朱偉堃，周欣，王勁，曲智雅，趙丹彤，王素香（菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 菏澤 274000）

清熱解毒口服液屬清熱解毒類中成藥，收載于《中國藥典》2020年版一部[1]。清熱解毒口服液由石膏、金銀花、玄參、地黃、黃芩、梔子、連翹等12 味中藥組成，具有清熱解毒之功效，用于熱毒壅盛所致的發(fā)熱面赤、煩躁口渴、咽喉腫痛；流感、上呼吸道感染見上述證候者。該藥使用量較大，生產(chǎn)廠家眾多，據(jù)統(tǒng)計，目前全國有211家生產(chǎn)企業(yè)。本研究采用《中國藥典》方法對2020年山東省市場上流通的16 個廠家共42 批次清熱解毒口服液的相關(guān)質(zhì)量指標進行測定，分析不同廠家各項檢驗指標存在的差異，并開展了有關(guān)探索性研究，以評價現(xiàn)有質(zhì)量標準對藥品質(zhì)量控制的合理性和有效性，為生產(chǎn)企業(yè)提升藥品質(zhì)量提供思路，為監(jiān)管部門日常監(jiān)管提供有力依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 infinity Ⅱ高效液相色譜儀連接二極管陣列檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器（美國Agilent 公司），島津20AD 高效液相色譜儀（日本Shimdzu 公司），API4000 電噴霧三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Sciex公司），XS105 電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司），Seven Excellence 多參數(shù)測試儀（瑞士Mettler Toledo公司），超純水儀（美國Merk Millipore 公司）。

1.2 試藥

綠原酸（批號：110753-202018，含量以96.1%計）、梔子苷（批號：110749-201919，含量以97.1%計）、連翹苷（批號：110821-201816，含量以95.1%計）、黃芩苷（批號：110715-201821，含量以95.4%計）、灰氈毛忍冬皂苷乙（批號：111814-201604，含量以94.4%計）、短葶山麥冬皂苷C（批號：111908-201102）、山麥冬皂苷B（批號：111907-201804）、苯甲酸（批號：100419-201703，含量以99.9%計）、山梨酸（批號：190126-201501，含量以99.6%計）、4-羥基苯甲酸甲酯（批號：100278-201906，含量以99.9%計）、4-羥基苯甲酸丁酯（批號：110792-200503，含量以100.0%計）對照品及麥冬對照藥材（批號：121013-201711）（中國食品藥品檢定研究院）。

麥冬皂苷D（批號：PS200310-09，含量以99.58%計）、4-羥基苯甲酸丙酯（批號：AP161229-08，含量以99.34%計）、4-羥基苯甲酸乙酯（批號：AP170618-09，含量以99.82%計）、4-羥基苯甲酸異丁酯（批號：CN170213-21，含量以99.53%計）、4-羥基苯甲酸異丙酯（批號：CN180113-06，含量以99.60%）（對照品，斯坦福分析化學公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，美國Merck 公司），磷酸（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）。

所用飲片均購自亳州市中藥材市場，并經(jīng)菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院馬海春副主任中藥師鑒定為正品。清熱解毒口服液樣品來自2020年山東省內(nèi)市場流通抽樣，共16 個廠家的42 批次樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 法定標準檢驗

2.1.1 性狀 標準規(guī)定：本品為棕紅色的液體；味甜、微苦。依法檢驗，部分樣品性狀見圖1。結(jié)果42 批次樣品均符合規(guī)定，但廠家間樣品性狀差異較大，說明各廠家生產(chǎn)工藝有所差異。

圖1 部分樣品性狀圖Fig 1 Characters of some samples

2.1.2 薄層色譜 按《中國藥典》2020年版一部【鑒別】項下薄層色譜法進行檢驗，42 批次樣品均符合有關(guān)規(guī)定。部分批次薄層圖譜見圖2。部分廠家綠原酸、梔子苷、連翹苷和麥冬的斑點顏色較淺，說明各廠家原料投料質(zhì)量及工藝差異較大。

