效抑制SGIV-GX感染，且具有劑量依賴性。

2. 2. 3 Q2-AFMP檢測結(jié)果 使用流式細胞儀檢測分析各處理組GS細胞熒光值的變化情況，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，與僅接入SGIV-GX的GS細胞相比，試驗組GS細胞加入安全工作濃度的桑葉源化合物成分（MAE和IQ）共同孵育后，GS細胞熒光值極顯著降低，且隨著MAE和IQ濃度的增加GS細胞熒光強度越弱，表明MAE和IQ具有抑制SGIV-GX感染的作用。

2. 3 IQ抗SGIV-GX的作用機制

2. 3. 1 IQ對SGIV-GX粒子結(jié)構(gòu)的影響 如圖5所示，與僅接入SGIV-GX的對照組GS細胞相比，將IQ處理SGIV-GX接入試驗組的GS細胞后，細胞中MCP基因和VP19基因的相對表達量均呈極顯著下降趨勢，提示IQ是通過破壞SGIV-GX粒子結(jié)構(gòu)而發(fā)揮抗病毒作用。

2. 3. 2 IQ對SGIV-GX與宿主細胞表面結(jié)合的抑制作用 如圖6所示，與僅接入SGIV-GX的對照組GS細胞相比，將IQ處理SGIV-GX接入試驗組GS細胞后，細胞中MCP基因和VP19基因的相對表達量均呈極顯著下降趨勢，即吸附于宿主細胞上的病毒數(shù)量明顯少于對照組GS細胞。故推測在SGIV-GX感染GS細胞的過程中，IQ能有效抑制SGIV-GX與宿主細胞表面結(jié)合位點的結(jié)合。

2. 3. 3 IQ對SGIV-GX侵入宿主細胞的抑制作用

如圖7所示，與僅接入SGIV-GX的對照組GS細胞相比，將IQ接入經(jīng)SGIV-GX感染的試驗組GS細胞后，細胞中MCP基因和VP19基因的相對表達量均呈極顯著下降趨勢，說明侵入宿主細胞的病毒數(shù)量明顯少于對照組GS細胞?？梢?，IQ能在SGIV-GX侵入宿主細胞階段發(fā)揮抑制作用。

2. 3. 4 IQ對SGIV-GX在宿主細胞中復(fù)制的抑制作用

試驗組GS細胞在SGIV-GX感染2 h后，加入安全工作濃度的IQ（1000.0 μg/mL），28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)10 h。如圖8所示，與僅接入SGIV-GX的對照組GS細胞相比，試驗組GS細胞中VP19基因的相對表達量呈極顯著下降趨勢，而MCP基因的相對表達量無顯著變化，表明IQ能抑制SGIV-GX在宿主細胞中的復(fù)制。

3 討論

藥用植物作為抗生素等化學(xué)藥物的潛在替代品，具有天然來源、生態(tài)友好、活性化合物成分豐富及成本低廉等優(yōu)點（Bulfon et al.，2015;李鵬飛等，2018）。近年來，具有天然免疫功能及抗病毒特性的天然產(chǎn)品在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究也備受關(guān)注（Reverter et al.，2014;Beltrán et al.，2018）。根據(jù)藥用植物提取物對魚類的積極作用，將其添加至魚類飼料中可有效促進魚體生長早熟及增強防御機制和免疫應(yīng)答能力（Galina et al.，2009;Newaj-Fyzul and Austin，2015;Vallejos-Vidal et al.，2016;Awad and Awaad，2017）。桑葉作為一味傳統(tǒng)中藥，富含IQ和槲皮素（Quercetin）等多種生物活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。已有研究證實，桑葉提取物成分可有效改善魚類糖脂代謝，提高免疫力及抗氧化能力，提高其生長性能，因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有極高的開發(fā)利用價值（Sheikhlar et al.，2014;楊繼華等，2017;夏鑫等，2019）。桑葉提取物在抗病毒方面的應(yīng)用也有研究報道。王輝等（2016）利用細胞病變減少法（CPE）檢測發(fā)現(xiàn)，多個桑葉樣品的有機萃取組分或水相組分對單純皰疹病毒1型（HSV-1）、甲型流感病毒（FluA）及登革病毒2型（DV2）等多種病毒具有抑制作用，且抗病毒活性具有選擇性，不同桑品種間的提取物成分抗病毒活性也存在一定差異。Kim等（2020）研究證實IQ能有效抑制人類皰疹病毒（HHV）的復(fù)制。本研究首次探究桑葉源化合物成分對SGIV的抑制作用，分析以桑葉提取物成分研發(fā)抗SGIV漁用藥物的潛力，并系統(tǒng)研究IQ抑制SGIV感染的抗病毒機理，為研發(fā)綠色安全的抗病毒藥物提供理論依據(jù)。

