張興娟，程光民，葛愛民，王云洲，陳鳳梅，胡士林，徐相亭

(山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院/濰坊市反芻動物疾病防控工程中心，山東 濰坊 261061)

湖羊發(fā)源地在我國太湖流域，具有早期生長發(fā)育快、性成熟早、四季發(fā)情、可終年配種、多胎性強、產(chǎn)羔率高、繁殖力強等特點，是我國特有的寶貴綿羊品種。近年已有高原地區(qū)引種湖羊集約化養(yǎng)殖，有研究發(fā)現(xiàn)高海拔環(huán)境飼養(yǎng)的綿羊呈現(xiàn)小腸組織結構變化。陳付菊等[1]對藏山羊和藏綿羊小腸黏膜免疫相關細胞進行了比較組織學研究，發(fā)現(xiàn)成年藏山羊的小腸黏膜免疫屏障功能強于藏綿羊；藏綿羊小腸中上皮內(nèi)淋巴細胞起重要的黏膜防御功能，而在藏山羊小腸中杯狀細胞和肥大細胞起重要的黏膜防御功能。楊傳華等[2]對甘肅鼢鼠和高原鼢鼠的小腸進行了組織學結構的比較，發(fā)現(xiàn)甘肅鼢鼠十二指腸、空腸和回腸絨毛間距均顯著小于高原鼢鼠，而其空腸管徑顯著大于高原鼢鼠，2種鼢鼠小腸總絨毛面積無明顯差異。馬蘭等[3]運用比較組織學方法研究了不同海拔藏綿羊小腸上皮內(nèi)淋巴細胞、杯狀細胞的數(shù)量和分布，結果發(fā)現(xiàn)高海拔藏綿羊小腸上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量較低海拔藏綿羊的低。楊婕等[4]研究了高原牧區(qū)藏綿羊與蘭州大尾羊頜下腺組織學特征并進行了比較，發(fā)現(xiàn)蘭州大尾羊頜下腺內(nèi)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)在漿液細胞及紋狀管上皮細胞呈強陽性表達，可能與高寒低氧環(huán)境中應激反應有關。

小腸組織結構的良好狀態(tài)是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和動物正常生長的生理學基礎，也是引種湖羊保持優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)性能和健康生長的屏障基礎，但前人對羊消化系統(tǒng)的研究主要集中在腸道免疫細胞和防御能力，對湖羊生產(chǎn)性能研究主要在日糧添加劑和飼養(yǎng)模式，鮮見關于不同海拔湖羊小腸的比較組織學研究報道。本研究將湖羊分別在山東和青海2個不同海拔高度的地區(qū)飼養(yǎng)，采用組織學及圖像分析法觀測小腸的絨毛長度、黏膜層厚度、杯狀細胞數(shù)量，分析不同海拔地區(qū)飼養(yǎng)的湖羊小腸組織學結構的異同及其意義，從結構層面分析湖羊在高原集約化養(yǎng)殖的可行性，助推青藏高海拔地區(qū)湖羊產(chǎn)業(yè)化的形成和可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選擇同胎次1歲左右的湖羊90只，山東高密某牧業(yè)有限公司飼養(yǎng)45只，其余45只運至青海省門源縣某肉羊繁育基地飼養(yǎng)，公母配比均為1∶8。當年配種，次年產(chǎn)羔。兩地所產(chǎn)的羔羊均75日齡斷奶，作為備選試驗對象。

高密市平均海拔19.3 m，位于山東半島中部，膠萊平原腹地；青海海晏縣平均海拔3 000 m以上，位于青海省東北部，傍依祁連山脈。本試驗根據(jù)兩地海拔不同，將試驗動物分為山東的低海拔組和青海的高海拔組。各組按照體重相近的原則挑選40只90日齡的健康湖羊，隨機均分到4個飼養(yǎng)欄中(公母混養(yǎng))開始常規(guī)飼養(yǎng)試驗。預試期10 d，正試期150 d。

