張耀文,于明,岳青陽,劉美辰,徐萬魁*(1.遼寧省檢驗檢測認(rèn)證中心,沈陽 110036;2.遼寧省藥品檢驗檢測院,沈陽 110036)
目前,國內(nèi)文獻(xiàn)針對氨甲苯酸的報道多為臨床應(yīng)用方面[4-6],針對氨甲苯酸注射液的降解產(chǎn)物尚未見報道。在藥物生產(chǎn)貯存過程中,保證藥物的穩(wěn)定性是非常重要的,藥物的穩(wěn)定性與藥品作用的發(fā)揮密切相關(guān),外界環(huán)境因素對藥物穩(wěn)定性的影響是不可避免的,環(huán)境中的氧氣、溫度、濕度及光照等因素都會對藥物的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響[7-9]。而國家藥品計劃抽驗探索性研究中的穩(wěn)定性試驗?zāi)康氖橇私獠煌a(chǎn)企業(yè)雜質(zhì)情況及影響因素。本次試驗樣品是抽樣不同生產(chǎn)企業(yè)的氨甲苯酸注射液,來自于不同省市,運輸及貯藏條件存在差異,因而在常規(guī)的高溫、光照等破壞的同時增加了日曬破壞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有部分企業(yè)樣品出現(xiàn)變色。因此本試驗重點考察日曬對氨甲苯酸注射液有關(guān)物質(zhì)和pH 值的影響,對氨甲苯酸注射液日曬的降解產(chǎn)物進(jìn)行研究。采用UHPLC-Q Exactive Focus MS 方法對影響因素試驗產(chǎn)生的雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,并對其毒性與遺傳毒性進(jìn)行評價,對本品的安全性進(jìn)行全面控制。
Waters e2695 液相色譜儀、2998 UVD 檢測器(美國Waters 公司);Vanquish 超高效液相色譜儀、Q Exactive Focus MS(美國Thermo 公司);XP205型電子分析天平、S400 Seven excellent 型pH 計(瑞士Mettler-Toledo 公司);恒溫恒濕箱(KBF115德國BINDER);結(jié)構(gòu)解析軟件Mass Frontier、小分子未知物定性軟件Compound Discoverer(美國Thermo 公司);Derek Nexus 6.1.0 和Sarah Nexus 3.1.0 遺傳毒性預(yù)測軟件(英國Lhasa 有限公司);YB-2 型澄明度檢測儀(天大天發(fā)科技有限公司)。
9 個生產(chǎn)企業(yè)A~I(xiàn) 的氨甲苯酸注射液各2批(規(guī)格均為100 mg/10 mL)。乙腈為色譜純,其他試劑為分析純,水為超純水。
色譜柱:ZORBAX SB C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:磷酸鹽緩沖液(磷酸氫二鈉11.0 g,辛烷磺酸鈉1.0 g,加水800 mL 使溶解,用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至2.5,加水至900 mL)-乙腈(88∶12,V/V);柱溫:40℃;流速:1 mL·min-1;進(jìn)樣體積:10 μL;檢測波長:230 nm。
色譜柱:Thermo Acclaim 120 C18(150 mm×4.6 mm,3 μm);流動相:20 mmol·L-1醋酸銨溶液(用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 值至4.0)-甲醇(80∶20,V/V);柱溫:40℃;流速:0.5 mL·min-1;進(jìn)樣體積:2 μL;樣品盤溫度:8℃,UV:230 nm。
噴霧電壓:3500 V,霧化溫度:400℃,鞘氣壓力:40 arb,輔助氣壓力:10 arb,離子傳輸管溫度:300℃,掃描模式:Full Scan-ddms2正負(fù)離子切換,掃描范圍:m/z50~930,分辨率:70 000。
2.3.1 有關(guān)物質(zhì)供試品溶液配制 精取氨甲苯酸注射液樣品1 mL 置25 mL 量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。
2.3.2 有關(guān)物質(zhì)對照溶液配制 精取供試品溶液100 μL 置100 mL 量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻,作為對照溶液。
