齊偉彪，范陽(yáng)，朱崇淼，金巍，毛勝勇*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2. 南京致潤(rùn)生物科技有限公司，江蘇 南京 211124)

根據(jù)中國(guó)產(chǎn)業(yè)信息網(wǎng)公布數(shù)據(jù)顯示，近年來(lái)我國(guó)食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，金針菇作為食用菌家族中的大宗品種，在2018年產(chǎn)量達(dá)到257.63萬(wàn)t。金針菇菌渣是食用菌生產(chǎn)中采集金針菇子實(shí)體后剩余的廢棄培養(yǎng)基，經(jīng)生物學(xué)效價(jià)換算，金針菇菌渣年產(chǎn)量達(dá)到380萬(wàn)t[1]。前期報(bào)道顯示，菌渣中生物酶活力較高，且含有豐富的菌絲體，粗蛋白和粗纖維等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量相對(duì)較高[2-5]。然而，由于金針菇菌渣的含水量太高，不易長(zhǎng)時(shí)間貯存，因而大量的菌渣被廢棄。近年來(lái)，一些養(yǎng)殖者嘗試在動(dòng)物生產(chǎn)中使用金針菇菌渣，發(fā)現(xiàn)其適口性較差，如果直接用其飼喂動(dòng)物，常會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物采食量下降，生產(chǎn)性能降低[6-7]。目前，我國(guó)飼料資源十分緊缺，如何有效開發(fā)利用金針菇菌渣作為飼料資源，已成為飼料行業(yè)十分關(guān)注的一個(gè)問(wèn)題。

發(fā)酵飼料是一種利用有益微生物發(fā)酵處理常規(guī)飼料或非常規(guī)飼料資源的新型飼料。前期研究顯示，發(fā)酵飼料內(nèi)含有大量的有益活菌數(shù)，因而動(dòng)物生產(chǎn)中使用發(fā)酵飼料，不僅可有效提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，而且有利于動(dòng)物胃腸道健康[8-10]。然而，目前針對(duì)金針菇菌渣的適宜發(fā)酵菌種、配比和發(fā)酵條件尚不清楚。因此，本試驗(yàn)旨在探究基于金針菇菌渣的發(fā)酵飼料復(fù)合菌種配比和發(fā)酵條件，為生產(chǎn)中開發(fā)利用這類非常規(guī)飼料資源提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基及發(fā)酵底物

菌種：植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌皆為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

培養(yǎng)基：乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基(MRS)、細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基(LB)和酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

發(fā)酵底物：發(fā)酵底物由金針菇菌渣、麩皮、玉米粉按照6∶3∶1的比例混合而成，發(fā)酵底物的原料和配方皆由南京致潤(rùn)生物科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 發(fā)酵金針菇菌渣飼料的菌種配比優(yōu)化

將植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌分別按1∶1∶1、2∶1∶2、2∶2∶1、1∶2∶2的比例混合制作復(fù)合菌液，依序設(shè)為第1、2、3、4組。每組以10%的接種比例接種到發(fā)酵底物中，配制為60%濕度的發(fā)酵底物，每組4個(gè)重復(fù)?；旌暇鶆蚝笱b入發(fā)酵袋，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵飼料的pH值、活菌數(shù)、乳酸、氨態(tài)氮(NH3-N)、還原糖、乙酸、丙酸、丁酸、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量。通過(guò)逼近理想解排序法(TOPSIS)方法進(jìn)行綜合分析，選出最佳菌種配比。

1.2.2 發(fā)酵金針菇菌渣飼料的發(fā)酵條件優(yōu)化

本試驗(yàn)采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，主要發(fā)酵參數(shù)為含水量、菌液添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間。測(cè)定發(fā)酵后的pH值、乳酸濃度、活菌數(shù)、NH3-N、粗脂肪、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和揮發(fā)性脂肪酸；最后通過(guò)TOPSIS方法進(jìn)行綜合分析，選出最佳發(fā)酵參數(shù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)分組

1.3 發(fā)酵參數(shù)測(cè)定

采用便攜式pH計(jì)(HI 9024C，HANNA Instruments，美國(guó))測(cè)定發(fā)酵后的飼料pH值。采用乳酸試劑盒(南京建成生物科技公司，南京)測(cè)定發(fā)酵飼料的乳酸含量。參照文獻(xiàn)[11]的氣相色譜法測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸濃度，毛細(xì)管柱為30 m×0.32 mm×0.25 mm，柱溫為135 ℃，汽化室溫度為180 ℃，檢測(cè)器溫度為210 ℃(GC-14B，島津，日本)。NH3-N和還原糖分別采用苯酚-次氯酸鈉比色法和蒽酮法進(jìn)行檢測(cè)[12-13]。

1.4 發(fā)酵飼料的菌落計(jì)數(shù)

