張繼波,龍利,覃慧群,金晟,余建峰,徐敏,劉浩
(湖北省第三人民醫(yī)院腎病內(nèi)科,武漢 430033)
高尿酸血癥是引起慢性腎臟疾病的獨立危險因素,并可導致腎臟纖維化。過氧化物酶增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators-activated receptors-γ,PPAR-γ)與配體結(jié)合激活后,主要通過調(diào)節(jié)靶基因的表達產(chǎn)生生物效應,包括抑制促炎性遞質(zhì)[如白細胞介素-6(IL-6)、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)]表達,改善炎癥狀態(tài)[1],降低轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)和單核巨噬細胞因子-1(monocyte chemoattractant protein 1,MCP-1)表達,起到抗腎間質(zhì)纖維化作用[2-3]。單鈉尿酸鹽刺激腎小管上皮細胞可以誘導HK-2細胞產(chǎn)生氧化應激反應[4]、自噬表達增加[5],甚至隨著尿酸鹽濃度增加,HK-2細胞增殖能力下降,導致小管細胞凋亡[6]。血管緊張素Ⅱ可下調(diào)PPAR-γ表達[7],替米沙坦具有激活PPAR-γ受體的作用[8],通過提高血清、腎組織中PPAR-γmRNA表達而降低肥胖大鼠尿白蛋白,有腎保護作用[9]。陳艷梅等[10]通過對大鼠腎組織及HK-2細胞培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn),調(diào)節(jié)人生電型尿酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白(human electric urate transporter,hUAT)表達,替米沙坦能抑制腎小管上皮細胞TGF-β1及α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表達,對尿酸性腎病腎臟纖維化有一定的保護作用。這種保護作用是否是通過PPAR途徑產(chǎn)生,目前筆者尚未見類似報道,本研究主要通過PPAR途徑研究替米沙坦對尿酸鹽刺激下HK-2腎小管上皮細胞的干預機制,探討替米沙坦對尿酸性腎病腎保護作用。
1.1材料
1.1.1實驗細胞 HK-2人腎小管上皮細胞,購自中國科學院細胞庫(中國上海)。
1.1.2試劑 胎牛血清(FBS,批號:567216)購于GIBCO公司;0.25%胰酶+0.02%乙二胺四醋酸(EDTA)(批號:160526061)、青霉素-鏈霉素(批號:659R063)購于北京索萊寶科技有限公司;PPAR-γ阻斷劑GW9662(批號:062R1598T)、尿酸(批號:STBC0603V)購于美國Sigma公司;TrizolRNA提取試劑(批號:156987)購于美國Invitrogen公司;TaqTMⅡPCR試劑盒(批號:AE265988)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號:AC32659C)購于TaKaRa公司;引物購于上海生工生物工程有限公司;羅格列酮片(規(guī)格:每片1 mg,批準文號:國藥準字H20041422),成都恒瑞制藥有限公司;替米沙坦片(規(guī)格:每片40 mg,批準文號:國藥準字J20180016),Boehringer Ingelhein Ellas A.E。
1.1.3儀器 二氧化碳(CO2)細胞培養(yǎng)箱購置于美國Thermo公司;超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司);CK-TKc-3倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS);酶聯(lián)免疫檢測儀(芬蘭Thermol Labsystems);高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司);低速離心機(上海醫(yī)療儀器廠);磁力攪拌器(蘇州國華儀器廠);電子分析天平(梅特勒-托利多儀器公司);微量移液器(德國Appendorf公司);流式細胞儀(美國BD亞洲有限公司);紫外分光光度計(美國Thermo公司);自動壓力蒸汽滅菌器(廈門致微儀器有限公司);CFX96TM實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)。
1.2細胞處理與分組 在培養(yǎng)條件為37 ℃,5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)HK-2細胞,選第3~5代細胞,取同步處于G0期的細胞,隨機分為7組,分別為對照組(培養(yǎng)基,NC組)、模型組[尿酸(600 μmol·L-1),UM組]、高尿酸+替米沙坦組[尿酸(600 μmol·L-1)+替米沙坦(10 μmol·L-1),UT組]、高尿酸+羅格列酮組[尿酸(600 μmol·L-1)+羅格列酮(10 μmol·L-1),UR組]、高尿酸+GW9662組[預先用5000 nmol·L-1PPAR-γ阻斷劑GW9662 處理30 min,再加入尿酸 (600 μmol·L-1),UG組]、高尿酸+替米沙坦+GW9662組[預先用5000 nmol·L-1PPAR-γ阻斷劑GW9662 處理30 min,再加入尿酸(600 μmol·L-1)+替米沙坦(10 μmol·L-1),UTG組]和高尿酸+羅格列酮+GW9662組[預先用5000 nmol·L-1PPAR-γ阻斷劑GW9662 處理30 min,再加入尿酸(600 μmol·L-1)+羅格列酮(10 μmol·L-1),URG組]。各組刺激培養(yǎng)48 h后,細胞融合90%~95%。
