原攀紅，呂雪芹，劉延峰，李江華，劉龍，堵國成*

1(江南大學，未來食品科學中心，江蘇 無錫，214122)2 (糖化學與生物技術教育部重點實驗室(江南大學) 江蘇 無錫，214122)

甲基萘醌類是一類廣泛存在于微生物細胞內(nèi)的化合物，在孢子形成、氧化磷酸化和電子傳遞等方面起著重要的作用[1]。甲基萘醌類又被稱為維生素K2[2]，它們是維生素K依賴蛋白谷氨酸殘基翻譯后轉化的重要輔助因子。目前，存在有14種menaquinone-n(MK-n)，其中n為側鏈上的異戊二烯單位數(shù)，這條尾巴的長度因微生物的不同而不同[3]。MK-4在凝血、預防骨質疏松、緩解心血管鈣化、預防糖尿病和抑制炎癥[4-5]等方面具有重要作用。

MK-4的合成方法包括化學合成法和微生物發(fā)酵法?；瘜W合成法生產(chǎn)MK-4具有挑戰(zhàn)性，因為全反式構型的MK-4才具有生物活性[6]。微生物發(fā)酵法具有選擇性生產(chǎn)全反式異構體的優(yōu)勢[7]。目前研究者已經(jīng)在野生型Bacillussubtilisnatto[8]、Flavobacteriumsp.238-7-K3-15[9]、Pichiapastoris[10]菌株中對MK-4的合成進行研究。但是，這些菌株的代謝途徑復雜，改造相對困難。然而，B.subtilis168被普遍認為是食品安全級模式菌株，且具有生長速度快、遺傳特性良好等優(yōu)點，還具有合成生物學工具和專門的文庫[11-12]，因此，我們選擇B.subtilis168進行代謝途徑的合成和調控。在前期研究中，我們通過采用模塊途徑工程策略提高了B.subtilis168中MK-4的產(chǎn)量，但由于代謝途徑固有的局限性，MK-4的產(chǎn)量仍然較低[13]?；谌后w感應(quorum sensing,QS)的動態(tài)調控已被廣泛應用[14]，作為一種基本工具，在細胞密度變化的反應中微調基因表達，而無需添加昂貴的誘導物[15]。采用PhrQ-RapQ-ComA QS系統(tǒng)來動態(tài)控制枯草芽孢桿菌中MK-4的合成，提高MK-4的產(chǎn)量[16]。目前，關于微生物發(fā)酵法主要通過基因工程手段激活或改善胞內(nèi)途徑基因的表達以強化MK-4的生產(chǎn)，有關質膜穩(wěn)態(tài)調控的報道相對較少。微生物的質膜起著保護屏障的作用，將細胞質和細胞外環(huán)境分開。在工業(yè)發(fā)酵條件下，菌株的生存在很大程度上取決于膜穩(wěn)態(tài)，它涉及許多重要的生理功能，如信號轉導、抗壓力、能量代謝、溶質運輸、細胞生長和生產(chǎn)[17]。因此，維持膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)是提高工業(yè)生物過程生產(chǎn)力的有效途徑。

工業(yè)發(fā)酵條件下，細胞面臨各種壓力條件，如pH值、極端溫度、氧化、滲透壓變化、溶劑和有毒代謝物[17]，會對細胞生長產(chǎn)生負面影響并限制代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。膜損傷經(jīng)常被認為是這種應力誘導的主要機制之一[18]。因此，本研究對B.subtilisBC04進行細胞膜穩(wěn)態(tài)優(yōu)化，通過整合分析改善細胞膜的完整性相關基因srfAD、pssA、clsA、groESL、tagO、guaA和dacA，流動性相關基因fabD、ypkP，滲透性相關基因fadR的缺失，提高MK-4的積累。在此基礎上，在3 L發(fā)酵罐上分析MK-4的發(fā)酵過程，為進一步提升工業(yè)水平MK-4發(fā)酵性能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質粒

枯草芽孢桿菌B.subtilis168為本實驗室保存，BC04是經(jīng)過基因改造獲得的高產(chǎn)菌株[13, 16]。質粒pHT-XCR6和pcrF17 NM為本實驗室保存[19]。

