劉莉穎，宋天霖，周藝萍，李選文，熊智*

1(西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明，650224)2(青海省婦女兒童醫(yī)院，青海 西寧，810000)

牦牛奶與同體積的普通黑白花牛奶比較，含鐵量是其9.8倍，含鋅量是其3倍，含鈣量和氨基酸含量是其1.15倍，蛋白質(zhì)含量是其1.1倍，乳脂和乳蛋白率也較高，被稱為純天然的“濃縮乳”[1]。游牧民通常將擠出的鮮牦牛奶不經(jīng)加熱殺菌，直接布袋過濾，置于陶罐中在陰涼處發(fā)酵。青海地區(qū)特殊的氣候環(huán)境(高寒、缺氧)、牦牛奶極高的營養(yǎng)價值及游牧民族傳統(tǒng)的制作工藝賦予了發(fā)酵牦牛乳制品特殊的微生物資源[2]。乳酸菌是一類能使可發(fā)酵糖類化合物轉(zhuǎn)化成乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱，廣泛應(yīng)用于酸奶、奶酪、面包、魚和肉等發(fā)酵食品的加工中，賦予它們獨特的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)特點。相當(dāng)多的乳酸菌是益生菌，能促進動物生長、調(diào)節(jié)胃腸道正常菌群、維持微生態(tài)平衡、提高機體免疫力等[3-4]。對青海傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳制品中乳酸菌資源進行發(fā)掘及評價具有現(xiàn)實意義和應(yīng)用價值。

目前對青海傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳制品中的乳酸菌尚未有較全面的功能及發(fā)酵特性評價。我國成年人飲奶后乳糖吸收不良人群可達(dá)80%，乳酸菌可自主合成β-半乳糖苷酶，可以降低乳糖含量，緩解人群中普遍存在的乳糖不耐癥[5]。某些乳酸菌會在生長過程中向外部環(huán)境中釋放具有抑菌活性的細(xì)菌素，細(xì)菌素具有無毒、無抗藥性、無副作用、無殘留等優(yōu)點，已經(jīng)成為現(xiàn)階段乃至今后很長一段時間微生物天然防腐劑的研究熱點[6]。凝乳時間決定著乳酸菌的凝乳能力，是乳酸菌是否適合作為乳制品發(fā)酵劑的一項重要考察指標(biāo)。

本研究收集整理青海地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳制品中的乳酸菌資源，并進行全面評價，分別發(fā)掘具有產(chǎn)細(xì)菌素能力、產(chǎn)β-半乳糖苷酶能力強、凝乳能力好的乳酸菌，為保護和利用我國傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌資源提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為發(fā)現(xiàn)新的更安全的食品添加抑菌劑提供素材，為β-半乳糖苷酶的生產(chǎn)和開發(fā)具有特色的發(fā)酵制品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 牦牛乳制品

本研究所用牦牛乳制品取自青海省海北藏族自治州、海南藏族自治州、黃南藏族自治州、果洛藏族自治州和玉樹藏族自治州牧民家中，共計18份樣品。

1.1.2 菌株

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)ATCC 19111，美國典型菌種保藏中心；大腸埃希菌(Escherichiacoli)CMCC 44102、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) CMCC 26003、中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心[17]。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；脫脂奶粉，美國BD公司。

1.1.4 主要試劑和儀器

胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、過氧化氫酶、溶菌酶、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(5-brome-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside, X-gal)、2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(2-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG)、鄰硝基苯酚,Sigma有限公司;API50 CH培養(yǎng)基、API50 CHL培養(yǎng)基,梅里埃技術(shù)有限公司。其余試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

Synergy LX酶標(biāo)儀，美國BioTek公司；IMH180培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher公司；AC2-6S1生物安全柜，Esco科技有限公司；SX-700高壓滅菌鍋，日本TOMY公司；5424R臺式微量高速冷凍離心機, 艾本德中國有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離及篩選

取10 g牦牛乳制品置于均質(zhì)袋中，加入100 mL無菌生理鹽水，用均質(zhì)器拍擊2 min，取1 mL菌懸液，梯度稀釋后分別涂布于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CaCO3MRS瓊脂平板上，37 ℃靜置培養(yǎng)24～48 h。選出菌落周圍形成透明圈的菌落，連續(xù)劃線培養(yǎng)純化。選出革蘭氏染色證實為革蘭氏陽性、H2O2酶實驗為陰性的菌株保存[7-9]。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 梅里埃API50試劑盒生化鑒定

API 50 CHL試劑盒用于乳酸桿菌和相關(guān)菌的鑒定，它是由49種可發(fā)酵碳水化合物組成的簡易培養(yǎng)基，培養(yǎng)時由于碳水化合物產(chǎn)酸，pH下降，使指示劑變色，顯示結(jié)果構(gòu)成菌株的生化圖譜，得到的生化譜用API WEB系統(tǒng)讀取，得到菌株鑒定結(jié)果。操作方法參見梅里埃API50試劑盒使用說明[10]。