細胞系代替實驗動物，已廣泛用于免疫學(xué)、生物技術(shù)應(yīng)用及各類病原菌發(fā)病機制研究等方面（Qin et al.，2006;Li et al.，2016，2017;Zhou et al.，2017;余慶等，2018）。GS細胞系來源于褐點石斑魚的脾臟組織，是一種極易感染虹彩病毒的宿主細胞（彭超，2015）。本研究通過探究桑葉源化合物成分（MAE和IQ）對SGIV的潛在抗病毒作用，首先分析MAE和IQ對GS細胞的安全工作濃度，最終確定桑葉源化合物成分對GS細胞的最高安全工作濃度為：MAE≤10.0 mg/mL，IQ≤1000.0 μg/mL，即在安全工作濃度范圍內(nèi)桑葉源化合物成分對GS細胞并無明顯的毒性作用。然后采用光學(xué)顯微鏡觀察、實時熒光定量PCR及Q2-AFMP檢測桑葉提取物抑制SGIV-GX感染的效果，Q2-AFMP是一種監(jiān)測病毒感染情況的有效方法，其檢測結(jié)果與實時熒光定量PCR檢測結(jié)果基本一致。與實時熒光定量PCR相比，Q2-AFMP檢測具有檢測快速、易于操作、靈敏度高及特異性強等優(yōu)點，對快速診斷病毒感染和篩選抗病毒藥物具有較大的應(yīng)用潛力（Yu et al.，2019a;Liu et al.，2020a）。桑葉源化合物成分（MAE和IQ）對SGIV-GX感染均具有極顯著的抑制作用，且抗病毒效應(yīng)具有劑量依賴性。黃筱鈞（2014）研究發(fā)現(xiàn)桑葉對RSV有明顯的抑制作用，既能抑制RSV的吸附和生物合成，又能直接殺死病毒。此外，有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素和IQ在體外體內(nèi)均能顯著抑制流感病毒的復(fù)制，且IQ的抗病毒作用大于槲皮素（Kim et al.，2010;Thapa et al.，2012）。

在確定桑葉源化合物成分具有良好抗病毒效果的基礎(chǔ)上，進一步對其抗SGIV-GX感染的作用機制進行系統(tǒng)研究。本研究結(jié)果表明，與未經(jīng)藥物處理的SGIV-GX相比，經(jīng)IQ處理后SGIV-GX對宿主細胞的感染能力極顯著降低，提示IQ可能是通過破壞SGIV-GX的粒子結(jié)構(gòu)而發(fā)揮抗病毒作用。病毒感染的主要步驟是先吸附于宿主細胞膜上，然后穿透宿主細胞膜在宿主細胞中復(fù)制，再從宿主細胞釋放出來（Seisenberger et al.，2001;Fukuyama and Kawaoka，2011）。了解病毒與宿主細胞的相互作用機制，對研發(fā)新型高效的抗病毒及促抗病毒藥物至關(guān)重要。因此，系統(tǒng)研究IQ在SGIV-GX感染GS細胞時的抑制作用機制，結(jié)果證實IQ通過干擾SGIV-GX對GS細胞的吸附、侵入和復(fù)制而發(fā)揮抗病毒作用，且以在病毒吸附和侵入階段的抗病毒效果最顯著。Gaudry等（2018）通過研究IQ對寨卡病毒的作用機制，證實IQ是通過阻止病毒顆粒進入宿主細胞而發(fā)揮抗病毒作用。因此，推測IQ與宿主細胞表面受體發(fā)生競爭性結(jié)合，阻止病毒吸附于宿主細胞表面，從而發(fā)揮抗病毒作用。

4 結(jié)論

MAE和IQ對SGIV具有良好的抗病毒效果，其中IQ能在病毒吸附、侵入和復(fù)制階段發(fā)揮抗病毒作用，即桑葉源化合物成分在防治SGIV感染方面具有潛在的應(yīng)用價值，可作為研發(fā)抗SGIV感染的有效藥用成分。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）