張耀文，于明，岳青陽(yáng)，劉美辰，徐萬(wàn)魁*（1.遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，沈陽(yáng) 110036；2.遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，沈陽(yáng) 110036）

目前，國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)針對(duì)氨甲苯酸的報(bào)道多為臨床應(yīng)用方面[4-6]，針對(duì)氨甲苯酸注射液的降解產(chǎn)物尚未見(jiàn)報(bào)道。在藥物生產(chǎn)貯存過(guò)程中，保證藥物的穩(wěn)定性是非常重要的，藥物的穩(wěn)定性與藥品作用的發(fā)揮密切相關(guān)，外界環(huán)境因素對(duì)藥物穩(wěn)定性的影響是不可避免的，環(huán)境中的氧氣、溫度、濕度及光照等因素都會(huì)對(duì)藥物的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響[7-9]。而國(guó)家藥品計(jì)劃抽驗(yàn)探索性研究中的穩(wěn)定性試驗(yàn)?zāi)康氖橇私獠煌a(chǎn)企業(yè)雜質(zhì)情況及影響因素。本次試驗(yàn)樣品是抽樣不同生產(chǎn)企業(yè)的氨甲苯酸注射液，來(lái)自于不同省市，運(yùn)輸及貯藏條件存在差異，因而在常規(guī)的高溫、光照等破壞的同時(shí)增加了日曬破壞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有部分企業(yè)樣品出現(xiàn)變色。因此本試驗(yàn)重點(diǎn)考察日曬對(duì)氨甲苯酸注射液有關(guān)物質(zhì)和pH 值的影響，對(duì)氨甲苯酸注射液日曬的降解產(chǎn)物進(jìn)行研究。采用UHPLC-Q Exactive Focus MS 方法對(duì)影響因素試驗(yàn)產(chǎn)生的雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并對(duì)其毒性與遺傳毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)本品的安全性進(jìn)行全面控制。

1 儀器與試藥

Waters e2695 液相色譜儀、2998 UVD 檢測(cè)器（美國(guó)Waters 公司）；Vanquish 超高效液相色譜儀、Q Exactive Focus MS（美國(guó)Thermo 公司）；XP205型電子分析天平、S400 Seven excellent 型pH 計(jì)（瑞士Mettler-Toledo 公司）；恒溫恒濕箱（KBF115德國(guó)BINDER）；結(jié)構(gòu)解析軟件Mass Frontier、小分子未知物定性軟件Compound Discoverer（美國(guó)Thermo 公司）；Derek Nexus 6.1.0 和Sarah Nexus 3.1.0 遺傳毒性預(yù)測(cè)軟件（英國(guó)Lhasa 有限公司）；YB-2 型澄明度檢測(cè)儀（天大天發(fā)科技有限公司）。

9 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)A～I(xiàn) 的氨甲苯酸注射液各2批（規(guī)格均為100 mg/10 mL）。乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液（磷酸氫二鈉11.0 g，辛烷磺酸鈉1.0 g，加水800 mL 使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至2.5，加水至900 mL）-乙腈（88∶12，V/V）；柱溫：40℃；流速：1 mL·min－1；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm。

2.2 UHPLC MS 條件

色譜柱：Thermo Acclaim 120 C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流動(dòng)相：20 mmol·L－1醋酸銨溶液（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 值至4.0）-甲醇（80∶20，V/V）；柱溫：40℃；流速：0.5 mL·min－1；進(jìn)樣體積：2 μL；樣品盤(pán)溫度：8℃，UV：230 nm。

噴霧電壓：3500 V，霧化溫度：400℃，鞘氣壓力：40 arb，輔助氣壓力：10 arb，離子傳輸管溫度：300℃，掃描模式：Full Scan-ddms2正負(fù)離子切換，掃描范圍：m/z50～930，分辨率：70 000。

2.3 溶液配制

2.3.1 有關(guān)物質(zhì)供試品溶液配制 精取氨甲苯酸注射液樣品1 mL 置25 mL 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3.2 有關(guān)物質(zhì)對(duì)照溶液配制 精取供試品溶液100 μL 置100 mL 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。

所以說(shuō)，在有錢(qián)人的心里，非常重視“現(xiàn)在”這個(gè)時(shí)間點(diǎn)。因?yàn)橄乱粋€(gè)瞬間會(huì)發(fā)生什么事不知道，這就是一種“風(fēng)險(xiǎn)”。因此，他們盡可能把握現(xiàn)在，把不確定的風(fēng)險(xiǎn)排除，這才是他們的作風(fēng)。

2.3.3 雜質(zhì)鑒別樣品配制 取戶外光照10 d 的H企業(yè)樣品，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取濾液直接進(jìn)樣。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.4.1 高溫試驗(yàn) 將待測(cè)樣品打開(kāi)外包紙盒，保留完整安瓿，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，在70℃條件下放置30 d，于第5、10 和30日取樣進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)考察樣品的性狀。