1.2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

提取分離得到菌株的基因組DNA，用細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGAC-TT-3′)擴增菌株的16S rRNA基因。擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對在 1 500 bp處出現(xiàn)較亮條帶的PCR產(chǎn)物進行測序。測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列進行比對分析，用MEGA軟件構(gòu)建進化樹[11]。

1.2.3 產(chǎn)β-半乳糖苷酶能力評價

1.2.3.1 產(chǎn)β-半乳糖苷酶乳酸菌篩選

將X-gal配制成20 g/L的N,N-二甲基酰胺溶液(-20 ℃避光保存)。將純化后的乳酸菌菌株接種至MRS液體培養(yǎng)基進行復(fù)壯培養(yǎng)，隨后吸取50 μL菌液涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)24～48 h，待所接種的菌株生長成單個菌落時，滴加配制的X-gal 溶液至菌落上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落顏色變化[12-13]。

1.2.3.2 β-半乳糖苷酶活性測定

取1 mL培養(yǎng)液8 000 r/min、4 ℃離心10 min；棄上清液得到菌體沉淀，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入0.2 mL 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的溶菌酶破壁，37 ℃水浴1 h，加0.2 mL 4 mol/L的NaCl混勻，8 000 r/min、4 ℃離心 10 min；取0.25 mL上清液，37 ℃水浴5 min，加入預(yù)熱至37 ℃的20 mmol/L ONPG 0.25 mL，37 ℃水浴反應(yīng)30 min；加入0.75 mL的0.5 mol/L的NaCO3溶液，在420 nm處測定OD值，進而換算成β-半乳糖苷酶活性[14]。ONP的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.885 3x+0.001 6，R2=0.998 1。β-半乳糖苷酶活性單位定義為：1 mL酶液在37 ℃，pH 6.8的條件下，1 min水解ONPG所產(chǎn)生1 μmol ONP的酶量為1個酶活性單位，以U/mL表示[15]。

1.2.4 抑菌能力評價及產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌篩選

1.2.4.1 抑菌能力評價

將乳酸菌菌株以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集上清液，用1 mol/L NaOH調(diào)pH值為6.0[16]。選取食品中常見致病菌單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(ATCC 19111)、大腸埃希菌(CMCC 44103)、金黃色葡萄球菌(CMCC 26003)[17]為指示菌。先將6 mL MRS固體培養(yǎng)基平鋪于雙碟中，置于水平臺面上靜置凝固作為底層，另取MRS固體培養(yǎng)基適量加熱融化后，放冷至48～50 ℃，分別加入稀釋至約108CFU/mL的新鮮培養(yǎng)的指示菌適量，搖勻，在每個雙碟中分別加入10 mL，使在底層上均勻攤布，作為菌層。放置在水平臺上冷卻后，將牛津杯輕輕放置于平板上，將離心上清液加入牛津杯后于4 ℃冰箱中擴散5 h，37 ℃ 培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈大小[18-19]。

1.2.4.2 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌篩選

選取對3種指示菌均具有明顯抑制作用的乳酸菌，分別用過氧化氫酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K在各自作用的最適pH值下處理發(fā)酵上清液，各酶的最終質(zhì)量濃度為1 g/L，37 ℃水浴2 h后，再調(diào)回pH值6.0，比較抑菌圈變化[20]。

1.2.5 凝乳能力評價

將乳酸菌菌株以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，稀釋至約108CFU/mL。取108CFU/ml的菌懸液，以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種于10 mL脫脂乳中，記錄凝乳時間[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，所有試驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛乳制品中乳酸菌的分離

采用選擇性分離方法從牦牛乳制品中共分離培養(yǎng)出32株菌株。根據(jù)菌落形態(tài)特征，選取22株菌落呈黃白或白色，圓形微隆起，表面光滑，顯微鏡鏡檢下革蘭氏陽性，無芽孢，長桿狀、短桿狀或球狀，H2O2酶試驗陰性的菌株進行保存(表1)。

表1 牦牛乳制品中乳酸菌分離情況統(tǒng)計Table 1 Statistics on the isolation of lactic acid bacteria from yak dairy products

2.2 梅里埃API50試劑盒生化鑒定

使用法國梅里埃公司的API50 CHL試劑盒對選取的22株菌株進行鑒定。所得生化譜用API WEB系統(tǒng)讀取，結(jié)果見表2。

表2 梅里埃API50試劑盒生化鑒定結(jié)果Table 2 Results of biochemical identification using the API50 kit

