龐俊芳 梁宗志 李 斌 黃亞鵬 張清偉

宮頸癌(cervical cancer，CC)對于女性來說是比較常見的癌癥，在世界女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病率排名第三。目前臨床對宮頸癌的治療主要采取手術(shù)聯(lián)合鉑類藥物進(jìn)行化療，但沒有顯示出較好的治療效果，因此，尋找新的治療靶點和治療方案是在宮頸癌方面的研究熱點。microRNA是一類長度為18-25nt的非編碼的微小RNA，廣泛參與細(xì)胞的多種生物學(xué)活動，目前，已有報道證實miRNA參與宮頸癌的發(fā)病機制，對腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖等過程都有重要影響[1]。另外，磷酸酶及張力蛋白同系物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)作為1種抑癌基因，有研究推測PTEN能夠通過蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)通路調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞代謝，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及活性[2-3]。因此，本研究主要是在PTEN/AKT信號通路的基礎(chǔ)上探討miR-128對宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖、侵襲作用的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

宮頸癌SiHa細(xì)胞由上海細(xì)胞研究所提供；miR-128-mimics和miR-128-inhibitor慢病毒構(gòu)建體購自廣州銳博生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基(貨號A4192101，規(guī)格500 ml)、胎牛血清(貨號10099，規(guī)格100 ml)購自美國Gibco公司；DMSO試劑(貨號D12345，規(guī)格10×3 ml)、TRIzol試劑(貨號15596026，規(guī)格100 ml)、Lipofectamine 2000(貨號11668027，規(guī)格0.75 ml)、兔源PTEN抗體(貨號51-2400，規(guī)格200 μg)、兔源p-AKT抗體(貨號MA5-14916，規(guī)格100 μl)、二抗羊抗兔lgG(貨號A16172，規(guī)格1 mg)均購自Invitrogen公司；MTT(貨號0793，規(guī)格1 g，Amresco公司)；Transwell小室(貨號3413)購自Corning公司；S1000梯度PCR儀、電泳轉(zhuǎn)膜設(shè)備(型號1658033)購自Bio-Rad公司等。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將購買的SiHa細(xì)胞用含10%胎牛血清的NMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，保持溫度為37 ℃、5%的CO2濃度、95%的空氣濕度，當(dāng)細(xì)胞貼壁70%～80%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞作為試驗對象。使用Lipofectamine 2000將miR-128-mimic和miR-128-inhibitor轉(zhuǎn)染至宮頸癌SiHa細(xì)胞中，分別作為觀察組和陰性對照組，另外再取未處理的宮頸癌SiHa細(xì)胞作空白對照組。

1.2.2 RT-PCR技術(shù) 取觀察組與陰性對照組的宮頸癌SiHa細(xì)胞，用TRIzol試劑提取SiHa細(xì)胞中的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用PCR儀進(jìn)行檢測。反應(yīng)條件為95 ℃30 s(預(yù)變性)，95 ℃10 s(變性)，55 ℃30 s(退火)，70 ℃10 s(延伸)，總共循環(huán)30次。PCR反應(yīng)系統(tǒng)以U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計算，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.3 Western Blot實驗 取觀察組與陰性組的宮頸癌SiHa細(xì)胞，按照蛋白提取試劑盒要求提取細(xì)胞中的總蛋白，提取完成后將其置于-80 ℃環(huán)境保存?zhèn)溆?。蛋白樣品用SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，濕法將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉在室溫的條件下封閉一小時，按照說明書的方法加入一抗，PTEN抗體(1∶500)，p-AKT抗體(1∶1000)，β-action抗體(1∶1000)，4 ℃孵育過夜后加入二抗lgG(1∶5000)，室溫條件下孵育一小時，顯色顯影，分析。

1.2.4 MTT法 將三組細(xì)胞分別接種于96孔板，每組三個平行樣本，分別在接種的第1、2、3、4、5、6、7天加入MTT試劑及DMSO試劑，在490 nm下測量吸光度，觀察細(xì)胞生長情況，繪制細(xì)胞生長曲線表。

1.2.5 Transwell小室法 將三組細(xì)胞懸濁液分別接種于小室的上室，把含血清的培養(yǎng)基放在下室，將細(xì)胞放入適宜的環(huán)境下培養(yǎng)48 h，取出小后用結(jié)晶紫染色，用高倍鏡觀察，隨機抽取三處視野計算細(xì)胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌SiHa細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平

PCR檢測結(jié)果顯示，陰性組作為miR-128抑制組，陰性組宮頸癌SiHa細(xì)胞中miR-128的表達(dá)低于觀察組，但陰性組的PTEN mRNA表達(dá)高于觀察組，組間比較具有統(tǒng)計學(xué)差異，檢測結(jié)果見圖1。

