鄧楚瑤，馮煒婷，陳亦璐，曹庸，宋明月*

1(廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(華南農(nóng)業(yè)大學(xué))，廣東 廣州，510642)2(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州，510642)3(廣東嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510642)4(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙，410128)

川陳皮素在柑橘類(lèi)果皮中含量豐富且具有多種有益健康的生物學(xué)活性[1]，如調(diào)節(jié)代謝紊亂[2]、抗炎[3-4]、抗癌[5-6]等。但因其熔點(diǎn)高(大于150 ℃)、疏水性高、水溶性差(小于100 μg/mL)[7]，導(dǎo)致生物可及性低。因而人體難以對(duì)川陳皮素進(jìn)行有效的吸收和利用，很大程度上限制了其生物活性的發(fā)揮和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。而利用納米乳液將脂溶性營(yíng)養(yǎng)素如β-胡蘿卜素[8]、番茄紅素[9]、維生素D3[10]等進(jìn)行包埋，可有效提高其生物可及性[11]。

功能性油脂是一類(lèi)對(duì)人體有特殊生理作用的油脂，其主要活性成分包括多不飽和脂肪酸、磷脂、脂溶性維生素等其他脂溶性成分[12]。近年來(lái)，隨著生活水平的提高，人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)健康愈發(fā)重視。因此，以功能性油脂作為載體的飲料、乳液等復(fù)合型食品和保健品有著廣闊的發(fā)展空間[13]。選用功能性油脂制備納米乳液遞送系統(tǒng)，不僅可在一定程度上提高裝載物的吸收利用，增強(qiáng)其體內(nèi)生物學(xué)功能，還能豐富食品和保健品的形式。

本研究選用紫蘇籽油(C18∶3)、火麻仁油(C18∶2)和山茶油(C18∶1)3種功能性油脂為主要載體，利用高能量法制備了川陳皮素納米乳液，并系統(tǒng)探究了其體外消化特性，以期獲得基于功能性油脂的提高川陳皮素生物可及性的遞送系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

紫蘇籽油、火麻仁油、山茶油、川陳皮素(純度95%)，由課題組實(shí)驗(yàn)室提供；黏蛋白、脂肪酶、膽鹽，上海源葉生物科技有限公司；低溫連續(xù)相變流體萃取裝置，珠海共同機(jī)械有限公司；6YZ-180型液壓壓榨機(jī)，鄭州八方機(jī)械設(shè)備有限公司；Mastersizer 3000激光粒度分布儀，英國(guó)Malvern公司；Zatasizer Nano ZS 90納米粒度及Zeta電位分析儀，英國(guó)Malvern公司；TCS SP8激光共聚焦顯微鏡，德國(guó)LEICA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 功能性油脂的制備

1.2.1.1 山茶油

將干燥油茶籽清理除雜后粉碎至一定粒度，把粉碎后的油茶籽粉裝進(jìn)萃取裝置的20 L萃取釜中，在原料堆密度0.6 kg/L，萃取溫度50 ℃，解析溫度70 ℃，萃取壓力0.6～0.7 MPa，萃取時(shí)間60 min的條件下進(jìn)行低溫連續(xù)相變萃取[14]，獲得山茶油。

1.2.1.2 火麻仁油、紫蘇籽油

將清理后的原料分別投入壓榨機(jī)中，工藝參數(shù)設(shè)置為：壓力 40～50 MPa，提取時(shí)間30 min，出油溫度32 ℃，壓榨過(guò)濾后獲得火麻仁油和紫蘇籽油。

1.2.2 川陳皮素納米乳液制備

1.2.2.1 油相制備

室溫下將50 mg川陳皮素加入到25 g的油中，超聲2～3 h，待川陳皮素完全溶解以制得乳液油相。

1.2.2.2 乳化劑比例

分別稱取2、4、6、8、10 g的乳化劑(吐溫80)和相應(yīng)質(zhì)量的超純水于燒杯中，使水相總質(zhì)量為75 g。加熱攪拌至乳化劑完全溶解以制得乳液水相。將上述水相和油相混合，先以10 000 r/min高速均質(zhì)10 min，再以100 MPa高壓均質(zhì)7次。3種不同功能性油脂均按此法制備納米乳液，測(cè)定乳液的平均粒徑。

1.2.3 體外消化

參考SUN等[15]配備模擬消化液備用。人工唾液的配制配方如表1所示，其中尿酸鈉和乳酸鈉提前一夜攪拌，總體積為1 L。

表1 體外消化模型中人工唾液的化學(xué)成分Table 1 Chemical composition of artificial saliva used in the in vitro digestion model

