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        生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量評價(jià)及其指紋圖譜的建立*

        2021-10-09 04:23:58楊巧虹陳萍
        醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2021年10期
        關(guān)鍵詞:標(biāo)準(zhǔn)

        楊巧虹,陳萍

        (1.重慶醫(yī)療器械質(zhì)量檢驗(yàn)中心,重慶 401147;2.陜西省中醫(yī)藥研究院,西安 710003)

        生地黃為玄參科植物地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)的干燥塊根,味甘,性寒,歸心、肝、腎經(jīng),具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津的功效[1]。地黃分布廣泛,主產(chǎn)于河南、山西、河北、山東等地,為四大懷藥之一[2]。生地黃主要含有苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜苷類、糖類、氨基酸類等化合物[3]。藥理研究表明,生地黃具有止血、強(qiáng)心、降血糖、抗炎、提高免疫力、利尿、保肝等作用[4-5],臨床常用于治療腎陰不足、瘀血阻滯而引起的各種出血癥[6]。

        標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為一種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)體系,既有投料飲片的代表性,又有傳統(tǒng)制法和制備工藝的一致性,還有臨床療效和質(zhì)量的穩(wěn)定性,為衡量中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一致的參照物的標(biāo)準(zhǔn)[7]。關(guān)于生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及指紋圖譜研究筆者尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。筆者在本研究中收集到合格的生地黃飲片15批作為原料,依據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[8],制備生地黃飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑,對其中苯乙醇苷類成分進(jìn)行含量測定,并建立特征圖譜,為生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為衡量配方顆粒與臨床湯劑的一致性提供參考。

        1 儀器與試藥

        1.1儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);CP2102型百分之一天平(奧豪斯儀器<常州>有限公司);SQP型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器<北京>有限公司,感量:0.01 mg);ZDHW型調(diào)溫電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(北京科偉永興儀器有限公司);DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司);FZG-1400真空干燥箱(陜西昌泰實(shí)業(yè)有限公司);Synergy型超純水制水機(jī)(默瑞<上海>生物科技有限公司)。

        1.2試劑與試藥

        1.2.1試劑 乙腈(OCEANOAK公司,批號:30281-27409,色譜級);磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,批號:20170110,色譜級);甲醇(天津市天力化學(xué)試劑有限公司,批號:20200608,分析純);水為自制超純水。

        1.2.2試藥 毛蕊花糖苷對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:1530-200202,含量>98.0%);焦地黃苯乙醇苷A1對照品(批號:P16M11S109726,含量>95.0%)、焦地黃苯乙醇苷B1對照品(批號:P16M11S109727,含量>97.0%)、異毛蕊花糖苷對照品(批號:W17J10C90785,含量>98.0%),均購于上海源葉生物科技有限公司。18批生地黃飲片,經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院楊智峰研究員鑒定為玄參科植物地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)的干燥塊根,見表1。

        表1 生地黃飲片來源信息表

        2 方法與結(jié)果

        2.1生地黃飲片質(zhì)量考察 依據(jù)《中華人民共和國藥典》(2015年版一部)生地黃飲片項(xiàng)下的性狀、鑒別(顯微鑒別、薄層色譜鑒別)、檢查(水分、總灰分、酸不溶性灰分)、浸出物及含量測定檢查方法,對18批生地黃飲片進(jìn)行質(zhì)量考察,結(jié)果15批飲片的性狀、鑒別、檢查、浸出物、含量測定結(jié)果均符合2015年版《中華人民共和國藥典》要求,15批樣品均檢出地黃顯微特征。結(jié)果見圖1—圖3與表2。

        1.木栓細(xì)胞;2.分泌細(xì)胞;3.薄壁細(xì)胞;4.核狀物;5.導(dǎo)管;6.草酸鈣方晶。

        1.毛蕊花糖苷;2.生地黃對照藥材;3~17.1~15號生地黃藥材;18.生地黃對照藥材;19.毛蕊花糖苷。

        1.梓醇;2.生地黃對照藥材;3-10.1-8號生地黃藥材;11.梓醇;12.生地黃對照藥材;13-19.9-15號生地黃藥材。

        2.2生地黃飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備 依據(jù)國家中醫(yī)藥管理局《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》原則,稱取15批質(zhì)量合格的生地黃飲片各50 g,分別加8倍量的水,浸泡1 h,加熱回流提取0.5 h,趁熱濾過,分離出煎煮液后,藥渣加8倍量的水回流提取0.5 h,趁熱過濾,合并濾液,減壓濃縮至250 mL,即得1~15號生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑,備用。