2.4.2 強(qiáng)光照射試驗(yàn) 將待測(cè)樣品打開(kāi)外包紙盒，保留完整安瓿，于照度4500 Lx 的光源下照射，于第5、10日取樣進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)考察樣品的性狀。

2.4.3 日曬試驗(yàn) 將待測(cè)樣品打開(kāi)外包紙盒，保留完整安瓿，置于戶外，放置10 d，于第5、10日取樣進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)考察樣品的性狀和pH 值。

2.4.4 安瓿瓶的影響 將各企業(yè)樣品分別灌裝于洗凈的西林瓶中，密塞，放置10 d，取樣檢測(cè)，同時(shí)考察樣品的性狀和pH 值。

3 結(jié)果

3.1 氨甲苯酸注射液高溫試驗(yàn)結(jié)果

在70 ℃放置30 d，9 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)樣品的性狀無(wú)明顯變化，有關(guān)物質(zhì)色譜中各峰無(wú)明顯變化，相對(duì)保留時(shí)間約為1.83 的已知雜質(zhì)4-甲?；郊姿岬暮繜o(wú)明顯變化。表明氨甲苯酸注射液對(duì)溫度相對(duì)穩(wěn)定，典型圖譜見(jiàn)圖1和2。

圖1 I 企業(yè)氨甲苯酸注射液Fig 1 Chromatogram of aminomethylbenzoic acid injection from I company

圖2 I 企業(yè)氨甲苯酸注射液于70℃放置30 dFig 2 Chromatogram of aminomethylbenzoic acid injection from I company placed at 70℃ for 30 days

3.2 氨甲苯酸注射液強(qiáng)光照射試驗(yàn)結(jié)果

9 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)樣品的性狀無(wú)明顯變化，有關(guān)物質(zhì)色譜中各峰無(wú)明顯變化，4-甲?；郊姿岬暮繜o(wú)明顯變化。表明氨甲苯酸注射液對(duì)強(qiáng)光照射相對(duì)穩(wěn)定，典型圖譜見(jiàn)圖3。

圖3 I 企業(yè)氨甲苯酸注射液于4500 Lx 照射10 dFig 3 Chromatogram of aminomethylbenzoic acid injection from I company placed at 4500 Lx for 10 days

3.3 氨甲苯酸注射液日曬試驗(yàn)結(jié)果

樣品放置5 d 時(shí)注射液樣品顏色無(wú)明顯變化，放置10 d 時(shí)部分企業(yè)樣品顏色變黃。日曬時(shí)溫度與光照同時(shí)作用于樣品，使氨甲苯酸注射液中雜質(zhì)含量明顯增加，特別是6.8 min 的未知雜質(zhì)峰，日曬照射后未變色樣品中該雜質(zhì)含量較低，變色樣品中該雜質(zhì)含量增大，見(jiàn)圖4[實(shí)際雜質(zhì)峰（6.881 min）與前后峰分離度均大于1.5，分離度較好]。有關(guān)物質(zhì)檢查主要考察6.8 min 未知雜質(zhì)、15.9 min的4-甲?；郊姿岷统阎s質(zhì)其他雜質(zhì)之和。日曬試驗(yàn)中樣品變化情況見(jiàn)表1。

圖4 I 企業(yè)氨甲苯酸注射液日曬10 dFig 4 Aminomethylbenzoic acid injection from I company after sunshine for 10 days

由表1可見(jiàn)，當(dāng)樣品中保留時(shí)間為6.8 min的雜質(zhì)達(dá)到一定量時(shí)，溶液顏色變黃；其含量為0.1%左右時(shí)，溶液為微黃色至淡黃色；含量為0.2%左右時(shí)，溶液為黃色。日照10 d 的樣品中，4-甲?；郊姿岬暮柯杂性黾?，總雜質(zhì)含量增加，但均與樣品顏色變化無(wú)相關(guān)性。樣品pH 值無(wú)明顯變化（溶液顏色與2020年版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)比色液中的黃色標(biāo)準(zhǔn)液比較，微黃色至淡黃色當(dāng)相于Y2～Y6，黃色相當(dāng)于Y7～Y8）。

表1 日曬試驗(yàn)中樣品變化情況Tab 1 Sample changes in the solar test

3.4 對(duì)安瓿瓶影響的考察

將各企業(yè)樣品密封于安瓿瓶放置5 d 時(shí)注射液樣品顏色無(wú)明顯變化，放置10 d 時(shí)部分企業(yè)樣品顏色變黃，且變黃樣品對(duì)應(yīng)的企業(yè)及該企業(yè)樣品的變色程度與樣品在原包裝日曬破壞時(shí)結(jié)果相同，結(jié)果表明安瓿瓶對(duì)樣品變色無(wú)影響，且日曬條件具有可重復(fù)性。

3.5 對(duì)6.8 min 未知雜質(zhì)的研究

利用UHPLC-Q Exactive Focus MS 對(duì)6.8 min雜質(zhì)進(jìn)行定性研究，對(duì)雜質(zhì)的一、二級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，確定化合物及二級(jí)碎片裂解規(guī)律。