圖2 清熱解毒口服液薄層色譜圖Fig 2 Thin layer chromatogram of Qingre Jiedu oral liquid

2.1.3 pH 值 標準規(guī)定：應(yīng)為4.5～6.5。依法檢驗，結(jié)果42 批次清熱解毒口服液的pH 值介于5.0～5.8，均符合規(guī)定（見圖3A）。各批次樣品pH 值分布較為集中，說明各廠家對于樣品pH 值控制得較好。

2.1.4 含量測定 標準規(guī)定：本品每1 mL 含黃芩以黃芩苷（C21H18O11）計，不得少于1.0 mg。照《中國藥典》2020年版四部通則0512 外標法測定[2]。42 批次樣品中黃芩苷含量在1.1～3.7 mg·mL－1，均符合規(guī)定（見圖3B）。各批次樣品中黃芩苷含量分布較為離散，進一步說明各廠家黃芩投料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝差異較大。

圖3 42 批次樣品pH 值和黃芩苷含量測定結(jié)果Fig 3 pH and baicalin content of 42 batches samples

2.2 探索性研究

基于法定標準檢驗中發(fā)現(xiàn)的問題，薄層色譜中各批次樣品綠原酸、梔子苷、連翹苷斑點深淺不一的情況，并結(jié)合合劑項下的有關(guān)規(guī)定，本文開展了山銀花違規(guī)投料的篩查，綠原酸、梔子苷、連翹苷的含量測定，抑菌劑的使用規(guī)范性和山麥冬違規(guī)投料的篩查等有關(guān)探索性研究。

2.2.1 山銀花違規(guī)投料的篩查 清熱解毒口服液處方中金銀花用量較大，與其同科植物山銀花，兩者長期混用[3-4]?！吨袊幍洹?005年版一部按照“一物一名”的原則已將金銀花和山銀花明確區(qū)分為兩個品種[5]。因此，在藥品生產(chǎn)時應(yīng)嚴格按照處方工藝進行生產(chǎn)。兩者在藥材時相對較好區(qū)分，但制成制劑后現(xiàn)有標準無法將兩者區(qū)分。

本文以山銀花特征成分灰氈毛忍冬皂苷乙為指標[6-7]，建立了清熱解毒口服液中山銀花違規(guī)投料的篩查方法，方法學驗證均符合要求。主要測定條件：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫，流速為1.0 mL·min－1。蒸發(fā)光散射檢測器檢測，漂移管溫度為60℃，氣體流速為1.6 L·min－1，典型圖譜見圖4。研究發(fā)現(xiàn)，有2 家企業(yè)的4 批次樣品檢出山銀花特征成分灰氈毛忍冬皂苷乙，檢出率9.5%（見表1）。由此可知，盡管山銀花和金銀花已經(jīng)明確區(qū)分為兩個品種，但仍有部分企業(yè)主觀或客觀地將兩者混用。因此，清熱解毒口服液中增加山銀花篩查項目尤為必要。

圖4 清熱解毒口服液中山銀花篩查典型HPLC 圖譜Fig 4 HPLC chromatogram of Lonicerae flos in Qingre Jiedu oral liquid A.灰氈毛忍冬皂苷乙（lonicera saponins B）；B.陽性樣品（positive sample）

表1 清熱解毒口服液中山銀花違規(guī)投料篩查結(jié)果Tab 1 Lonicerae flos illegal added in Qingre Jiedu oral liquid

2.2.2 綠原酸、梔子苷和連翹苷的含量測定本文建立了綠原酸、梔子苷、連翹苷和黃芩苷同時測定的方法[8-10]，且方法學驗證均符合有關(guān)要求。主要測定條件：Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以甲醇為流動相A，0.1%磷酸為流動相B，梯度洗脫，流速為1.0 mL·min－1，檢測波長326 nm（0～25 min，測定綠原酸）、238 nm（25～35 min，測定梔子苷）、230 nm（35～45 min，測定連翹苷）、276 nm（45～70 min，測定黃芩苷）。典型圖譜見圖5。

圖5 清熱解毒口服液中多含量測定HPLC 圖譜Fig 5 HPLC chromatogram of multicomponent in Qingre Jiedu oral liquid

