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        黃芩UPLC-DAD指紋圖譜的建立及其黃芩苷和漢黃芩苷的含量研究

        2021-10-09 08:15:56鄭如文劉港輝江志強董玉君張俊華程國華廣州白云山光華制藥股份有限公司廣州508暨南大學藥學院廣州5063
        中南藥學 2021年9期
        關鍵詞:評價

        鄭如文,劉港輝,江志強,董玉君,張俊華,程國華*(.廣州白云山光華制藥股份有限公司,廣州508;.暨南大學藥學院,廣州 5063)

        黃芩是唇形科黃芩屬多年生草本植物,干燥根為藥用部位,具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎的功效[1],可用于肺熱咳嗽、胎動不安等癥。黃芩中活性成分以黃酮類化合物為主,包括野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素 A 等,其中黃芩苷是評價黃芩藥材質量的主要依據(jù)[2-3]?!吨袊幍洹?020年版一部中收載了HPLC 法測定黃芩苷成分的含量標準[4],但未見其他黃酮類成分及指紋圖譜的檢測標準。中藥指紋圖譜作為鑒定和評價中藥質量的重要技術,已經(jīng)成為國內(nèi)外中藥材和天然藥物質量控制的常用方法[5-7]。

        超高效液相色譜技術(UPLC)能夠快速地分析和鑒定藥材中的化學成分,具有高分辨率的特點[8-9]。本研究采用UPLC 和優(yōu)化的超聲提取方法[10-12],同時測定黃芩苷和漢黃芩苷成分的含量并建立相應的指紋圖譜,為黃芩藥材的質量評價方法提供參考。

        1 材料

        1.1 儀器與試藥

        UPLC-DAD(Agilent Infinity 1290Ⅱ);KQ-500VDB 數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);XPE26 型百萬分之一天平、ML204T型萬分之一天平(美國梅特勒公司);BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm,Waters);黃芩苷(批號:110715-201821,純度:95.4%)、漢黃芩苷(批號:112002-201702,純度:98.5%)、野黃芩苷(批號:110842-201709,供含量測定用)、黃芩素(批號:111595-201808,供含量測定用)、漢黃芩素(批號:111514-201706,供含量測定用)對照品(中國食品藥品檢定研究院),千層紙素A對照品(批號:Y31M9H62597,供含量測定用,源葉生物);甲酸(分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);乙腈(色譜純,德國默克公司);甲醇(分析純,廣州化學試劑廠)。

        1.2 樣品

        共采集5 個產(chǎn)地不同生長年限的26 批黃芩干燥根,經(jīng)暨南大學藥學院中藥教研室張英副教授鑒定均為唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensisGeorgi)。來源見表1。

        表1 不同產(chǎn)地黃芩干燥根的來源Tab 1 Sources of dried roots of Scutellaria baicalensis Georgi from different origins

        2 方法

        2.1 色譜條件

        色譜柱:BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流動相:0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫14 min(見表2),后運行5 min;檢測波長280 nm;流速0.4 mL·min-1;柱溫40 ℃;進樣量2 μL。

        表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution

        2.2 指紋圖譜共有峰的確定

        將樣品的色譜數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012 版)”,系統(tǒng)生成黃芩藥材的對照指紋圖譜(見圖1)。通過對照品明確黃芩藥材的6 個特征峰(見圖2),分別為野黃芩苷(1)、黃芩苷(2)、漢黃芩苷(3)、黃芩素(4)、漢黃芩素(5)和千層紙素A(6),保留時間分別約為2.5、5.3、8.5、10.5、12.2、12.4 min,選黃芩苷(B)作為參照峰(S),計算6 個特征峰的相對保留時間、相對峰面積。

        圖1 黃芩樣品的UPLC 對照指紋圖譜Fig 1 UPLC spectra of Scutellaria baicalensis samples

        圖2 黃芩樣品與黃芩對照品的指紋圖譜Fig 2 Fingerprints of Scutellaria baicalensis sample and standards

        2.3 溶液的制備

        2.3.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷29 mg、漢黃芩苷6 mg 于同一50 mL 量瓶中(均經(jīng)折算),加甲醇定容,搖勻。配成黃芩苷質量濃度為0.58 mg·mL-1、漢黃芩苷質量濃度為0.12 mg·mL-1的混合對照品溶液。

        2.3.2 供試品溶液的制備 稱取黃芩粉末(過65目篩)約0.3 g,精密稱定,置于100 mL 具塞錐形瓶中,精密移取50 mL 70%甲醇于錐形瓶中,稱重,超聲50 min,冷卻至室溫后補足失重,搖勻過濾,取1 mL 續(xù)濾液,置于10 mL 量瓶中,加70%甲醇定容,搖勻,用0.45 μm 微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,作為供試品溶液,待測。