1.1.2 重組質粒的構建

以pcrF17 NM為模板PCR擴增載體獲得pcrF17 NM-crRNA，整合基因融合片段與載體,運用一步克隆的方式構建重組質粒[19]。所用引物如表1所示。

表1 本文使用的引物Table 1 Primers used in this study

續(xù)表1

1.1.3 主要試劑

大豆蛋白胨、蛋白粉、酵母粉，Oxoid公司；MK-4標品，Sigma-Aldrich公司；其他試劑來自國藥試劑。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基 (g/L)：蛋白胨 10，酵母膏 5，NaCl 10。加入15～20 g/L瓊脂制作固體培養(yǎng)基，于121 ℃ 下滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖 50，大豆蛋白胨 50，甘油50，KH2PO40.6。于115 ℃下滅菌20 min。

上罐發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：大豆蛋白胨 50，甘油50，KH2PO40.6，補料瓶中葡萄糖 500。于115 ℃下滅菌20 min。

1.1.5 儀器與設備

恒溫搖床，上海知楚儀器有限公司；722 s可見分光光度計，上海棱光技術有限公司；葡萄糖-乳酸生物傳感器分析儀，深圳西爾曼科技有限公司；3 L發(fā)酵罐，上海迪比爾生物工程有限公司；臺式高速離心機，德國Eppendorf公司；安捷倫1260液相色譜儀，美國安捷倫公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)：挑取活化的單菌落于液體種子培養(yǎng)基中，于37 ℃，220 r/min培養(yǎng)12 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：培養(yǎng)好的種子液以10%的接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，在40 ℃，220 r/min的搖床上進行發(fā)酵培養(yǎng)。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：以10%接種量將培養(yǎng)好的種子液轉接到3 L發(fā)酵罐中，總裝液量為1.5 L，攪拌轉速500 r/min，通氣量2 g/(L·h)，500 g/L葡萄糖溶液調節(jié)控制葡萄糖質量濃度在4～10 g/L，40 ℃下培養(yǎng)。發(fā)酵過程中多次取樣測定菌株的發(fā)酵參數(shù)。

1.2.2 分析方法

取適當體積的發(fā)酵液，加入2 mL萃取劑，萃取劑為V(2-丙醇)∶V(正丁烷)=1∶2[20]。加入去離子水將菌液稀釋至合適的倍數(shù)，測定OD600值。細胞干重(dry cell weight,DCW)與吸光度之間的關系為DCW=0.35×OD600；利用葡萄糖-乳酸生物傳感器分析儀對發(fā)酵液中葡萄糖含量進行測定；利用高效液相色譜對MK-4含量進行檢測分析。其色譜檢測條件為：有機酸柱型號為C18ODS column (5 μm，250 mm×4.6 mm)，紫外檢測波長254 nm，柱溫箱溫度為40 ℃，進液量為10 μL，流速為1 mL/min，流動相為V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=9∶1，吸取萃取上清液用于樣品分析；采用Graph Pad Prism 8對單因素實驗結果進行顯著性分析，統(tǒng)計顯著性表示如下，*為P<0.05,**為P<0.01。

2 結果與分析

2.1 增強細胞膜的完整性對MK-4合成和細胞生長的影響

膜完整性的喪失與生存能力的降低有關，它可以作為一個標記區(qū)分活細胞和死細胞[21]。膜的完整性受飽和、不飽和脂?；湵壤齕22]、磷脂頭基團的分布、麥角甾醇和鞘脂含量、膜蛋白的活性等因素的影響[23]。因此，膜的完整性的提高可通過膜脂組成、膜蛋白、脅迫耐受性等方面采取措施。由于合成MK-4發(fā)酵周期長，細胞容易裂解，因此加強細胞膜完整性相關基因的表達對MK-4的合成尤為重要[24-25]。膜蛋白相關基因srfAD，膜脂質相關基因pssA和clsA，細胞抵抗不良外界環(huán)境的相關基因groESL、tagO、guaA和dacA，加強這些基因的表達(圖1-a)，并通過HPLC對菌株BF01～BF07的MK-4產(chǎn)量進行檢測，分析比較MK-4生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量變化。