圖1 宮頸癌SiHa細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平

2.2 宮頸癌SiHa細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平

免疫印跡法結(jié)果顯示，觀察組PTEN蛋白表達(dá)量低于陰性組，p-AKT蛋白表達(dá)量高于陰性組，檢測結(jié)果見圖2。

圖2 宮頸癌SiHa細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平

2.3 miR-128對宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖作用的影響

觀察組和陰性對照組中SiHa細(xì)胞的增殖能力均低于空白對照組，觀察組SiHa，細(xì)胞增殖能力低于陰性對照組，三組之間比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，試驗結(jié)果見圖3。

圖3 宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖能力

2.4 miR-128對宮頸癌SiHa細(xì)胞侵襲作用的影響

觀察組與陰性對照組的SiHa細(xì)胞侵襲能力均低于空白對照組，觀察組侵襲能力更低，三組之間比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，試驗結(jié)果見圖4。

圖4 宮頸癌SiHa細(xì)胞侵襲能力

3 討論

宮頸癌臨床常見的女性生殖系統(tǒng)方面產(chǎn)生的惡性腫瘤，在女性中發(fā)病的概率較高，進(jìn)近低于乳腺癌的發(fā)病率[4-6]，嚴(yán)重威脅我國女性的生命安全，目前的手術(shù)治療手段效果較差，尋找宮頸癌新的治療靶點和治療方法對臨床治療具有重大意義[7]。

目前已知，miRNA與宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡等生理功能密切相關(guān)，被認(rèn)為是宮頸癌早期診斷治療的新靶點[8]。例如，有研究證實過表達(dá)miR-10b能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵染[9]；miR-15a和miR-16能夠增強宮頸癌Hela細(xì)胞的凋亡[10]；上調(diào)miR-195的表達(dá)能抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移以及浸潤[11]；miR-126的在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)影響患者的生存期[12]等。而miR-128在宮頸癌CC中的研究較少，現(xiàn)有的文獻(xiàn)結(jié)果表明，miR-128能夠促進(jìn)宮頸癌CC細(xì)胞的凋亡、收斂宮頸癌CC細(xì)胞株的增殖和侵染效果[13-14]。磷酸酶及張力蛋白同系物PTEN因其具有獨特的酪氨酸磷酸酶活性，被廣泛的用于腫瘤的相關(guān)研究，PTEN主要通過阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞遷移、抑制腫瘤組織血管生成這幾個方面影響癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，PTEN在宮頸癌方面的研究總體偏少，關(guān)于PTEN對宮頸癌細(xì)胞的影響及作用機制尚存在一些爭議，但可以確定PTE能夠N抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，推測可能通過對PI3K-AKT通路的抑制作用來實現(xiàn)[15]。本研究就是想在PTEN/AKT通路的基礎(chǔ)上討論miR-128對宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-128組的宮頸癌SiHa細(xì)胞中miR-128的表達(dá)量相對于抑制表達(dá)組升高，而PTEN mRNA表達(dá)量下降；經(jīng)過Western Blot實驗檢測SiHa細(xì)胞中的蛋白表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-128組中SiHa細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)水平高于陰性對照組，p-AKT表達(dá)水平高于陰性對照組。以上兩個實驗表明，miR-128對PTEN mRNA和蛋白的表達(dá)水平起到抑制作用，而PTEN能夠負(fù)向調(diào)控PI3K/AKT信號通路，刺激AKT進(jìn)行表達(dá)，增加AKT的磷酸化水平，加速新血管生成，促進(jìn)細(xì)胞的增殖作用，實驗結(jié)果與之前的研究結(jié)果相吻合，這里miR-128對PTEN的調(diào)控作用表明miR-128可能是潛在癌基因。但通過MTT法和Transwell小室法對miR-128對SiHa細(xì)胞的增殖作用、侵襲作用進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)過將表達(dá)miR-128組的癌細(xì)胞與正常表達(dá)的癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力進(jìn)行比較，過表達(dá)miR-128組能夠減緩癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，這一結(jié)果與之前推測的結(jié)論相悖，而與其他關(guān)于miR-128減弱腫瘤細(xì)胞的增殖能力的結(jié)論相吻合。陰性對照組中SiHa細(xì)胞增殖與侵襲能力也低于空白對照組的SiHa細(xì)胞，可能是由于PTEN的低表達(dá)抑制了AKT的磷酸化，從而對SiHa細(xì)胞的增殖、侵襲作用起到抑制作用。本研究參考了許多文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)miR-128和PTEN單獨均可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲，但將二者聯(lián)系起來進(jìn)行研究得出的結(jié)論與現(xiàn)存研究不相符，推測可能受其他調(diào)控因素影響，而關(guān)于二者結(jié)合的文獻(xiàn)很少，未來可以對mir-128和PTEN在宮頸癌方面的作用機制進(jìn)行深入研究，探索更多靶點。

綜上所述，miR-128起到抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖、侵襲作用，miR-128能夠激活PTEN/AKT信號通路，但關(guān)于兩者之間的相互聯(lián)系及具體作用機制目前尚不明確，有待于進(jìn)一步研究。