1.2 試驗日糧

試羊均以地方飼料原料為主，制作全混合日糧。日糧配方參照國家行業(yè)標準《肉羊飼養(yǎng)標準(NY/T 816—2004)》，按照肉羊體重25 kg、日增重0.25 kg/d營養(yǎng)需要量進行設計。日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗前對湖羊進行驅(qū)蟲、免疫、打耳號，對圈舍進行清掃、消毒。每日08:30和18:30飼喂2次，自由采食、飲水，其他管理均參照所屬繁育基地要求執(zhí)行。

1.4 采食量及體重測定

每日飼喂之前，記錄前1 d飼料的加料量和剩料量，對剩料量每日收集，計算干物質(zhì)含量，以計算試驗期各組羊干物質(zhì)采食量。于試驗開始當天測量羊初始體重，均為空腹體重，150 d 后再次測定空腹體重作為終末體重，計算每只羊平均日增重。

1.5 樣品采集

試驗結束后第2天每組隨機選取6只公羊稱量體重，剖殺并采集小腸段2 cm左右，用溫熱生理鹽水充分沖洗腸道內(nèi)容物，放入4%甲醛溶液中固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，厚5 μm，每隔10張取1張，進行HE染色。應用電腦顯微圖像分析系統(tǒng)(OLYMPUS DP73型)進行觀察和拍照，通過CellSens Standard軟件進行測量。

1.6 檢測指標和方法

經(jīng)HE染色后，光學顯微鏡下觀察。每只羊腸道組織各取3張切片，均為腸道橫切面，每張切片中選取絨毛走向平直、結構完整，且最長的3根絨毛進行測量，在400倍鏡下每根絨毛統(tǒng)計100個柱狀細胞中分布的杯狀細胞數(shù)量；測量絨毛長度、黏膜層厚度時，每張切片每個視野選取3根最長絨毛進行測量，黏膜厚度為絨毛頂點到黏膜肌層的垂直距離，測量均以當前視野中最厚處為準，每個指標換3個視野測量。

1.7 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理用SPSS 19.0軟件，2組間比較采用t檢驗分析，同海拔不同部位間比較采用方差分析，Duncan氏法對各組間進行多重比較。數(shù)據(jù)用“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 不同生長環(huán)境對湖羊生長性能的影響

由表2可知，在經(jīng)過5個月的飼養(yǎng)試驗后，盡管2組湖羊遺傳背景、日齡、飼糧營養(yǎng)物質(zhì)基礎相近，但平均日增重低海拔組顯著高于高海拔組 (P<0.05)；料重比低海拔組顯著低于高海拔組 (P<0.05)。

表2 不同海拔湖羊生長性能的比較

2.2 形態(tài)觀察

經(jīng)HE染色后，光學顯微鏡下觀察低海拔組和高海拔組湖羊樣本切片均可見小腸黏膜結構完整、層次分明，腸絨毛輪廓清晰，吸收細胞呈高柱狀，排列整齊，染色鮮明(圖1)。其中十二指腸絨毛呈葉狀，杯狀細胞數(shù)量較少，在絨毛基部有少量杯狀細胞，十二指腸固有層有明顯的乳糜管，黏膜下層有發(fā)達的十二指腸腺，呈明顯的黏液性腺泡(圖1A、圖1B)；空腸腸絨毛呈指狀，排列整齊，杯狀細胞散在于柱狀吸收細胞之間，固有層散在大量淋巴細胞，黏膜下層發(fā)達(圖1C、圖1D)；回腸腸絨毛較短，腸絨毛吸收細胞之間杯狀細胞明顯較十二指腸和空腸增多，固有層有明顯的淋巴集結(圖1E、圖1F)。

A. 低海拔組湖羊十二指腸(100×)，黑色雙箭頭為黏膜層厚度測量范圍；B. 高海拔組湖羊十二指腸(100×)；C. 低海拔組湖羊空腸 (100×) ；D. 高海拔組湖羊空腸 (100×)，黃色雙箭頭代表絨毛高度測量范圍，紅色雙箭頭代表隱窩深度測量范圍；E. 低海拔組湖羊回腸 (400×) ；F. 高海拔組湖羊回腸 (100×)