由圖1-b可知，7株不同菌株BF01～BF07的MK-4最終產(chǎn)量有所差異。其中，BF01的MK-4產(chǎn)量相對最高，達到(203.11±3.23) mg/L，MK-4生產(chǎn)強度為1.21 mg/(L·h)(表2)。說明膜蛋白相關基因srfAD對于膜的完整性和MK-4的合成有一定的影響。膜蛋白包括轉運、通道、受體、酶和結構域-錨定域等蛋白，參與積累和傳遞能量，膜蛋白的表達可以增強膜的完整性[26]。因此，膜蛋白SrfAD的表達有助于加強膜的完整性和強化MK-4的生產(chǎn)。

a-整合基因獲得對應的菌株BF01～BF07；b-菌株BF01～BF07的MK-4產(chǎn)量的變化圖1 膜完整性相關基因的整合及對MK-4產(chǎn)量的影響Fig.1 Integration of membrane integrity-related genes and its effect on MK-4 production

表2 不同菌株發(fā)酵參數(shù)的對比Table 2 Comparison of fermentation parameters of different strains

2.2 增強細胞膜的流動性對MK-4合成和細胞生長的影響

微擾膜的流動性是影響工業(yè)菌株生存能力的一個常見問題和挑戰(zhàn)[27]。膜流動性是由膜上直鏈不飽和脂肪酸的長度和程度決定，因此，調節(jié)膜的流動性可通過調節(jié)直鏈脂肪酸結構、鞘脂和甾醇含量、非直鏈脂肪酸的合成。基因fabD的表達可以調節(jié)脂肪酸鏈的結構，增強膜脂酰基鏈的長度?；騳pkP的表達可以上調膜鞘脂含量，以適應不良環(huán)境。如圖2-a所示，分別加強這2個基因的表達，并通過HPLC對菌株MK-4的最終產(chǎn)量進行檢測，分析BF08和BF09菌株產(chǎn)量的變化。

由圖2-b可知，在以上2株不同菌株中，MK-4最終產(chǎn)量有所差異。BF08的MK-4產(chǎn)量達到(197.23±1.26) mg/L，MK-4生產(chǎn)強度為1.17 mg/(L·h)。BF09的MK-4產(chǎn)量相對最高，達到(200.85±1.6) mg/L，MK-4生產(chǎn)強度為1.19 mg/(L·h)。因此，基因fabD和ypkP的表達，有利于MK-4產(chǎn)量的積累，且基因ypkP的表達更有利于MK-4產(chǎn)量的提高。

a-整合基因獲得對應的菌株BF08～BF09；b-菌株BF08～BF09的MK-4產(chǎn)量的變化圖2 膜流動性相關基因的整合及對MK-4產(chǎn)量的影響Fig.2 Integration of membrane fluidity-related genes and its effect on MK-4 production

2.3 調節(jié)膜的滲透性對MK-4合成和細胞生長的影響

調節(jié)膜的滲透性包括調節(jié)離子、營養(yǎng)物質和有毒物質的跨膜[28]。微生物維持膜的滲透性通過膜脂質的穩(wěn)態(tài)，膜蛋白的作用，以及調節(jié)細胞內(nèi)的能量系統(tǒng)用于膜組裝和允許底物跨膜移動。脂肪酸降解調節(jié)因子的缺失，可增加膜不飽和脂肪酸的含量，進而使膜對有機溶劑滲透性下降，從而提高菌株的耐受性[29]。

基因fadR的缺失，可以使菌株耐溶性增強，飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例提高[29]。由圖3可知，基因fadR缺失后，BF10菌株的產(chǎn)量上升，達到(183.35±1.66) mg/L，MK-4生產(chǎn)強度為1.09 mg/(L·h)。因此，調節(jié)B.subtilisBC04脂肪酸的比例，可實現(xiàn)調節(jié)細胞膜的滲透性，促進MK-4的產(chǎn)量的提高。

圖3 基因fadR對菌體MK-4產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of gene fadR on the MK-4 production

2.4 脂膜穩(wěn)態(tài)相關基因的組合對MK-4合成和細胞生長的影響

近年來膜穩(wěn)態(tài)工程的發(fā)展表明，膜穩(wěn)態(tài)工程方法提高工業(yè)菌株的生理功能，是一種提高生產(chǎn)效率的有效方式。通過對上述影響B(tài).subtilis細胞膜完整性、流動性和滲透性相關基因的分析，我們將上述較優(yōu)的特征進行組合，如圖4所示，并通過發(fā)酵分析找出能合成MK-4 產(chǎn)物的最優(yōu)菌株。