        2.4 含量測定方法學考察

        2.4.1 線性關系考察 精密移取混合對照品溶液適量制得黃芩苷質量濃度分別為0.5473、0.2736、0.1368、0.0684、0.0342、0.0171、0.0086 mg·mL-1和漢黃芩苷質量濃度分別為 0.1108、0.0554、0.0277、0.0139、0.0069、0.0035、0.0017 mg·mL-1的系列混合對照品溶液。吸取各混合對照品溶液2 μL 注入高效液相色譜儀,按“2.1”項下色譜條件進行分析。以對照品質量濃度(X)為橫坐標,峰面積積分值(Y)為縱坐標,制備標準曲線,得到回歸方程見表3。

        表3 黃芩苷與漢黃芩苷回歸方程Tab 3 Regression equation of baicalin and wogonin

        2.4.2 重復性試驗 精密稱取同一份黃芩藥材粉末6 份,按“2.3.2”項下方法制備6 份供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進行分析,記錄峰面積,計算黃芩苷、漢黃芩苷平均含量的RSD值分別為1.4%和1.3%,表明方法重復性好。

        2.4.3 精密度試驗 精密吸取同一份黃芩供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次,每次進樣量2 μL。記錄黃芩苷、漢黃芩苷的峰面積積分值,結果兩者含量的RSD分別為0.25%和0.36%,表明分析方法精密度良好。

        2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一黃芩供試品溶液(n=6),按“2.1”項下色譜條件,分別在0、2、4、6、8、12、24 h 進樣,記錄黃芩苷、漢黃芩苷的峰面積,結果兩者含量的RSD值分別為0.42%和1.3%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

        2.4.5 加樣回收試驗 取已知含量的黃芩藥材0.1 g,各平行操作6 份,分別精密加入黃芩苷對照品(約13 mg)和漢黃芩苷對照品(約3 mg),按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液,并按“2.1”項下色譜條件進行檢測,結果黃芩苷、漢黃芩苷的平均回收率為98.0%和99.2%,RSD<5%,表明方法回收率良好。

        2.5 指紋圖譜方法學考察

        2.5.1 精密度試驗 以黃芩苷(B)為參照峰(S),計算其余5個共有峰的相對保留時間與相對峰面積,并采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”進行評價,結果顯示各共有峰的相對保留時間RSD在0.12%~0.19%,相對峰面積的RSD在0.11%~0.54%,表明儀器精密度良好(見圖3)。

        圖3 精密度指紋圖譜Fig 3 Fingerprint of precision

        2.5.2 重復性試驗 以黃芩苷(B)為參照峰(S),計算其余5 個共有峰的相對保留時間與相對峰面積,并采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012 版)”進行評價,結果顯示各共有峰的相對保留時間RSD在 0.10%~0.15%,相對峰面積的RSD在 0.26%~3.8%,表明方法重復性良好(見圖4)。

        圖4 重復性指紋圖譜Fig 4 Fingerprint of repetitive

        2.5.3 穩(wěn)定性試驗 以黃芩苷(B)為參照峰(S),計算其余5 個共有峰的相對保留時間與相對峰面積,并采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012 版)”進行評價,結果顯示各共有峰的相對保留時間RSD在 0.10%~0.23%,相對峰面積的RSD在 0.38%~1.3%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定(見圖5)。

        圖5 穩(wěn)定性指紋圖譜Fig 5 Fingerprint of stability

        3 結果

        3.1 樣品含量測定

        取26 批次黃芩樣品粉末(過65 目篩)各約0.3 g,每個樣品平行稱取2 份,按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液,并按“2.1”項下色譜條件進行分析,測量黃芩苷和漢黃芩苷的峰面積,計算樣品中黃芩苷和漢黃芩苷的百分含量,結果見表4。

        表4 26 批黃芩樣品中黃芩苷與漢黃芩苷的含量Tab 4 Contents of baicalin and wogonin in 26 batches of Scutellaria baicalensis Georgi

        3.2 指紋圖譜建立

        分別稱取26 批黃芩粉末按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液,注入超高液相色譜儀,得到樣品圖譜,將26 批樣品的色譜數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012 版)”,得到疊加指紋圖譜(見圖6),選擇黃芩苷(B)作為參照峰,計算6 個共有峰的相對保留時間、相對峰面積,結果相對保留時間的RSD均小于0.70%(見表5和表6),表明各批次之間的相對保留時間重現(xiàn)性和分離度好,特征峰明顯。