湖羊小腸各段結構的變化：十二指腸中，低海拔組湖羊的腸絨毛較高，呈現(xiàn)出明顯的葉狀結構，絨毛頂部較寬大，葉狀絨毛的邊緣分布整齊的柱狀細胞，有清晰的紋狀緣，柱狀細胞之間散在少量杯狀細胞；高海拔組湖羊的腸絨毛較短，絨毛頂部較狹窄，絨毛有較多的杯狀細胞分散于柱狀細胞之間?？漳c中，低海拔組湖羊的腸絨毛較長且粗，腸黏膜皺襞較多，固有層有大量淋巴細胞，黏膜層較厚；高海拔組湖羊的腸絨毛較細且短，絨毛柱狀細胞間杯狀細胞數(shù)量較多?；啬c中，低海拔組湖羊回腸絨毛較細長，呈錐狀突向管腔，固有層分布大量淋巴細胞，并形成淋巴濾泡結構。高海拔組湖羊的回腸絨毛較稀疏且短，絨毛間杯狀細胞數(shù)量較多。固有層腸腺基部可見較多的淋巴細胞，形成集合淋巴濾泡結構。

2.3 小腸絨毛高度

表3顯示，低海拔組湖羊各段小腸絨毛高度均顯著高于高海拔組湖羊(P<0.05)。組內(nèi)比較顯示高海拔組湖羊空腸絨毛最高，其次是十二指腸絨毛，回腸絨毛最低，但十二指腸和空腸絨毛高度差異不顯著(P>0.05)；低海拔組湖羊空腸絨毛最高，其次是十二指腸、回腸，其中十二指腸和回腸絨毛高度差異不顯著(P>0.05)。

表3 不同海拔湖羊小腸絨毛高度(n=6) μm

2.4 黏膜層厚度變化

表4顯示，低海拔組湖羊各段小腸黏膜層厚度均顯著高于高海拔組湖羊(P<0.05)。組內(nèi)比較顯示，高海拔組湖羊空腸黏膜層最厚，其次是十二指腸、回腸，但三者之間差異不顯著(P>0.05)；低海拔組湖羊空腸黏膜層最厚，其次是回腸、十二指腸，其中十二指腸和回腸黏膜層厚度差異不顯著(P>0.05)。

表4 不同海拔湖羊小腸黏膜層厚度(n=6) μm

2.5 杯狀細胞數(shù)量變化

從表5可知，高海拔組湖羊小腸各段的杯狀細胞數(shù)量均多于低海拔組(P<0.05)。其中高海拔組湖羊十二指腸、空腸和回腸上皮內(nèi)杯狀細胞數(shù)量分別比低海拔湖羊多26.48%、44.87%和12.17%。

表5 不同海拔湖羊小腸杯狀細胞數(shù)量(n=6)

組內(nèi)比較顯示，低海拔組湖羊小腸杯狀細胞從十二指腸至回腸呈逐漸增多趨勢，各腸段間差異顯著(P<0.05)；高海拔組小腸杯狀細胞空腸最多，回腸次之，十二指腸最少，但空腸和回腸間差異不顯著(P>0.05)。

2.6 隱窩深度的變化

從表6可知，低海拔組湖羊小腸各段的隱窩深度均高于高海拔組(P<0.05)。組內(nèi)比較顯示，高海拔和低海拔均以空腸隱窩最深，其次為十二指腸和回腸，但空腸和十二指腸隱窩深度差異不顯著(P>0.05)，均顯著高于回腸(P<0.05)。