人工胃液由2 g氯化鈉和7 mL鹽酸溶于總體積為1 L的水中制得，然后調(diào)節(jié)pH值至1.2。人工小腸液由0.5 mol CaCl2·2H2O和5.6 mol NaCl溶于總體積為500 mL的水中制得。

取1.2.2.2 實(shí)驗(yàn)中所得最優(yōu)川陳皮素納米乳液進(jìn)行體外消化模擬。

1.2.3.1 口腔階段

取4 mL乳液加超純水至20 mL，并加入20 mL人工唾液，調(diào)節(jié)pH至6.8，在37 ℃條件下100 r/min振蕩10 min。

1.2.3.2 胃階段

取上一步所得的口腔消化液20 mL，并加入20 mL人工胃液，調(diào)節(jié)pH至2.5，在37 ℃條件下100 r/min振蕩2 h。

1.2.3.3 小腸階段

分別將187.5 mg膽鹽加入到3.5 mL 磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)中，60 mg脂肪酶加入到2.5 mL PBS中，攪拌制備成懸濁液備用。取30 mL上述胃消化液，加入1.5 mL小腸液和膽鹽，調(diào)節(jié)pH至7。在37 ℃的條件下，向消化液中加入脂肪酶，并逐滴加 0.2 mol/L NaOH維持pH為7，滴定過(guò)程持續(xù) 2 h，記錄下NaOH溶液的體積。

1.2.4 脂肪酸釋放率測(cè)定

在模擬小腸消化的過(guò)程中，脂肪在脂肪酶的作用下，釋放游離脂肪酸，使體系的pH不斷下降。使用NaOH對(duì)游離脂肪酸進(jìn)行中和，通過(guò)NaOH的消耗體積即可計(jì)算出游離脂肪酸的釋放率，計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：CNaOH為用于中和游離脂肪酸的NaOH濃度，mol/L；VNaOH為用于中和游離脂肪酸的NaOH所用體積，L；M油為油脂的平均分子質(zhì)量，g/mol；m油為油脂的質(zhì)量，g。

1.2.5 生物可及性測(cè)定

生物可及性是指膠束中所含川陳皮素與原有納米乳液中所含的川陳皮素的比值。膠束由游離脂肪酸、甘油一酯和膽鹽、磷脂組成，可溶解脂溶性營(yíng)養(yǎng)素。生物可及性的計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：C膠束中川陳皮素為膠束中川陳皮素的濃度，mol/L；C納米乳液中川陳皮素為原有納米乳液中川陳皮素的濃度，mol/L。

取1 mL所得小腸消化液于離心管中，25 ℃、15 000 r/min離心50 min。離心后的中層清液為膠束層。取200 μL膠束，加入2倍體積的乙酸乙酯，漩渦振蕩30 s，以 25 ℃、1 170×g離心6 min。共萃取2次，合并2次清液。45 ℃蒸干乙酸乙酯后，加入200 μL甲醇溶解。待測(cè)液過(guò)膜，加入到內(nèi)插管中，使用高效液相儀進(jìn)行測(cè)量。

1.2.6 粒徑分布變化測(cè)量

利用激光粒度分布儀分別測(cè)定原液和消化過(guò)程中所得的口腔、胃、小腸消化液的粒徑分布?？谇弧⑿∧c消化液使用PBS做分散介質(zhì)，胃消化液使用酸化水做分散介質(zhì)。

1.2.7 平均粒徑及電位變化測(cè)量

利用納米粒度及Zeta電位分析儀測(cè)定原液、膠束及口腔、胃、小腸消化液的平均粒徑和電位。原液用一級(jí)水稀釋400倍，口腔、小腸消化液及膠束用PBS(pH 7)稀釋400倍，胃消化液用酸化水(pH 2.5)稀釋400倍，再取適量稀釋待測(cè)液至比色皿中進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8 微觀結(jié)構(gòu)觀察

利用激光共聚焦顯微鏡觀察原液、口腔、胃、小腸消化液的微觀結(jié)構(gòu)。觀察前，向原始納米乳液和消化過(guò)程中的口腔、胃、小腸消化液加入10 μL尼羅紅溶液進(jìn)行染色，采用63倍的滴油物鏡進(jìn)行觀察。所有圖像均用儀器軟件程序拍攝和處理。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，各指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用SPSS Statistics 24進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用OriginPro 9.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)乳液粒徑的影響