稱取發(fā)酵后的飼料5 g，置于50 mL滅菌離心管中，加入45 mL無(wú)菌生理鹽水混勻后進(jìn)行梯度稀釋，分別取稀釋至10-5、10-6、10-7的菌液100 μL。在MRS、LB和YPD固體平板上進(jìn)行涂布，然后將MRS平板置于恒溫培養(yǎng)箱(厭氧環(huán)境)中，37 ℃培養(yǎng)48 h。將LB和YPD平板置于恒溫培養(yǎng)箱(有氧環(huán)境)中，分別在37 ℃培養(yǎng)48 h和30 ℃培養(yǎng)24 h；而后分別進(jìn)行乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌菌落計(jì)數(shù)[14]。

1.5 發(fā)酵飼料的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)檢測(cè)

將發(fā)酵后的金針菇菌渣飼料在發(fā)酵袋(1 kg單向透氣閥發(fā)酵袋)內(nèi)混合均勻，采集200～250 g樣品，在65 ℃烘干10 h，而后在空氣中放置12 h，自封袋密封保存。粗蛋白、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維、粗脂肪含量分別參照GB/T 643—2018、NY/T 1459—2007、GB/T 6433—2006進(jìn)行測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件中的單因素方差分析(One-way ANOVA),并采用LSD法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種配伍對(duì)金針菇菌渣發(fā)酵后乳酸含量及活菌數(shù)的影響

如表2所示，4組發(fā)酵飼料的pH值含量無(wú)顯著差異(P>0.05)，但第3組和第4組發(fā)酵飼料的活菌數(shù)均顯著高于第1組和第2組(P<0.05)，且第3組和第4組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 不同菌種配伍對(duì)金針菇渣發(fā)酵后pH值及活菌數(shù)的影響

2.2 不同菌種配伍對(duì)金針菇菌渣發(fā)酵后粗蛋白、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的影響

如表3所示，與第1和2組相比，第3和4組的粗蛋白含量顯著提高(P<0.05)，4組間的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 不同菌種配伍對(duì)金針菇菌渣發(fā)酵后粗蛋白、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的影響%

2.3 不同菌種配伍對(duì)金針菇菌渣發(fā)酵后代謝產(chǎn)物的影響

如表4所示，4組間發(fā)酵飼料的還原糖、乳酸、乙酸、丁酸含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。第3組NH3-N和丙酸含量顯著低于其他各組(P<0.05)。

表4 不同菌種配伍對(duì)金針菇菌渣發(fā)酵后代謝產(chǎn)物的影響(干物質(zhì))

2.4 TOPSIS綜合分析最佳菌種配比

如表5所示，利用TOPSIS法，對(duì)發(fā)酵后的pH值、乳酸、活菌數(shù)、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、還原糖、NH3-N、乙酸、丙酸、丁酸分別給予-1、1、1、-1、-1、-1、1、1、1、-1的權(quán)重，再進(jìn)行加權(quán)求和，最后得出第3組評(píng)分最高。

表5 TOPSIS綜合分析不同菌種配比評(píng)分結(jié)果

2.5 不同發(fā)酵組合對(duì)金針菇菌渣發(fā)酵飼料中的發(fā)酵產(chǎn)物含量的影響

如表6所示，各發(fā)酵組間中性洗滌纖維、還原糖、乙酸、丁酸含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。第1組的pH值和丙酸含量均顯著高于其他各組(P<0.05)。第1、2、4、9組的乳酸含量沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，但均顯著高于其他5組(P<0.05)。第1、2組的活菌數(shù)無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但均顯著高于其他各組(P<0.05)。第2組的酸性洗滌纖維含量最低，顯著低于第6和8組。第8組的NH3-N含量顯著高于其他各組(P<0.05)。

表6 不同發(fā)酵組合對(duì)金針菇渣發(fā)酵飼料中的發(fā)酵產(chǎn)物含量的影響

2.6 利用TOPSIS方法綜合分析最佳發(fā)酵參數(shù)組合

評(píng)價(jià)方法與各指標(biāo)所賦予權(quán)重系數(shù)同2.4所述。如表7所示，第1組綜合評(píng)分最高，即植物乳桿菌、釀酒酵母菌、枯草芽孢桿菌菌種配比為2∶2∶1條件下，最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)為接菌比例5%，溫度33 ℃，水分50%，發(fā)酵時(shí)間5 d。

表7 TOPSIS綜合分析評(píng)分結(jié)果

2.7 金針菇菌渣發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分的比較

按照最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)，即植物乳桿菌、釀酒酵母菌、枯草芽孢桿菌菌種配比為2∶2∶1，以5%的接菌比例在水分為50%的發(fā)酵培養(yǎng)基且發(fā)酵溫度為33 ℃條件下發(fā)酵5 d，重新發(fā)酵一批金針菇菌渣。如表8所示，與原料相比，復(fù)合菌發(fā)酵后粗蛋白含量顯著升高(P<0.05)，pH值顯著降低(P<0.05)。但發(fā)酵前后菌渣飼料的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、粗脂肪和粗灰分含量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表8 金針菇菌渣發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分的變化