將新建立的方法和《中國藥典》方法測得的黃芩苷含量，用SPSS statistics 19.0 進行了差異顯著性分析，結(jié)果P＝0.379 ＞0.05，說明兩種方法的測定結(jié)果無顯著性差異，進一步說明建立的方法準確、可行。此外，結(jié)合自制的模擬樣品，制訂了相關(guān)限度，規(guī)定清熱解毒口服液中綠原酸不得低于0.25 mg·mL－1，梔子苷不得低于0.20 mg·mL－1，連翹苷不得低于0.02 mg·mL－1。結(jié)果42 批次樣品中，有8 家企業(yè)的21 批次樣品中綠原酸含量低于擬訂限度，2 家企業(yè)的3 批次樣品中梔子苷含量低于擬訂限度，1 家企業(yè)的2 批次樣品連翹苷含量低于擬訂限度，不合格率達50%，頻率分布直方圖見圖6。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，企業(yè)內(nèi)批次間4 種成分含量差異較小，但企業(yè)間4 種成分含量差異較大。

圖6 42 批次樣品4 種成分含量分布直方圖Fig 6 Histogram of 4 components in 42 batches samples

鑒于上述結(jié)果，本研究對企業(yè)間4 種成分的含量進行了統(tǒng)計（多于1 批次樣品的生產(chǎn)企業(yè)采用多批次樣品含量均值），見圖7。發(fā)現(xiàn)各企業(yè)4 種成分含量高低有一定的相關(guān)性，對4 種成分含量進行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明各成分間存在顯著正相關(guān)（見表2），說明樣品的優(yōu)劣是整體性的，而非個別指標的優(yōu)劣。因此，廠家應(yīng)從投料、工藝等各方面進行整體改進，才能夠真正提高樣品的質(zhì)量。

圖7 廠家間樣品含量結(jié)果比較Fig 7 Sample content from different manufactures

表2 相關(guān)性分析結(jié)果(n ＝42)Tab 2 Correlation analysis (n ＝42)

2.2.3 抑菌劑的檢查 《中國藥典》2020年版四部合劑項下規(guī)定，山梨酸和苯甲酸的用量不得超過0.3%，羥苯酯類的用量不得超過0.05%。參考有關(guān)文獻[11-13]，以山梨酸、苯甲酸、4-羥基苯甲酸甲酯、4-羥基苯甲酸乙酯、4-羥基苯甲酸丙酯、4-羥基苯甲酸丁酯、4-羥基苯甲酸異丁酯、4-羥基苯甲酸異丙酯為指標，建立清熱解毒口服液中測定8 種抑菌劑的液相-質(zhì)譜聯(lián)用方法，方法學驗證符合有關(guān)要求。主要測定條件，色譜：RESTEK Allure PFPP（2.1 mm×100 mm，5 μm）色譜柱；以0.01 mol·L－1醋酸銨為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫，流速為0.4 mL·min－1。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），正負離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。典型圖譜見圖8。

圖8 清熱解毒口服液中抑菌劑檢查典型圖譜Fig 8 HPLC-MS/MS chromatogram of antibacterial agent determination in Qingre Jiedu oral liquid

研究發(fā)現(xiàn)，42 批次樣品中，山梨酸和羥苯酯類抑菌劑均未檢出，苯甲酸有22 批次樣品檢出，但均符合規(guī)定，苯甲酸檢出結(jié)果詳見圖9，說明各廠家在抑菌劑的使用方面較為規(guī)范。

圖9 清熱解毒口服液中苯甲酸測定結(jié)果Fig 9 Benzoic acid in Qingre Jiedu oral liquid

2.2.4 山麥冬違規(guī)投料的篩查 麥冬和山麥冬性狀較為相近，但《中國藥典》2020年版一部規(guī)定兩者為不同的藥味，故在藥品生產(chǎn)過程中應(yīng)嚴格按照配方投料，不可混用。但近年來山麥冬產(chǎn)量較大，有部分廠家會使用山麥冬代替或混入麥冬進行投料。參考有關(guān)文獻[14-16]，選取了山麥冬特征成分山麥冬皂苷B（湖北麥冬）和短葶山麥冬皂苷C（短葶山麥冬），麥冬特征成分麥冬皂苷D，以此為指標建立清熱解毒口服液中山麥冬篩查的液相-質(zhì)譜聯(lián)用方法，方法學驗證均符合有關(guān)規(guī)定。色譜條件：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，3 μm）色譜柱；以乙腈-0.1%甲酸（75∶25）為流動相，流速為0.3 mL·min－1。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），正負離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。典型圖譜見圖10。