        2.3生地黃飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑薄層色譜鑒別 取生地黃飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑5 mL,用水飽和的正丁醇振搖提取3次,每次10 mL,合并正丁醇液,蒸干,殘?jiān)蛹状? mL使溶解,作為供試品溶液。取毛蕊花糖苷對照品,加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液,作為對照品溶液。取水5 mL,按照供試品溶液制備方法制備成陰性對照溶液。吸取上述供試品溶液、陰性對照溶液各5 μL、對照品溶液2 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(16:0.5:2)為展開劑,展開,取出,晾干,用0.1%的2,2-二苯基-1-苦肼基無水乙醇溶液浸板,晾干。供試品色譜在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果見圖4。

        1.毛蕊花糖苷;2-16.1-15號生地黃藥材;17.毛蕊花糖苷。

        表2 15批生地黃飲片質(zhì)量考察結(jié)果

        取生地黃飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑10 mL,加甲醇20 mL,超聲10 min,濾過,濾液濃縮至5 mL,作為供試品溶液。取梓醇對照品,加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液,作為對照品溶液。取水10 mL,按照上述溶液制備方法制備成陰性對照溶液。吸取上述3種溶液各5 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-甲醇-水(14:6:1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以茴香醛試液,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),見圖5。

        1.梓醇;2-8.1-7號生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑;9.陰性;10-19.8-15號生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

        2.4生地黃飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征成分含量測定[9-13]

        2.4.1色譜條件 色譜柱:Diamonsil Plus C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫,洗脫程序見表3;流速:0.8 mL·min-1,檢測波長:334 nm,柱溫:25 ℃,進(jìn)樣量10 μL,理論板數(shù)按特征成分峰計(jì)算均不低于5 000。

        表3 梯度洗脫程序

        2.4.2溶液制備 對照品溶液:取適量的焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1及異毛蕊花糖苷對照品,精密稱定,加乙腈-0.1%磷酸溶液(16:84)制成每毫升分別含焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1及異毛蕊花糖苷95.00,108.80,53.00,45.36 μg的混合對照品溶液。

        供試品溶液:精密量取1~15號生地黃飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑10 mL,置50 mL量瓶中,分別加甲醇30 mL,超聲10 min,用甲醇稀釋至50 mL,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液20 mL,蒸干,殘?jiān)靡译?0.1%磷酸溶液(16:84)溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中,用乙腈-0.1%磷酸溶液(16:84)稀釋至刻度,搖勻,濾過,續(xù)濾液即為供試品溶液。

        陰性對照溶液:精密吸取水10 mL,按上述溶液制備方法制備,即得陰性對照溶液。

        2.4.3專屬性實(shí)驗(yàn) 精密吸取陰性對照溶液、對照品溶液及供試品溶液各10 μL,采用“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1及異毛蕊花糖苷的保留時(shí)間分別為34.611,45.044,48.525,52.131 min,分離度均>1.5,理論板數(shù)均>6 000,拖尾因子為1.03~1.31。陰性對照溶液色譜在相同保留時(shí)間處無干擾峰出現(xiàn),表明專屬性良好。見圖6。

        1.焦地黃苯乙醇苷A1;2.毛蕊花糖苷;3.焦地黃苯乙醇苷B1;4.異毛蕊花糖苷。

        2.4.4線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品溶液0.02,0.05,0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,0.60 mL,分別置1 mL量瓶中,用乙腈-0.1%磷酸溶液(16:84)稀釋至刻度,搖勻,制成系列混合對照品溶液,精密吸取10 μL,以“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄峰面積,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),線性回歸分析,結(jié)果見表4。