3 討論

本試驗(yàn)中發(fā)酵前金針菇菌渣飼料pH值為5.74，第一次發(fā)酵后的4組飼料pH值均大幅下降，平均值為4.77，但各組間無(wú)顯著差異，說(shuō)明4個(gè)組中植物乳桿菌接種量的占比均不影響乳酸菌的增殖和乳酸的產(chǎn)生。乳酸的產(chǎn)生降低了金針菇菌渣pH值，該結(jié)果與孟蝶方等[15]研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，金針菇菌渣發(fā)酵7 d后，活菌數(shù)發(fā)生變化，與第1、2組相比，第3、4組的活菌數(shù)最高，表明飼料植物乳桿菌、釀酒酵母菌、枯草芽孢桿菌的菌種配比分別為2∶1∶2和1∶2∶2時(shí)，更有利于發(fā)酵體系中活菌數(shù)量的增多。有研究表明，發(fā)酵飼料中的有益菌經(jīng)過(guò)動(dòng)物采食后，在反芻動(dòng)物的瘤胃和單胃動(dòng)物的腸道中可快速繁殖，進(jìn)而與胃腸道內(nèi)致病菌群進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，抑制有害菌的生長(zhǎng)繁殖[16-18]。因此，第3組和第4組中的活菌數(shù)較高，可能有利于動(dòng)物腸道健康。本試驗(yàn)中，4組之間所產(chǎn)生的乳酸并無(wú)顯著差異，可能原因在于各組中的乳酸菌均得到大量增殖，各組中的乳酸菌菌產(chǎn)生大量乳酸，導(dǎo)致4組之間的含量無(wú)顯著差異。

本研究結(jié)果顯示，第3組和第4組發(fā)酵飼料的粗蛋白含量顯著高于第1組和第2組，在菌種配比方面，第3、4組的枯草芽孢桿菌在菌種配比中均占40%，第1組占比33%，第2組占比20%，而第3、4組僅乳酸菌和酵母菌比例相互調(diào)換，兩組間粗蛋白含量并無(wú)顯著差異，表明乳酸菌和酵母菌通過(guò)代謝所產(chǎn)生的的菌體蛋白含量并未對(duì)金針菇菌渣發(fā)酵底物中的粗蛋白含量造成較大影響，而枯草芽孢桿菌對(duì)發(fā)酵底物中粗蛋白的相對(duì)含量影響較大。有研究表明，枯草芽孢桿菌是一種能夠分泌蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶的菌種，其在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的多種酶可將飼料中部分碳水化合物降解為還原糖，還原糖被菌群重新利用后，促進(jìn)了菌體的生長(zhǎng)，從而有助于提高飼料中粗蛋白的相對(duì)含量[19-20]。

乙酸、丙酸、丁酸對(duì)動(dòng)物采食行為以及機(jī)體營(yíng)養(yǎng)的攝取有著重要的影響。在生物化學(xué)反應(yīng)中，乙酸中的乙酰基在動(dòng)物肝臟中結(jié)合輔酶A形成乙酰輔酶A，進(jìn)入脂代謝過(guò)程，進(jìn)而對(duì)機(jī)體儲(chǔ)能和供能[21]。丙酸是反芻動(dòng)物在肝臟中進(jìn)行糖異生的重要底物，可為糖異生提供超過(guò)60%的碳源。適量丁酸的攝入對(duì)人、豬、禽、反芻動(dòng)物等均具有促進(jìn)胃腸道發(fā)育、改善機(jī)體免疫力的作用，但丁酸具有酸臭味，含量較高將引起飼料適口性下降[21]。本研究中，各組之間的乳酸、乙酸和丁酸含量均無(wú)顯著差異，但第2組丙酸含量最高，原因可能與接種微生物的本身代謝特點(diǎn)有關(guān)。

本研究引入TOPSIS分析方法。TOPSIS評(píng)價(jià)方法是一種針對(duì)有限方案多目標(biāo)決策的一種常用方法，對(duì)資料的分布沒(méi)有特殊要求，適用于任意有限個(gè)評(píng)價(jià)對(duì)象和評(píng)價(jià)指標(biāo)，能在有限方案中找出最優(yōu)方案，并可分別計(jì)算出評(píng)價(jià)對(duì)象與最優(yōu)方案的距離，獲得各評(píng)價(jià)對(duì)象與最優(yōu)方案的接近程度，以此作為評(píng)價(jià)優(yōu)劣的依據(jù)[20]。利用TOPSIS綜合分析方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果顯示第1組評(píng)分最高，即優(yōu)勢(shì)發(fā)酵條件為：接菌比例5%，溫度33 ℃，水分50%，發(fā)酵時(shí)間5 d。利用這些參數(shù)進(jìn)行金針菇飼料固體發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與發(fā)酵前金針菇菌渣混合飼料比較，發(fā)酵后飼料的蛋白質(zhì)含量由12.66%顯著升高至13.45%。該結(jié)果進(jìn)一步印證了前述推測(cè)，說(shuō)明這一組合有利于提升金針菇菌渣中的粗蛋白含量，也與封功能等[21]報(bào)道一致。

綜上所述，植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌復(fù)合菌發(fā)酵金針菇菌渣飼料的最優(yōu)工藝條件為：植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌的接種比例為2∶2∶1，接種量為5%，固態(tài)培養(yǎng)基含水量為50%，溫度為33 ℃，發(fā)酵時(shí)間為5 d。