圖10 清熱解毒口服液中山麥冬篩查典型圖譜Fig 10 HPLC-MS /MS chromatograms of Liriopes Radix in Qingre Jiedu oral liquid

研究發(fā)現(xiàn)，42 批次樣品中，有2 家企業(yè)的7批次樣品（D 企業(yè)1 批，I 企業(yè)6 批）檢出山麥冬皂苷B 和麥冬皂苷D，1 家企業(yè)的2 批次樣品（K企業(yè)）檢出短葶山麥冬皂苷C 和麥冬皂苷D，說明有3 家企業(yè)的9 批次樣品涉嫌以山麥冬摻混麥冬進行投料，檢出率21.4%。因此有必要增加清熱解毒口服液中山麥冬的篩查項目。

3 討論

按照《中國藥典》2020年版一部的質(zhì)量標準檢驗，16 個廠家共42 批次清熱解毒口服液均符合規(guī)定，合格率100%。但經(jīng)探索性研究后發(fā)現(xiàn)，合格率有所下降，山銀花篩查項目合格率為90.5%，綠原酸、梔子苷和連翹苷含量測定項合格率僅50%，山麥冬篩查項目合格率為78.6%，提示清熱解毒口服液的內(nèi)在質(zhì)量有待進一步提高，目前其質(zhì)量標準的可控性一般。

近年來，山銀花、山麥冬產(chǎn)量大價格低，而金銀花、麥冬產(chǎn)量低價格高[17-18]，可能會導致部分生產(chǎn)企業(yè)為降低成本而不按處方進行投料。結(jié)合本次的探索性研究可知，增加清熱解毒口服液中山銀花、山麥冬的篩查十分必要。

綠原酸、梔子苷和連翹苷分別為處方中金銀花、梔子和連翹的有效成分，探索性研究發(fā)現(xiàn)各廠家3 種成分的含量差異較大。前期市場調(diào)研發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地中藥材和飲片質(zhì)量差異較大，偽劣藥材仍偶有出現(xiàn)。有研究表明，金銀花物候期、干燥方法等對綠原酸含量影響較大[19]；梔子果實過度成熟會導致梔子苷的降解[20]；連翹炮制過程的不規(guī)范會導致連翹飲片有效成分含量的降低[21]。因此，制劑生產(chǎn)企業(yè)在采購原料藥材時應(yīng)加強從業(yè)人員的培訓并注重原料、中間體、成品等環(huán)節(jié)性檢驗以確保制劑生產(chǎn)過程的可控。此外，清熱解毒口服液提取工藝較為復雜，關(guān)鍵工藝參數(shù)如水提時間、濃縮溫度，醇沉醇濃度等對有效成分含量的影響也不容忽視。建議部分廠家嚴格把控原料質(zhì)量并考察工藝參數(shù)，以提高藥品質(zhì)量。

以上研究發(fā)現(xiàn)，同一企業(yè)多批次樣品間的質(zhì)量一致性較為穩(wěn)定，說明生產(chǎn)企業(yè)內(nèi)部工藝控制相對較好。但企業(yè)間樣品質(zhì)量差異較大，說明部分企業(yè)生產(chǎn)過程可控性較差，產(chǎn)品質(zhì)量風險較高，提示生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)從原料、生產(chǎn)管理等方面進行原因分析，以提高產(chǎn)品質(zhì)量；提示監(jiān)管部門應(yīng)對風險較高的企業(yè)加大監(jiān)督力度，從各方面督促藥企完善藥品生產(chǎn)質(zhì)量保障體系，避免合格劣藥的出現(xiàn)。