所以說,在有錢人的心里,非常重視“現(xiàn)在”這個時間點。因為下一個瞬間會發(fā)生什么事不知道,這就是一種“風(fēng)險”。因此,他們盡可能把握現(xiàn)在,把不確定的風(fēng)險排除,這才是他們的作風(fēng)。
2.3.3 雜質(zhì)鑒別樣品配制 取戶外光照10 d 的H企業(yè)樣品,經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過,取濾液直接進(jìn)樣。
2.4.1 高溫試驗 將待測樣品打開外包紙盒,保留完整安瓿,置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中,在70℃條件下放置30 d,于第5、10 和30日取樣進(jìn)行檢測,同時考察樣品的性狀。
2.4.2 強光照射試驗 將待測樣品打開外包紙盒,保留完整安瓿,于照度4500 Lx 的光源下照射,于第5、10日取樣進(jìn)行檢測,同時考察樣品的性狀。
2.4.3 日曬試驗 將待測樣品打開外包紙盒,保留完整安瓿,置于戶外,放置10 d,于第5、10日取樣進(jìn)行檢測,同時考察樣品的性狀和pH 值。
2.4.4 安瓿瓶的影響 將各企業(yè)樣品分別灌裝于洗凈的西林瓶中,密塞,放置10 d,取樣檢測,同時考察樣品的性狀和pH 值。
在70 ℃放置30 d,9 個生產(chǎn)企業(yè)樣品的性狀無明顯變化,有關(guān)物質(zhì)色譜中各峰無明顯變化,相對保留時間約為1.83 的已知雜質(zhì)4-甲?;郊姿岬暮繜o明顯變化。表明氨甲苯酸注射液對溫度相對穩(wěn)定,典型圖譜見圖1和2。
圖1 I 企業(yè)氨甲苯酸注射液Fig 1 Chromatogram of aminomethylbenzoic acid injection from I company
圖2 I 企業(yè)氨甲苯酸注射液于70℃放置30 dFig 2 Chromatogram of aminomethylbenzoic acid injection from I company placed at 70℃ for 30 days
9 個生產(chǎn)企業(yè)樣品的性狀無明顯變化,有關(guān)物質(zhì)色譜中各峰無明顯變化,4-甲?;郊姿岬暮繜o明顯變化。表明氨甲苯酸注射液對強光照射相對穩(wěn)定,典型圖譜見圖3。
圖3 I 企業(yè)氨甲苯酸注射液于4500 Lx 照射10 dFig 3 Chromatogram of aminomethylbenzoic acid injection from I company placed at 4500 Lx for 10 days
樣品放置5 d 時注射液樣品顏色無明顯變化,放置10 d 時部分企業(yè)樣品顏色變黃。日曬時溫度與光照同時作用于樣品,使氨甲苯酸注射液中雜質(zhì)含量明顯增加,特別是6.8 min 的未知雜質(zhì)峰,日曬照射后未變色樣品中該雜質(zhì)含量較低,變色樣品中該雜質(zhì)含量增大,見圖4[實際雜質(zhì)峰(6.881 min)與前后峰分離度均大于1.5,分離度較好]。有關(guān)物質(zhì)檢查主要考察6.8 min 未知雜質(zhì)、15.9 min的4-甲?;郊姿岷统阎s質(zhì)其他雜質(zhì)之和。日曬試驗中樣品變化情況見表1。
圖4 I 企業(yè)氨甲苯酸注射液日曬10 dFig 4 Aminomethylbenzoic acid injection from I company after sunshine for 10 days
由表1可見,當(dāng)樣品中保留時間為6.8 min的雜質(zhì)達(dá)到一定量時,溶液顏色變黃;其含量為0.1%左右時,溶液為微黃色至淡黃色;含量為0.2%左右時,溶液為黃色。日照10 d 的樣品中,4-甲?;郊姿岬暮柯杂性黾?,總雜質(zhì)含量增加,但均與樣品顏色變化無相關(guān)性。樣品pH 值無明顯變化(溶液顏色與2020年版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)比色液中的黃色標(biāo)準(zhǔn)液比較,微黃色至淡黃色當(dāng)相于Y2~Y6,黃色相當(dāng)于Y7~Y8)。
表1 日曬試驗中樣品變化情況Tab 1 Sample changes in the solar test
