王穩(wěn)利，曾倩倩，劉 巖，邱宗波

（河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/河南省農(nóng)業(yè)微生物生態(tài)與技術(shù)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453007）

MicroRNA（miRNA）是一類由21～24個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，主要是在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平指導(dǎo)靶miRNA的剪切或抑制翻譯來調(diào)控基因的表達(dá)［1］，作為近年來一直研究的熱點(diǎn)調(diào)控分子，miRNAs在調(diào)控高山松（Pinusdensata）的生長(zhǎng)發(fā)育［2］、落葉松的體胚發(fā)育［3］以及生物和非生物脅迫應(yīng)答過程中起著重要的作用［4］。

miR482作為植物體內(nèi)一類重要的miRNA，近年來一直受到研究者們的廣泛關(guān)注。利用生物信息學(xué)技術(shù)，張玉娟等［5］從棉花中鑒定出miR395a、miR396a、miR397a、miR399a、miR414a、miR482b、miR7485等64個(gè)與棉花黃萎病抗性相關(guān)的miRNA，并對(duì)獲得的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)和功能分析。過表達(dá)馬鈴薯miR482e能夠增強(qiáng)植物對(duì)黃萎病菌的敏感性［6］。Zuo等［7］研究發(fā)現(xiàn)miR482在番茄果實(shí)成熟軟化過程中顯示出不同的表達(dá)模式。利用高通量測(cè)序技術(shù)，Li等［8］從豌豆中鑒定出miR482，并發(fā)現(xiàn)miR482能夠明顯增加豌豆結(jié)莢數(shù)目。盡管miR482在多個(gè)植物中已有較為深入的研究，但目前在裸子植物高山松中，miR482的鑒定及其在高山松生長(zhǎng)發(fā)育過程中的功能尚不清楚。

高山松是一種具有重要生態(tài)意義的針葉樹裸子植物［9］。本研究從課題組前期高山松小RNA高通量測(cè)序結(jié)果中獲得miR482a，并利用PCR技術(shù)進(jìn)行miR482a前體序列的克隆與分析。通過在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站獲得miR482a的靶基因，并利用RLM-5′RACE進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)還對(duì)miR482a及其靶基因在高山松根、莖和針葉中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步揭示miR482a在高山松生長(zhǎng)發(fā)育中的作用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

高山松幼苗于2020年9月在人工氣候室中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為晝/夜溫度25℃/18℃，光周期16 h/8 h，相對(duì)濕度65%～70%。

1.2 方法

1.2.1 高山松miR482a前體序列的克隆及其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用植物總RNA提取試劑盒RNAiso Plus Reagent（TaKaRa，大連）從高山松幼苗中提取高質(zhì)量RNA。從課題組前期高山松miRNA高通量測(cè)序結(jié)果中得到高山松miR482a的前體序列：UGAGAAGU GAAGGGAUGUGUUUUGUGGAUGGGAGUCUUGAG GAGUGGGAGCAUAGGAUAAGGCUGCUUCAUAUC ACCAGUCUUUCCUACUCCUCCCAUUCCUAUUGCC UUCACCACACAUCCCUUCCCAA。用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表1）。利用Clustalx 2.0軟件，將高山松pde-miR482a的成熟序列與玉米zma-miR482a、大豆gma-miR482a、火炬松pta-miR482a、毛果楊ptc-miR482a、歐洲云杉pabmiR482、葡萄vvi-miR482以及人參pgi-miR482的成熟序列進(jìn)行序列比對(duì)。并利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建miR482a前體與其他物種miR482前體的系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用RNAfold web server在線軟件預(yù)測(cè)miR482a前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 高山松miR482a靶基因的預(yù)測(cè)與切割位點(diǎn)驗(yàn)證 高山松miR482a的成熟序列利用在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站psRNATarget（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/）進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)。在高山松的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行miR482a靶基因的預(yù)測(cè)，設(shè)置罰分小于3，其余參數(shù)為默認(rèn)。依據(jù)靶基因的cDNA序列用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)用于RLM-5′RACE的引物（表1）。RLM-5′RACE試驗(yàn)參照孔雷等［10］的方法，將擴(kuò)增出的特異產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用RNAiso Plus Reagent（TaKaRa，大連）分別提取高山松幼苗根、莖和針葉的總RNA。利用SuperscriptⅡreverse transcriptase（Invitrogen）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。熒光定量試驗(yàn)使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（TaKaRa，大連）。高山松Actin作為miR482a和靶基因Unigenes45569的內(nèi)參基因。利用Rotor-Gene 3000型實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀檢測(cè)，每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)?；虻南鄬?duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法［11］，在根中的表達(dá)水平人為設(shè)成1。

2 結(jié)果與分析

2.1 pde-miR482a前體序列的擴(kuò)增及二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

從前期高山松miRNA高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中篩選得到高山松miR482a的前體序列，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，以高山松基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到高山松miR482a的前體序列長(zhǎng)為130 bp（圖1）。利用RNAfolder軟件在線分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)高山松miR482a的前體序列能形成典型的莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)（圖2），所預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的最小折疊自由能（Mini?mal folding free energy，MFE）為-60.90 kcal/mol，最小折疊自由能指數(shù)（Minimal folding free energy index，MFEI）是0.98。miR482a的 成 熟 序 列 為5′-UCUU UCCUACUCCUCCCAUUC-3′，22 bp，位于前體序列的3′端莖結(jié)構(gòu)上。