表6 不同海拔湖羊小腸的隱窩深度(n=6) μm

3 討論

小腸是動物營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的主要場所，其功能與生理結構密切相關，因此腸黏膜的結構與動物的健康狀況息息相關，特別是小腸絨毛的高度、黏膜層厚度、隱窩深度都是衡量其消化和吸收功能高低的重要指標[5]。腸上皮的正常結構不僅是營養(yǎng)物質(zhì)被充分消化吸收的基本保證，也是發(fā)揮屏障功能和黏膜免疫反應的結構基礎。腸道形態(tài)學上的改變是造成消化吸收功能和免疫功能降低的主要原因之一[6-7]。小腸腸腔內(nèi)有許多細小的指狀突起即絨毛，絨毛和微絨毛結構極大地增加了小腸內(nèi)壁的表面積，腸絨毛下陷進入固有層形成腸腺，腸腺負責分泌多種消化酶，對營養(yǎng)物質(zhì)起到消化作用，所以黏膜層厚度可以反映腸道消化和吸收能力。腸絨毛之間腸腺開口即為隱窩，研究人員通過對隱窩結構深入地分析研究發(fā)現(xiàn)隱窩處存在著大量的腸道干細胞，這些干細胞通過“不對稱分裂”的方式逐步沿著隱窩縱軸向上遷移至頂部絨毛上部[8]，可見隱窩與腸黏膜上皮細胞的更新有直接關系。杯狀細胞是分布于腸絨毛柱狀細胞之間的一種黏液分泌細胞，細胞內(nèi)含有豐富的黏液顆粒，其中主要是黏蛋白，黏液顆粒融合后，分泌到胞外，形成黏液附著在腸黏膜表面，有潤滑和保護腸道黏膜的作用，參與構成了腸道黏膜的機械屏障[9-11]。杯狀細胞分泌的黏液雖然對腸黏膜有保護作用，但過多的杯狀細胞分泌，造成消化酶分泌減少，腸絨毛的有效吸收面積減少，大量的黏液覆蓋在腸道上皮細胞表面，吸收細胞與腸道內(nèi)容物之間形成一道屏障，減少腸上皮細胞與營養(yǎng)物質(zhì)的接觸，因此會降低腸道的消化吸收功能。

本試驗中低海拔組湖羊各段小腸絨毛高度均顯著高于高海拔組湖羊。組內(nèi)比較顯示高海拔組湖羊空腸絨毛最高，其次是十二指腸絨毛，回腸絨毛最低，但十二指腸和空腸絨毛高度差異不顯著；低海拔組湖羊空腸絨毛也是最高的，其次是十二指腸、回腸，其中十二指腸和回腸絨毛高度差異不顯著。低海拔組湖羊各段小腸黏膜層厚度均顯著高于高海拔組湖羊。組內(nèi)比較顯示高海拔組湖羊空腸黏膜層最厚，其次是十二指腸黏膜層厚度、回腸黏膜層厚度，但三者之間差異不顯著；低海拔組湖羊空腸黏膜層是最厚的，其次是回腸、十二指腸，其中十二指腸和回腸黏膜層厚度差異不顯著。高海拔組湖羊小腸各段的杯狀細胞數(shù)量均多于低海拔組。其中高海拔組湖羊十二指腸、空腸和回腸上皮內(nèi)杯狀細胞數(shù)量分別比高海拔組湖羊多26.48%、44.87%和12.17%。組內(nèi)比較小腸的不同腸段，低海拔組湖羊小腸杯狀細胞從十二指腸至回腸呈逐漸增多趨勢，各腸段間差異顯著；高海拔組小腸杯狀細胞以空腸為最多，回腸次之，十二指腸最少，但空腸和回腸間差異不顯著。

2組湖羊日糧原料均來源于本地，纖維素含量有所差異；高海拔組湖羊粗飼料以燕麥秸稈和青稞為主，其中粗纖維含量分別為35.27%、38.76%；低海拔組湖羊粗飼料以花生秧和全株玉米青貯為主，花生秧中粗纖維含量約為22.66%，全株玉米青貯粗纖維含量約為17.63%～28.17%，可見，高海拔組湖羊日糧中的粗纖維含量高于低海拔組湖羊，使得2組湖羊腸絨毛高度、黏膜層厚度、杯狀細胞數(shù)量、隱窩深度以及腸道菌群之間均出現(xiàn)差異，這和前人的研究結果一致[12-13]，是高海拔組湖羊在適應當?shù)仫暳蠒r的生理變化需要。此外，2組湖羊生活的海拔高度有很大差異，高海拔組飼養(yǎng)地海拔高、空氣氧含量低、晝夜溫差大、冬季漫長。生活在低海拔地區(qū)的湖羊引入高原需要有適應的過程，這種適應包括代謝、機能和組織結構方面的變化，因此2組湖羊腸道樣本在各項研究指標上出現(xiàn)差異。