Y1-1、Y2-1、Y3-1、Y4-1、Y5-1、Y5-2、Y6-1、Y7-1、Y8-1、Y10-1、Y11-1、Y12-1、Y12-2、Y16-2、Y18-2鑒定為嗜熱鏈球菌，Y7-2、Y13-2、Y15-1鑒定為發(fā)酵乳桿菌 1，Y9-1鑒定為植物乳桿菌2，Y9-3鑒定為乳明串珠菌，Y13-1鑒定為乳酸乳球菌乳亞種2，Y14-1鑒定為卷曲乳桿菌。

2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

選擇枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)菌株的相關(guān)基因作為外參，以16S rRNA基因的部分序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。通過比對菌株的16S rRNA基因序列，確定這22株乳酸菌菌株分別是Streptococcusthermophilus(嗜熱鏈球菌15株)，Lactobacillusfermentum(發(fā)酵乳桿菌3株)，Enterococcusdurans(堅忍腸球菌1株)，Leuconostoclactis(乳明串珠菌1株)，Enterococcusfaecium(糞腸球菌1株)，Streptococcusmacedonicus(馬其頓鏈球菌1株)。

圖1 基于16S rRNA基因分析的部分分離菌株和近源菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic trees based on 16S rRNA gene sequencing results of partial isolates and related strains

對比16S rRNA分子生物學(xué)鑒定結(jié)果和梅里埃API50試劑盒生化鑒定結(jié)果，22株菌株中，19株(86.4%)菌株的鑒定結(jié)果完全相同，3株(13.6%)菌株的鑒定結(jié)果不同，分別是Y9-1，Y13-1和Y14-1,如表3所示。

表3 菌株鑒定結(jié)果匯總Table 3 The results of strain identification

2.4 產(chǎn)β-半乳糖苷酶能力評價

β-半乳糖苷酶催化無色的X-gal水解呈藍(lán)色，實驗測得滴加X-gal溶液后菌株Y9-1、Y9-3、Y13-1呈淡藍(lán)色，Y14-1不變色，其余菌株呈藍(lán)色。

β-半乳糖苷酶活性測定結(jié)果見圖2，不同乳酸菌具有不同的β-半乳糖苷酶活性，即使是同屬不同種，甚至不同亞種的乳酸菌，其β-半乳糖苷酶活性也有所不同。酶活性測定結(jié)果與X-gal水解實驗結(jié)果相印證。結(jié)合菌株鑒定結(jié)果，嗜熱鏈球菌、發(fā)酵乳桿菌普遍具有較好的β-半乳糖苷酶活性。堅忍腸球菌、乳明串珠菌、糞腸球菌和馬其頓鏈球菌幾乎不具有產(chǎn)β-半乳糖苷酶能力。

圖2 β-半乳糖苷酶活性測定結(jié)果Fig.2 The results of β-galactosidase activity

2.5 抑菌能力評價

采用管碟法，測得Y9-1對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌均有抑制作用，抑菌圈直徑分別為16.30、28.40、22.93 mm，結(jié)果見圖3。Y13-1對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌均有抑制作用，抑菌圈直徑分別為18.87、25.65、12.30 mm，結(jié)果見圖4。其余菌株均未表現(xiàn)出對指示菌的抑制能力。結(jié)合菌株鑒定結(jié)果，嗜熱鏈球菌和發(fā)酵乳桿菌普遍不具有抑菌能力，堅忍腸球菌Y9-1和糞腸球菌Y13-1具有較強的抑菌能力。

菌株Y9-1、Y13-1的發(fā)酵上清液用H2O2酶處理后，抑菌圈大小和未作處理的上清液抑菌圈大小基本一致，用胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K處理后抑菌圈完全消失。表明上清液中的抑菌物質(zhì)不是H2O2，而是細(xì)菌素。

a-對金黃色葡萄球菌的抑制能力；b-對大腸埃希菌的抑制能力；c-對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑制能力圖3 Y9-1對指示菌的抑菌能力Fig.3 The bacteriostatic ability of strain Y9-1 to indicator bacteria

a-對金黃色葡萄球菌的抑制能力；b-對大腸埃希菌的抑制能力；c-對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑制能力圖4 Y13-1對指示菌的抑菌能力Fig.4 The bacteriostatic ability of strain Y13-1 to indicator bacteria

2.6 凝乳能力評價

測定各菌株的凝乳時間，菌株Y7-2、Y9-3、Y13-2、Y15-1不具有凝乳能力，其余菌株凝乳時間見圖5，Y9-1凝乳時間較長達(dá)37 h。其余菌株凝乳時間均在8～19 h。結(jié)合菌株鑒定結(jié)果，發(fā)酵乳桿菌和乳明串珠菌不具有凝乳能力。嗜熱鏈球菌、糞腸球菌和馬其頓鏈球菌凝乳時間均<20 h，凝乳能力強。堅忍腸球菌Y9-1凝乳時間長，凝乳能力弱。