        表4 4種對照品的回歸方程及線性范圍

        2.4.5精密度實(shí)驗(yàn) 取混合對照品溶液和同一批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液(批號:20200101),按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果對照品溶液焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1及異毛蕊花糖苷峰面積的RSD為0.72%、0.56%、2.21%、3.47%,供試品溶液焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1及異毛蕊花糖苷峰面積的RSD為4.47%、0.56%、4.21%、3.46%,表明儀器的精密度良好。

        2.4.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號:20200101),按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件,分別在0,2,4,6,8,12,24,36 h時(shí)進(jìn)樣分析。結(jié)果焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1及異毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為3.95%、2.76%、4.63%及4.53%,表明供試品溶液在36 h內(nèi)室溫下穩(wěn)定性良好。

        2.4.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品(批號:20200101)10 mL,共6份,按“2.4.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1及異毛蕊花糖苷的平均含量分別為31.563 3,28.614 9,11.846 1,13.177 3 μg·mL-1,RSD值分別為4.08%、1.57%、4.57%及4.85%,表明該方法重復(fù)性良好。

        2.4.8加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的同一批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑(批號:20200101)5 mL,共9份,每3份為一組,置50 mL量瓶中,分別精密加入焦地黃苯乙醇苷A1對照品溶液(156.75 μg·mL-1)0.5,1.0及1.5 mL、毛蕊花糖苷對照品溶液(244.80 μg·mL-1)0.3,0.6及0.9 mL,焦地黃苯乙醇苷B1對照品溶液(148.4 μg·mL-1)0.2,0.4及0.6 mL,異毛蕊花糖苷對照品溶液(164.43 μg·mL-1)0.2,0.4及0.6 mL,按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測定,計(jì)算。結(jié)果見表5。

        表5 4種對照品的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        2.4.9含量測定 取15批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果見表6。

        2.5生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率及轉(zhuǎn)移率測定

        2.5.1出膏率計(jì)算 精密量取1~15號標(biāo)準(zhǔn)湯劑各20 mL,分別置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,水浴鍋上蒸干,殘?jiān)?05 ℃干燥3 h,干燥器中冷卻30 min,迅速精密稱定質(zhì)量,計(jì)算出膏率。出膏率(%)=m1/20×V/m2×100% (m1為干膏質(zhì)量、V為樣品溶液總體積、m2為飲片質(zhì)量)。結(jié)果見表6。生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑15批出膏率為54.97%~62.78%,平均值為(58.49±2.83)%。

        2.5.2苯乙醇苷類轉(zhuǎn)移率計(jì)算 轉(zhuǎn)移率(%)=標(biāo)準(zhǔn)湯劑中特征成分含量/飲片中特征成分含量×100%。結(jié)果見表6。15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑中苯乙醇苷類成分含量為0.034 9%~0.063 3%,平均值為(0.051±0.009)%,轉(zhuǎn)移率為58.17%~87.95%,平均(76.11±9.53)%。

        表6 15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑指標(biāo)成分含量及出膏率、轉(zhuǎn)移率計(jì)算結(jié)果

        2.6高效液相色譜特征指紋圖譜建立

        2.6.1色譜條件 同“2.4.1”項(xiàng)下的色譜條件。

        2.6.2溶液制備 采用“2.4.2”項(xiàng)下的混合對照品溶液和15批供試品溶液。

        2.6.3方法學(xué)考察 精密度實(shí)驗(yàn):取同一批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液(批號:20200101),按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,連續(xù)6次。2號色譜峰(毛蕊花糖苷)在生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備過程中相對較穩(wěn)定、含量高、分離度好,故被選作參照峰。以毛蕊花糖苷為參照,計(jì)算,共有峰相對峰面積和相對保留時(shí)間的RSD均小于5% (n=6),表明方法精密度良好。

        穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):精密吸取生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液(批號:20200101)適量,分別于0,2,4,8,12,16,24 h時(shí),按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。以毛蕊花糖苷為參照,計(jì)算,共有峰相對峰面積和相對保留時(shí)間的RSD均小于5%(n=7),表明供試品溶液在室溫中24 h內(nèi)較為穩(wěn)定[11]。