表1 RT-PCR、RT-qPCR和RLM-5′RACE的引物

2.2 高山松miR482a成熟序列和前體序列的分析

對(duì)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中不同植物的miR482a成熟序列與高山松miR482a（pde-miR482a）的成熟序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)除了葡萄vvi-miR482與pdemiR482a的成熟序列完全一致外，其他物種如歐洲云杉pab-miR482、人參pgi-miR482、火炬松ptamiR482a、毛 果楊ptc-miR482a、玉米zma-miR482a以及大豆gma-miR482a與高山松pde-miR482a的成熟序列有一個(gè)或多個(gè)堿基的差異（圖3），表明高山松pde-miR482a的成熟序列在不同物種中保守性不高。利用MEGA 7.0對(duì)毛果楊、玉米、人參、葡萄、火炬松、歐洲云杉、大豆、苜蓿和高山松的miR482共23個(gè)成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示不同物種的pre-miR482前體保守性不高（圖4），高山松與歐洲云杉的前體序列聚為一類，二者進(jìn)化關(guān)系較近。

2.3 高山松miR482a靶基因的預(yù)測(cè)及RLM-5′RACE驗(yàn)證

為了進(jìn)一步了解高山松pde-miR482a的生物學(xué)功能，研究以高山松的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)作為靶標(biāo)，使用在線軟件psRNATarget預(yù)測(cè)高山松miR482的靶基因，共預(yù)測(cè)到2個(gè)靶基因，分別為組蛋白去乙酰基酶（Unigenes7264）和NBS-LRR抗 性 蛋 白（Unigenes 45569），其中pde-miR482a與高山松NBS-LRR抗性蛋白（Unigenes45569）匹配程度最高（表2）。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證高山松miR482a對(duì)潛在靶基因是否有剪切作用，利用RLM-5′RACE方法對(duì)靶基因Unigenes45569mRNA的3′端剪切產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。測(cè)序結(jié)果表明，高山松pde-miR482a對(duì)NBS-LRR抗性蛋白的剪切位點(diǎn)位于第10、第11個(gè)堿基之間（圖5），表明NBS-LRR抗性蛋白（Unigenes45569）確實(shí)是miR482a的靶基因，miR482a可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控NBS-LRR抗性蛋白基因的表達(dá)。

表2 高山松miR482a靶基因及功能預(yù)測(cè)

2.4 高山松pde-miR482a及其靶基因Unigenes 45569在不同組織中的表達(dá)分析

通過qRT-PCR對(duì)pde-miR482a及其靶基因Unigenes45569在高山松根、莖和針葉中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)pde-miR482a和Unigenes45569在高山松不同組織的表達(dá)存在顯著差異，pde-miR482a在根中的表達(dá)量最高，其次在莖中，而靶基因Unige?nes45569在根中的表達(dá)量最低。靶基因Unige?nes45569的表達(dá)量與pde-miR482a的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（圖6）。

3 討論

近年來，高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展已在多個(gè)物種中被證實(shí)存在miR482。本研究對(duì)鑒定到的miR482前體基因Pre-miR482進(jìn)行克隆，得到miR482a的前體序列長(zhǎng)度為130 bp，可形成穩(wěn)定的莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，說明miR482a確實(shí)在高山松中存在并表達(dá)。采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)高山松pde-miR482a在根、莖和針葉中的表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在根、莖和針葉中均有表達(dá)，但在根中最高。Li等［8］研究發(fā)現(xiàn)miR482在大豆的種子、幼莢、根、莖、葉和花中也均有表達(dá)，但在莖中最高。miR482a在番茄的根、莖、葉中均有表達(dá)，但在葉中的表達(dá)最高［12］。高山松miR482a的靶基因Unigenes45569（NBS-LRR抗性蛋白）在根、莖和針葉中也有一定的表達(dá)，但在根中的表達(dá)最低，與pde-miR482a的表達(dá)模式呈負(fù)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)miRNA與靶基因之間的表達(dá)模式為負(fù)相關(guān)。過表達(dá)和沉默miR482b的番茄植株中，Jiang等［13］發(fā)現(xiàn)miR482b和其靶基因表達(dá)水平之間存在負(fù)相關(guān)性。這些研究結(jié)果表明，miR482靶向NBS-LRR抗性蛋白（Unigenes45569）可能參與了高山松生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控。

自從在毛果楊中發(fā)現(xiàn)第一個(gè)miR482以來［14］，研究者已從棉花［15］、馬鈴薯［6］、番茄［7］和豌豆［8］多個(gè)植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了miR482，并且在擬南芥、棉花和煙草等多種植物中證明miR482的靶基因是NBS-LRR基因［15］。而NBS-LRR編碼基因是抗病基因中的最大家族，在植物抵御非生物脅迫及病害防御過程中起著非常重要的作用［16］。棉花受黃萎病菌浸染時(shí)，miR482的表達(dá)下調(diào)，但其靶基因NBS-LRR抗性蛋白表達(dá)增加［15］。番茄miR482通過靶向NBS-LRR抗性蛋白在番茄病害的防御和發(fā)生中起著重要的調(diào)控作用［16］。本研究中，利用RLM-5′RACE方法對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因Unigenes45569（NBS-LRR抗性蛋白）進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，高山松miR482介導(dǎo)靶基因Unige?nes45569（NBS-LRR抗性蛋白）的mRNA剪切降解，且剪切位點(diǎn)在第10和第11位堿基之間。利用5′RACE方法，Zhu等［15］在棉花中發(fā)現(xiàn)NBS-LRR抗性蛋白是miR482的靶基因，切割位點(diǎn)也在第10和11位堿基之間。這些結(jié)果表明，miR482通過靶向NBS-LRR抗性蛋白（Unigenes45569），從而調(diào)控高山松的生長(zhǎng)發(fā)育及抗病性。