圖5 18株乳酸菌的凝乳時間Fig.5 Coagulation time of 18 lactic acid bacteria

3 結(jié)論與討論

現(xiàn)在大多數(shù)文獻(xiàn)中菌株鑒定采用基因鑒定的方法，忽視了表型鑒定。表型鑒定和基因鑒定屬于2個不同方法，對應(yīng)2種不同的分類學(xué)，基因決定蛋白，進而決定表型，兩者互為補充。本研究同時采用梅里埃API50試劑盒和16S rRNA分子生物學(xué)方法鑒定分離株，19株(86.4%)菌株的鑒定結(jié)果完全相同，3株(13.6%)菌株的鑒定結(jié)果不同。采用不同的鑒定方法得到不同的鑒定結(jié)果是菌株鑒定中時常碰到的[22-23]，凡是試驗方法均有一定的誤差，為了得到更準(zhǔn)確的結(jié)果，有必要結(jié)合多種鑒定方法。

本研究從青海傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳制品中分離得到22株菌株，其中嗜熱鏈球菌15株(68.2%)，發(fā)酵乳桿菌3株(13.6%)，堅忍腸球菌1株(4.5%)，乳明串珠菌1株(4.5%)，糞腸球菌1株(4.5%)，馬其頓鏈球菌1株(4.5%)。青海省全省大部分地區(qū)海拔在3 000～5 000 m，氣溫低，晝夜溫差大，含氧量隨海拔升高而降低。不同采樣地的海拔和氣候不同，適合生長的菌株不同。

本研究分離得到的15株嗜熱鏈球菌和3株發(fā)酵乳桿菌均具有較好的β-半乳糖苷酶活性。而堅忍腸球菌、乳明串珠菌、糞腸球菌和馬其頓鏈球菌幾乎不具有產(chǎn)β-半乳糖苷酶能力，與IBRAHIM等[24]發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌ST3(StreptococcusthermophillusST3)具有很好的 β-半乳糖苷酶活性的研究結(jié)果相一致。β-半乳糖苷酶可以將乳糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖和半乳糖，降低乳糖含量，避免乳糖結(jié)晶析出，增加乳品甜度，緩解人群中普遍存在的乳糖不耐癥[5]。目前不同來源的β-半乳糖苷酶已被應(yīng)用于低乳糖牛奶的生產(chǎn)當(dāng)中，乳糖的水解可以增加乳制品的甜度，從而使其適合乳糖不耐癥人群的消費[13]。雖然可分泌半乳糖苷酶的生物種類繁多，但目前主要采用微生物發(fā)酵的方法來生產(chǎn)β-半乳糖苷酶，主要是因為微生物具有生命力強、繁殖速度快、不受季節(jié)影響、無污染及易于分離等優(yōu)勢。因此選育微生物菌種仍是生產(chǎn)β-半乳糖苷酶的主要方式[14]。本研究為β-半乳糖苷酶的生產(chǎn)提供了科學(xué)依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)了2株產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌Y9-1和Y13-1，所產(chǎn)細(xì)菌素對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌均有較強抑制作用，具有廣譜抑菌活性。細(xì)菌素是由某些細(xì)菌在發(fā)酵過程中通過核糖體合成產(chǎn)生的一類有抑(殺) 菌活性的蛋白或多肽類物質(zhì)[25-27]。其作用機制特殊，致病菌不會對其產(chǎn)生耐藥性，也不會像抗生素一樣產(chǎn)生耐藥株，由于其本質(zhì)是多肽，在人體內(nèi)會被蛋白酶消化，因而不會改變?nèi)梭w腸道正常菌群的存活，已經(jīng)成為現(xiàn)階段乃至今后很長一段時間微生物天然防腐劑的研究熱點[28]，本研究為研究者今后進一步研究這2種細(xì)菌素的分子結(jié)構(gòu)、抑菌機制等奠定了基礎(chǔ)，為發(fā)現(xiàn)新的更安全的食品添加抑菌劑提供了素材。

本研究分離得到的嗜熱鏈球菌、糞腸球菌和馬其頓鏈球菌凝乳能力強，堅忍腸球菌凝乳能力弱，發(fā)酵乳桿菌和乳明串珠菌不具有凝乳能力。凝乳時間是指牛乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵凝結(jié)呈果凍狀且傾斜無液態(tài)流動時所需的時間，凝乳時間決定著乳酸菌的凝乳能力[21]，凝乳能力是乳酸菌是否適合作為乳制品發(fā)酵劑的一項重要考察指標(biāo)，本研究為開發(fā)具有特色的發(fā)酵制品提供了理論依據(jù)。