        重復(fù)性實(shí)驗(yàn):精密量取生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑適量,按“2.4.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以毛蕊花糖苷為參照,計(jì)算,共有峰相對峰面積和相對保留時(shí)間的RSD均小于5%(n=6),表明方法重復(fù)性良好。

        2.6.4指紋圖譜建立 取15批供試品溶液,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。經(jīng)分析,供試品溶液的液相色譜圖中2號峰毛蕊花糖苷峰面積最大且穩(wěn)定,分離度好,保留時(shí)間居中,易于辨認(rèn),故選為本品指紋圖譜參照峰,見圖7。

        1.焦地黃苯乙醇苷A1;2.毛蕊花糖苷;3.焦地黃苯乙醇苷B1;4.異毛蕊花糖苷。

        將15批供試品溶液液相色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012版)》,參照圖譜設(shè)為S1,對照圖譜生成方法設(shè)為平均數(shù),時(shí)間窗寬度設(shè)為0.10,多點(diǎn)校正,自動匹配,生成對照圖譜,分別計(jì)算相似度[11],并以2號毛蕊花糖苷為參照物,計(jì)算共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積,見表7、表8。圖8為15批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征指紋圖譜。由圖表可見,15批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對照指紋圖譜相似度均>0.96(表9)。表明一致性良好。

        表7 15批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有峰相對保留時(shí)間

        表8 15批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有峰相對峰面積

        表9 15批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度評價(jià)表

        圖8 生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑高效液相指紋圖譜

        3 討論

        3.1色譜條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)對地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑中4個(gè)苯乙醇苷類成分進(jìn)行考察,在預(yù)實(shí)驗(yàn)中對波長、流動相進(jìn)行考察。波長選擇參考《中華人民共和國藥典》2015年一部地黃項(xiàng)下毛蕊花糖苷含量測定選用的檢測波長334 nm;比較乙腈-0.1%醋酸溶液與乙腈-0.1%磷酸溶液兩種流動相,發(fā)現(xiàn)選擇乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相時(shí)基線更平穩(wěn),峰形較好,特征成分分離效果好。

        3.2定性鑒別成分篩選 參照《中華人民共和國藥典》2015年一部和2020年一部中地黃藥材項(xiàng)下選用梓醇與毛蕊花糖苷兩個(gè)指標(biāo)成分作為薄層鑒別,且兩種指標(biāo)成分也作為含量測定,但地黃苷D成分未見相關(guān)研究用于薄層鑒別,故選用這兩種成分作為薄層鑒別指標(biāo)成分。

        3.3特征成分篩選 由于毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷屬于同分異構(gòu)體,飲片在煎煮過程中毛蕊花糖苷可能會部分轉(zhuǎn)化為異毛蕊花糖苷[14-16],實(shí)驗(yàn)以4種苯乙醇苷類(焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1和異毛蕊花糖苷)總量來表征提取物的含量,可以達(dá)到質(zhì)量均一性,生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑中焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1及異毛蕊花糖苷提取率高、轉(zhuǎn)移率穩(wěn)定,故采用4個(gè)成分共同作為質(zhì)量評價(jià)的定量特征成分。

        3.4標(biāo)準(zhǔn)湯劑pH、密度的測量 實(shí)驗(yàn)測定了15批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的pH值均為4.5、密度范圍為1.042~1.054,可以作為質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。

        3.5量值傳遞與質(zhì)量評價(jià) 經(jīng)過研究從投料飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量控制,再到標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜3個(gè)方面進(jìn)行研究,建立生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的苯乙醇苷類含量測定方法和特征指紋圖譜,實(shí)現(xiàn)對生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量評價(jià)。結(jié)果表明,15批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的平均出膏率為(58.49±2.83)%,苯乙醇苷類成分平均含量為(0.051±0.009)%;按研究建立的15批生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑各參數(shù)均值的75%~125%計(jì),其參數(shù)范圍確定為:出膏率43.86%~73.11%,苯乙醇苷類含量0.037%~0.063%,平均出膏率、苯乙醇苷類平均含量均在參數(shù)范圍內(nèi),表明生地黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量均一性較好。

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