吐溫80是一種親水型非離子表面活性劑，易形成水包油型納米乳液，且毒性低、價(jià)格低廉，常被作為乳化劑、分散劑、渾濁劑等應(yīng)用于食品中[16]，因此本實(shí)驗(yàn)選取吐溫80作為乳化劑。如圖1和圖2所示，乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)從2% 增加到10% 時(shí)，乳液的顆粒直徑呈下降趨勢(shì)。當(dāng)乳化劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 4% 時(shí)，3種乳液的顆粒直徑均小于 200 nm，符合納米乳液粒徑要求(直徑小于200 nm)[17]，且乳化劑用量較小，因此本實(shí)驗(yàn)選取的乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。制備得到的3種基于功能性油脂的川陳皮素納米乳液，乳液外觀均呈乳白色流體，質(zhì)地均一、細(xì)膩，無(wú)特殊氣味。

a-紫蘇籽油組；b-火麻仁油組；c-山茶油組圖1 粒徑分布測(cè)定原始譜圖Fig.1 Original spectra of particle size distribution determination

圖2 不同乳化劑比例對(duì)乳液平均粒徑的影響Fig.2 Effect of emulsifier ratio on the average particle size of emulsion

2.2 消化過(guò)程中的乳液粒徑與結(jié)構(gòu)變化

由圖3所示，3種乳液的原液、口腔消化階段以及胃消化階段的粒徑分布較一致，但是在口腔和胃階段，乳液出現(xiàn)輕微聚集。在小腸階段，由于膽鹽和胰脂肪酶的加入，納米乳液中的油脂被消化，從而導(dǎo)致乳液結(jié)構(gòu)均被破壞，出現(xiàn)大規(guī)模聚集[15]。小腸粒徑分布均呈現(xiàn)雙峰態(tài)或多峰態(tài)，這可能是由于體系中存在不同類(lèi)型的顆粒物質(zhì)，如不溶性鈣鹽、蛋白質(zhì)等[18]。3種乳液在粒徑為0.1～1 μm和10～100 μm范圍內(nèi)，均出現(xiàn)明顯的峰，表明乳液發(fā)生聚集，形成了粒徑較大的顆粒。其中在0.1～1 μm，相對(duì)密度從高到低為紫蘇籽油>火麻仁油>山茶油，而在10～100 μm，相對(duì)密度從高到低為山茶油>火麻仁油>紫蘇籽油。3種乳液在小腸消化階段的粒徑分布的差異，可能是由于乳液的破壞程度存在差別。

而由圖4可以直觀看出，在口腔和胃消化階段，3種乳液的液滴都出現(xiàn)輕微聚集，這與粒徑分布的結(jié)果一致。在小腸消化階段可以看到，山茶油乳液的油滴粒徑最小、只發(fā)生了輕微聚集現(xiàn)象；而紫蘇籽油乳液的油滴粒徑最大、并且大規(guī)模聚集；火麻仁油乳液的油滴大小和聚集程度處于前兩者之間。

圖4 三種納米乳液消化過(guò)程的微觀結(jié)構(gòu)變化Fig.4 Microstructural changes in the digestion process of three nano emulsions

粒徑分布和微觀結(jié)構(gòu)圖中的結(jié)果均表明，3種納米乳液的消化過(guò)程基本一致。但在小腸消化階段，3種乳液的油滴粒徑大小存在明顯差異，最大為紫蘇籽油，其次為火麻仁油，最小為山茶油，3種納米乳液的油滴大小和聚集情況的差異，可能是由于3種油的消化程度存在差別而導(dǎo)致的[8]。

a-紫蘇籽油組；b-火麻仁油組；c-山茶油組圖3 三種納米乳液消化過(guò)程的粒徑分布變化Fig.3 Particle size distribution in the digestion process of three nanoemulsions

2.3 消化過(guò)程電位變化

由圖5可知，3種乳液在消化的過(guò)程中，電位絕對(duì)值均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。具體來(lái)說(shuō)，乳液進(jìn)入口腔消化階段時(shí)，離子環(huán)境的改變引發(fā)了靜電屏蔽效應(yīng)[10,19]，導(dǎo)致電位絕對(duì)值下降；在胃消化階段，乳液的電位絕對(duì)值均出現(xiàn)大幅度下降，其原因可能有：模擬胃液的pH值低、粒子濃度高[20]，乳液表面的陰離子被胃液中的陽(yáng)離子中和[21]；而在小腸消化階段，由于膽鹽的加入和油脂分解產(chǎn)生的游離脂肪酸，使電位絕對(duì)值上升[8,22]。這3種乳液中，基于山茶油制備的乳液的電位絕對(duì)值最高，其次為火麻仁油，而紫蘇籽油的電位絕對(duì)值最小。由于電位絕對(duì)值越小，液滴越容易趨向于聚集。因此，這部分結(jié)果有助于解釋圖4中小腸消化階段所觀察到的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，即電位絕對(duì)值最小的紫蘇籽油納米乳液經(jīng)消化后的液滴最大，而電位絕對(duì)值最大的山茶油納米乳液經(jīng)消化后的液滴則最小。