一級(jí)質(zhì)譜圖給出[M-H]分子離子峰m/z167.035 11，二級(jí)質(zhì)譜可見(jiàn)丟失CO2所得特征碎片m/z123.0452，進(jìn)一步碎裂CH2O 所得m/z93.0345。運(yùn)用Mass Frontier 軟件輔助Compound Discoverer 軟件，對(duì)該化合物的碎片結(jié)構(gòu)進(jìn)行歸屬，推測(cè)該雜質(zhì)為3-羥基-4-羥甲基苯甲酸。雜質(zhì)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5，質(zhì)譜定性見(jiàn)圖6。

圖5 3-羥基-4-羥甲基苯甲酸結(jié)構(gòu)Fig 5 Structure of 3-hydroxy-4-hydroxymethyl benzoic acid

圖6 目標(biāo)雜質(zhì)的質(zhì)譜圖Fig 6 Mass spectrum of target impurity

3.6 雜質(zhì)毒性預(yù)測(cè)

采用Derek Nexus 6.1.0（基于知識(shí)規(guī)則的）和Sarah Nexus 3.1.0（基于統(tǒng)計(jì)學(xué)的）對(duì)雜質(zhì)3-羥基-4-羥甲基苯甲酸進(jìn)行遺傳毒性預(yù)測(cè)，并根據(jù)ICH M7指導(dǎo)原則對(duì)其毒性分級(jí)，結(jié)果見(jiàn)表2。3-羥基-4-羥甲基苯甲酸屬遺傳毒性5 級(jí)，沒(méi)有警示結(jié)構(gòu)。

表2 雜質(zhì)毒性預(yù)測(cè)Tab 2 Toxicity prediction of impurity

4 討論

日照10 d，9 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)氨甲苯酸注射液的顏色和有關(guān)物質(zhì)明顯不同。9 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)氨甲苯酸注射液涉及5 個(gè)原料藥生產(chǎn)企業(yè)的氨甲苯酸，加氯化鈉和不加氯化鈉2 種處方，7 個(gè)企業(yè)的低硼硅玻璃安瓿。本試驗(yàn)通過(guò)明確樣品中產(chǎn)生6.8 min 雜質(zhì)的內(nèi)因，推測(cè)其來(lái)源。結(jié)果表明，安瓿對(duì)氨甲苯酸注射液變色無(wú)影響，在變色樣品中，有含氯化鈉及不含氯化鈉2 種處方，因此，處方是否含氯化鈉對(duì)氨甲苯酸注射液變色無(wú)影響。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，所有變色樣品均使用國(guó)內(nèi)同一企業(yè)的原料藥，推測(cè)變色可能與原料藥有關(guān)。

氨甲苯酸注射液中有關(guān)物質(zhì)含量較低。在70 ℃條件放置30 d，性狀基本上沒(méi)有變化，有關(guān)色譜圖無(wú)明顯變化，可知氨甲苯酸注射液對(duì)溫度相對(duì)穩(wěn)定。于照度4500 Lx 的光源下照射10 d，性狀基本上沒(méi)有變化，有關(guān)色譜圖無(wú)明顯變化，可知氨甲苯酸注射液對(duì)強(qiáng)光照射相對(duì)穩(wěn)定。將樣品暴露于日光中，5 d 時(shí)注射液樣品顏色無(wú)明顯變化，放置10 d 時(shí)部分企業(yè)樣品顏色變黃，氨甲苯酸注射液中雜質(zhì)含量明顯增加，特別是6.8 min 的未知雜質(zhì)峰，同時(shí)其他雜質(zhì)總量雖也明顯增加，但雜質(zhì)數(shù)目及各雜質(zhì)增量并無(wú)規(guī)律性。由表1中可見(jiàn)B 企業(yè)4-甲?；郊姿岷棵黠@增加，但樣品仍為無(wú)色，C 企業(yè)4-甲?；郊姿岷棵黠@高于樣品顯淡黃色的E、F 和G 企業(yè)，但C 企業(yè)樣品無(wú)色，說(shuō)明樣品變色與4-甲酰基苯甲酸無(wú)關(guān)，綜上推測(cè)樣品變色與6.8 min 雜質(zhì)有關(guān)。通過(guò)UHPLC-Q Exactive Focus MS 推測(cè)出該雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)為3-羥基-4-羥甲基苯甲酸，且當(dāng)其含量為0.1%左右時(shí)，溶液為微黃色至淡黃色；當(dāng)含量為0.2%左右時(shí)，溶液為黃色。采用Derek Nexus 6.1.0 和Sarah Nexus 3.1.0 對(duì)3-羥基-4-羥甲基苯甲酸進(jìn)行毒性預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果表明該雜質(zhì)屬遺傳毒性5 級(jí)，沒(méi)有警示結(jié)構(gòu)。綜上，提示氨甲苯酸注射液采用棕色安瓿包裝宜，應(yīng)避免陽(yáng)光直射。