        表5 26 批黃芩樣品的共有峰相對保留時間Tab 5 Relative retention time of common peaks of 26 batches of Scutellaria baicalensis Georgi

        表6 26 批黃芩樣品的共有峰相對峰面積Fig 6 UPLC overlay fingerprints of 26 batches of Scutellaria baicalensis Georgi

        圖6 26 批黃芩樣品的UPLC 疊加指紋圖譜Fig 6 UPLC overlay fingerprints of 26 batches of Scutellaria baicalensis Georgi

        3.3 相似度分析

        采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012 版)”中位數(shù)法計算26 批黃芩藥材相似度,結果顯示S1~S26 的相似度均大于0.99,表明不同產(chǎn)地、不同季節(jié)及不同生長年限的黃芩藥材之間質量穩(wěn)定,一致性好,無異常樣品。

        3.4 聚類分析

        以26 批樣品的6 個共有峰相對于黃芩苷(B)的相對峰面積為變量,使用SPSS 22.0 軟件,采用組間連接和平方Euclidean 距離法進行系統(tǒng)聚類分析。結果顯示,當歐式距離為10 時,26 批樣品共分為5 類,相似度和聚類分析的結果基本一致,且與樣品的地域性關系不明顯(見圖7)。

        圖7 26 批黃芩樣品聚類分析圖Fig 7 Cluster analysis chart of 26 batches of Scutellaria baicalensis Georgi

        4 討論

        4.1 提取條件的優(yōu)化

        以黃芩苷得率為主要考察指標,考察不同溶劑(體積分數(shù)50%~70%甲醇,間隔10%)、不同目篩(50、65、80 目)和不同超聲時間(50、60、70 min)對提取效率的影響,結果表明,在70%甲醇,過65 目篩,超聲50 min 時,黃芩苷得率最高,可達17.34%,而按《中國藥典》2020年版的回流提取方法黃芩苷得率僅約12%。

        4.2 黃芩苷與漢黃芩苷的含量分析

        采集不同產(chǎn)地的26 批樣品中,除河北地區(qū)野生的3 個批次(S24、S25、S26)外,黃芩苷的百分含量均在9%以上,符合《中國藥典》2020年版要求。26 批黃芩藥材的黃芩苷和漢黃芩苷平均含量分別為12.75%、2.66%。山西產(chǎn)黃芩苷和漢黃芩苷含量最高的為春季三年生黃芩,陜西產(chǎn)黃芩苷和漢黃芩苷含量最高的為春季二年生黃芩,山東產(chǎn)黃芩苷和漢黃芩苷含量最高的為秋季二年生黃芩,甘肅產(chǎn)黃芩苷和漢黃芩苷含量最高的為秋季二年生黃芩,河北產(chǎn)黃芩苷和漢黃芩苷含量最高的為承德頭溝鎮(zhèn)春約一年生黃芩。5 個產(chǎn)地綜合比較,山東秋季二年生黃芩的黃芩苷含量最高,甘肅秋季二年生黃芩的漢黃芩苷含量最高。河北承德高臺寺鎮(zhèn)春野生2 中黃芩苷和漢黃芩苷含量均最低,河北野生黃芩中黃芩苷和漢黃芩苷的含量明顯比栽培黃芩低,這可能與其枯心和粗皮性狀以及表面泥土較多有關。

        不同生長年限中的黃芩苷和漢黃芩苷含量差異較大,但可以發(fā)現(xiàn)黃芩苷和漢黃芩苷含量總體呈二年生>一年生>三年生>野生的規(guī)律,二年生含量達到最高值。不同產(chǎn)地的黃芩苷平均含量:陜西>山東>甘肅>山西>河北,其中陜西、山東和甘肅產(chǎn)地的黃芩苷平均含量較一致,均在14%左右,河北產(chǎn)地黃芩苷含量最低,約9%;不同產(chǎn)地的漢黃芩苷平均含量:山東>甘肅>陜西>山西>河北,除河北地區(qū)較低外(約2%),其余4 個主產(chǎn)地的漢黃芩苷含量均在3%左右。

        4.3 小結

        本試驗在超高效液相色譜儀的基礎上,結合超聲優(yōu)化提取方法,采用0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)的流動相,梯度洗脫14 min,測定黃芩中的黃芩苷和漢黃芩苷的含量,并建立6 種黃酮類成分的指紋圖譜。各批次之間的相對保留時間重現(xiàn)性和分離度好,準確可靠,可為完善黃芩的質量控制與評價提供參考。

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