圖5 三種納米乳液消化過(guò)程的電位變化Fig.5 Potential changes in the digestion process of three nanoemulsions

2.4 脂肪酸釋放率

如圖6所示，3種油脂在小腸階段的消化速率均呈先快后慢的趨勢(shì)。消化的前10 min，紫蘇籽油和火麻仁油的消化速率無(wú)明顯差異，山茶油的消化速率最快。脂肪酸釋放率越高，脂肪的消化程度越大。因此在消化程度方面，最大的是山茶油[(93.7±1.4)%]，其次為火麻仁油[(83.0±1.8)%]，最小為紫蘇籽油[(76.4±0.9)%]，這與粒徑分布、微觀結(jié)構(gòu)圖的結(jié)果相一致。

圖6 三種納米乳液小腸消化過(guò)程的脂肪酸釋放率Fig.6 Fatty acid release rate in the digestion of three nano emulsions

在小腸消化階段，由于山茶油納米乳液的液滴尺寸最小、比表面積最大，增大了液滴與脂肪酶之間的接觸面積和反應(yīng)機(jī)會(huì)[23]，從而使山茶油的消化速率最快。另一方面，由于多不飽和脂肪酸存在空間位阻效應(yīng)[24-25]，因此相較于富含多不飽和脂肪酸的紫蘇籽油和火麻仁油，富含單不飽和脂肪酸的山茶油具有更高的消化程度。

2.5 川陳皮素生物可及性

3種納米乳液的川陳皮素生物可及性如圖7所示，圖中的不同字母代表生物可及性存在顯著性差異(P<0.05)。

圖7 三種納米乳液的生物可及性Fig.7 Bioaccessibility of three nanoemulsions注：不同字母代表生物可及性存在顯著性差異(P<0.05)

空白組的川陳皮素生物可及性僅為(0.3±0.1)%，而基于3種功能性油脂構(gòu)建的納米乳液，均顯著提高了川陳皮素的生物可及性。其中，紫蘇籽油納米乳液為(48.0±1.5)%，火麻仁油納米乳液為(46.0±1.0)%，山茶油納米乳液(66.4±2.9)%。該結(jié)果表明，3種納米乳液在經(jīng)過(guò)消化過(guò)程后，川陳皮素有效溶解在膠束中[26]，使川陳皮素的生物可及性顯著提高。

值得關(guān)注的是，山茶油納米乳液對(duì)川陳皮素生物可及性的提高效果顯著優(yōu)于紫蘇籽油納米乳液和火麻仁油納米乳液，這可能是因?yàn)樯讲栌透缓瑔尾伙柡椭舅?，在消化過(guò)程中的空間位阻效應(yīng)較小，消化程度更大，形成了更多的膠束來(lái)容納川陳皮素[23]，從而提升了其生物可及性。而對(duì)于同樣是富含多不飽和脂肪酸的紫蘇籽油和火麻仁油，雖然火麻仁油的消化程度高于紫蘇籽油，但紫蘇籽油納米乳液的川陳皮素生物可及性卻更高，這可能是由于紫蘇籽油膠束和火麻仁油膠束對(duì)川陳皮素的溶解能力存在差異[15,20]。

3 結(jié)論

本研究證明了使用紫蘇籽油、火麻仁油、山茶油包埋川陳皮素，并構(gòu)建納米乳液轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，可有效提高川陳皮素的生物可及性。其中，山茶油納米乳液比紫蘇籽油、火麻仁油能更有效地提高川陳皮素的生物可及性，這是由于山茶油的消化程度更大，形成了更多可容納川陳皮素的膠束。在后續(xù)的研究中，可進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，深入探究基于功能性油脂的納米乳液對(duì)川陳皮素生物可及性和生物利用率的影響，為川陳皮素以及其他功能性化合物的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用及豐富功能性食品的載體形式和種類(lèi)提供理論與數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。