將各企業(yè)樣品密封于安瓿瓶放置5 d 時注射液樣品顏色無明顯變化,放置10 d 時部分企業(yè)樣品顏色變黃,且變黃樣品對應(yīng)的企業(yè)及該企業(yè)樣品的變色程度與樣品在原包裝日曬破壞時結(jié)果相同,結(jié)果表明安瓿瓶對樣品變色無影響,且日曬條件具有可重復(fù)性。
利用UHPLC-Q Exactive Focus MS 對6.8 min雜質(zhì)進(jìn)行定性研究,對雜質(zhì)的一、二級質(zhì)譜圖進(jìn)行分析,確定化合物及二級碎片裂解規(guī)律。
一級質(zhì)譜圖給出[M-H]分子離子峰m/z167.035 11,二級質(zhì)譜可見丟失CO2所得特征碎片m/z123.0452,進(jìn)一步碎裂CH2O 所得m/z93.0345。運用Mass Frontier 軟件輔助Compound Discoverer 軟件,對該化合物的碎片結(jié)構(gòu)進(jìn)行歸屬,推測該雜質(zhì)為3-羥基-4-羥甲基苯甲酸。雜質(zhì)結(jié)構(gòu)見圖5,質(zhì)譜定性見圖6。
圖5 3-羥基-4-羥甲基苯甲酸結(jié)構(gòu)Fig 5 Structure of 3-hydroxy-4-hydroxymethyl benzoic acid
圖6 目標(biāo)雜質(zhì)的質(zhì)譜圖Fig 6 Mass spectrum of target impurity
采用Derek Nexus 6.1.0(基于知識規(guī)則的)和Sarah Nexus 3.1.0(基于統(tǒng)計學(xué)的)對雜質(zhì)3-羥基-4-羥甲基苯甲酸進(jìn)行遺傳毒性預(yù)測,并根據(jù)ICH M7指導(dǎo)原則對其毒性分級,結(jié)果見表2。3-羥基-4-羥甲基苯甲酸屬遺傳毒性5 級,沒有警示結(jié)構(gòu)。
表2 雜質(zhì)毒性預(yù)測Tab 2 Toxicity prediction of impurity
日照10 d,9 個生產(chǎn)企業(yè)氨甲苯酸注射液的顏色和有關(guān)物質(zhì)明顯不同。9 個生產(chǎn)企業(yè)氨甲苯酸注射液涉及5 個原料藥生產(chǎn)企業(yè)的氨甲苯酸,加氯化鈉和不加氯化鈉2 種處方,7 個企業(yè)的低硼硅玻璃安瓿。本試驗通過明確樣品中產(chǎn)生6.8 min 雜質(zhì)的內(nèi)因,推測其來源。結(jié)果表明,安瓿對氨甲苯酸注射液變色無影響,在變色樣品中,有含氯化鈉及不含氯化鈉2 種處方,因此,處方是否含氯化鈉對氨甲苯酸注射液變色無影響。同時發(fā)現(xiàn),所有變色樣品均使用國內(nèi)同一企業(yè)的原料藥,推測變色可能與原料藥有關(guān)。
氨甲苯酸注射液中有關(guān)物質(zhì)含量較低。在70 ℃條件放置30 d,性狀基本上沒有變化,有關(guān)色譜圖無明顯變化,可知氨甲苯酸注射液對溫度相對穩(wěn)定。于照度4500 Lx 的光源下照射10 d,性狀基本上沒有變化,有關(guān)色譜圖無明顯變化,可知氨甲苯酸注射液對強光照射相對穩(wěn)定。將樣品暴露于日光中,5 d 時注射液樣品顏色無明顯變化,放置10 d 時部分企業(yè)樣品顏色變黃,氨甲苯酸注射液中雜質(zhì)含量明顯增加,特別是6.8 min 的未知雜質(zhì)峰,同時其他雜質(zhì)總量雖也明顯增加,但雜質(zhì)數(shù)目及各雜質(zhì)增量并無規(guī)律性。由表1中可見B 企業(yè)4-甲?;郊姿岷棵黠@增加,但樣品仍為無色,C 企業(yè)4-甲?;郊姿岷棵黠@高于樣品顯淡黃色的E、F 和G 企業(yè),但C 企業(yè)樣品無色,說明樣品變色與4-甲?;郊姿釤o關(guān),綜上推測樣品變色與6.8 min 雜質(zhì)有關(guān)。通過UHPLC-Q Exactive Focus MS 推測出該雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)為3-羥基-4-羥甲基苯甲酸,且當(dāng)其含量為0.1%左右時,溶液為微黃色至淡黃色;當(dāng)含量為0.2%左右時,溶液為黃色。采用Derek Nexus 6.1.0 和Sarah Nexus 3.1.0 對3-羥基-4-羥甲基苯甲酸進(jìn)行毒性預(yù)測,預(yù)測結(jié)果表明該雜質(zhì)屬遺傳毒性5 級,沒有警示結(jié)構(gòu)。綜上,提示氨甲苯酸注射液采用棕色安瓿包裝宜,應(yīng)避免陽光直射。