圖4 基因組裝獲得對應的菌株BF11～BF14Fig.4 The corresponding strains BF11～BF14 obtained by assembly of genes

由圖5可知，在以上4株不同菌株中，MK-4最終產(chǎn)量有所差異。其中，BF14的MK-4產(chǎn)量相對最高，達到(213.80±2.16) mg/L，MK-4生產(chǎn)強度為1.26 mg/(L·h)。因此，BF14可作為最優(yōu)菌株用于進一步的分析。

圖5 基因的組裝對菌體MK-4產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of gene assembly on the MK-4 production注：**表示差異極顯著(P<0.01)

2.5 重組枯草芽孢桿菌的3 L罐連續(xù)補料發(fā)酵

在搖瓶培養(yǎng)的基礎上，將工程菌株BF14在3 L發(fā)酵罐中進行補料分批培養(yǎng)。由圖6-a可知，在發(fā)酵第1天，發(fā)酵液中檢測到MK-4，且上清液中MK-4的含量高于細胞內(nèi)的含量。在分批補料培養(yǎng)條件下，葡萄糖質量濃度控制在4～10 g/L，培養(yǎng)第2天和第4 天分別在發(fā)酵罐中添加1%(體積分數(shù))甘油和2%(質量分數(shù))大豆蛋白胨。細胞培養(yǎng)30 h時密度達到29.5(OD600)，之后下降。在pH自然狀態(tài)下，第5天MK-4的最大產(chǎn)量達到(249.65±2.34) mg/L(圖6-b)，生產(chǎn)強度達到2.08 mg/(L·h)。上述結果表明，葡萄糖質量濃度控制的補料分批培養(yǎng)有利于菌株BF14生產(chǎn)MK-4，為MK-4的規(guī)?；a(chǎn)提供了依據(jù)。

a-3 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵過程圖；b-MK-4產(chǎn)量分析圖圖6 BF14在3 L罐中補料分批發(fā)酵Fig.6 Batch fermentation of BF14 in 3 L fermentor

3 結論

MK-4作為一種重要的維生素，廣泛應用于制藥、日化、食品以及農(nóng)業(yè)等領域[5]。目前主要通過基因工程手段改善細胞中分支代謝途徑、群體響應調控細胞生長與產(chǎn)物形成，有關脂膜穩(wěn)態(tài)的優(yōu)化與控制的報道相對較少。本文從細胞膜穩(wěn)態(tài)方面進行分析，首先分析了細胞膜的完整性，包括膜蛋白相關基因srfAD，膜脂質相關基因pssA和clsA，細胞抵抗不良外界環(huán)境的相關基因groESL、tagO、tuaA和dacA。加強這些基因的表達，搖瓶水平發(fā)酵7 d MK-4最高產(chǎn)量為(203.11±3.23) mg/L。膜流動性相關基因ypkP的表達上調膜鞘脂含量，MK-4產(chǎn)量達到(200.85±1.6) mg/L。調控脂質介導的調節(jié)因子fadR的缺失，提高了菌株MK-4的產(chǎn)量，達到(183.35±1.66) mg/L。較未優(yōu)化前分別提高了13.53%、12.27%和2.49%。通過組合優(yōu)化，MK-4最高產(chǎn)量為(213.80±2.16) mg/L，較BC04提高了19.51%。在此基礎上進行3 L發(fā)酵罐的放大發(fā)酵并對過程中的發(fā)酵動力學參數(shù)進行了分析。維持葡萄糖質量濃度為4～10 g/L，最終MK-4產(chǎn)量、生產(chǎn)強度分別達到(249.65±2.34) mg/L、2.08 mg/(L·h)。已有的研究表明，枯草芽孢桿菌有害物質的積累是影響MK-4代謝合成的原因之一。近年來，關于CRISPRI的基因編輯方法日趨成熟[30]。在后續(xù)研究中，通過建立CRISPRI系統(tǒng)并弱化潛在的代謝產(chǎn)物合成相關基因表達，有望進一步提升MK-4積累水平。本研究相關脂膜優(yōu)化與補料策略為利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)MK-4的放大實驗提供了理論與技術參考。