1.3觀察指標與檢測方法
1.3.1流式細胞儀檢測HK-2細胞hUAT、PPAR-γ蛋白表達 終止培養(yǎng)后收集細胞(1×106)。離心,洗滌,棄上清液,加1:100稀釋的鼠抗人hUAT、PPAR-γ蛋白單克隆抗體100 μL;37 ℃水浴,離心,棄上清液,加1:20稀釋的羊抗鼠IgG-FITC 100 μL,水浴,離心洗滌,去上清液,除去未結(jié)合熒光抗體,調(diào)整細胞數(shù)為1×106·L-1,上機(FACSCalibur ,BD)檢測。實驗設正常對照:用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替1:100稀釋的鼠抗人hUAT、PPAR-γ 單抗。陰性對照:只加1:100稀釋的鼠抗人hUAT、PPAR-γ單抗而不加IgG-FITC抗體的陰性對照。結(jié)果以陽性細胞率表示。
1.3.2流式細胞儀檢測HK-2細胞凋亡情況 終止培養(yǎng),將培養(yǎng)基吸出,用PBS清洗,0.25%胰蛋白酶消化,收集細胞(1×106)。離心,棄上清液,用70%冰乙醇沉淀,4 ℃懸浮固定24 h。固定細胞經(jīng)碘化丙啶綜合染料(PI、Rnase、Triton X-100)一步法染色30 min后,300目尼龍篩網(wǎng)濾過,上流式細胞儀檢測,檢測DNA含量,計數(shù)在G1峰前出現(xiàn)的DNA含量下降的亞二倍體峰的細胞數(shù),計算出細胞凋亡率。
1.3.3Q-PCR法檢測HK-2細胞hUAT、PPAR-γ、COX-2、MCP-1、TGF-β1的表達情況 Trizol法提取總RNA:RNA溶液在-80 ℃條件下保存。取RNA溶液1 μL,用紫外分光光度法于波長260 nm和280 nm處測定吸光度(A值),A260/A280比值在1.8~2.0。逆轉(zhuǎn)錄cDNA:合成后cDNA在-20 ℃或更低溫度下保存。熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)反應:通過GenBank查找hUAT、PPAR-γ、COX-2、MCP-1、TGF-β1序列,選取GAPDH作為內(nèi)參。應用CFX96TM實時熒光定量PCR儀,進行熒光定量PCR。每個樣品設2個復孔,取平均擴增循環(huán)次數(shù)Ct值。以內(nèi)參GAPDH為對照,計算相對定量ΔCt值。以對照組為對照,計算相對定量ΔΔCt值。采用相對定量2-ΔΔCt法比較三個基因的mRNA的表達差異。2-ΔΔCt代表實驗組目的基因相對于對照組的變化倍數(shù)。ΔΔCt值=實驗組(目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)-對照組(目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)。熒光定量PCR擴增基因引物序列,hUAT(NM_001001290.2):上游(5′→3′)GACTTCCTAGTGGGTGTGAA,下游(5′→3′)AATGT-CATTTCCACTGAAGC,產(chǎn)物長度225 bp;PPAR-γ(NM_001127330.2):上游(5′→3′)AGCCAACACTAAACCACA,下游(5′→3′)AGAAACCCTTGCATCCT,產(chǎn)物長度337 bp;COX-2(NM_001124348):上游(5′→3′)TGAAA-CCCACTCCAAACACA,下游(5′→3′)TGGAACA-ACTGCTCATCACC,產(chǎn)物長度301 bp;MCP-1(NM_011333.3):上游(5′→3′)AGCAGCAAGTGTCCCAAAGA,下游(5′→3′)GGTGGTCCATGGAATCCTGA,產(chǎn)物長度103 bp;TGF-β1(NM_011577.2):上游(5′→3′)AGCG-ACTCGCCAGAGTGGTTA,下游(5′→3′)GCAGT-GTGTTATCCCTGCTGTCA,產(chǎn)物長度130 bp;GAPDH(NM_001289726.1):上游(5′→3′)CCTTCCG-TGTTCCTAC,下游(5′→3′)GACAACCTGGTCCTCA,產(chǎn)物長度152 bp。
1.3.4Western blotting檢測正常及高尿酸條件下HK-2上hUAT、PPAR-γ 、COX-2、MCP-1、TGF-β1的表達 取出相應的實驗處理組的培養(yǎng)瓶,棄培養(yǎng)液,用預冷的PBS沖洗2次,按照6孔,板每孔加入裂解液100~200 μL(6 cm培養(yǎng)皿200~300 μL)。充分裂解,取上清液,進行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80 ℃冰箱。全自動化學發(fā)光分析儀中檢測,通過TANONGIS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。
2.1各組HK-2細胞hUAT、PPAR-γ蛋白表達 通過流式細胞儀檢測hUAT、PPAR-γ蛋白表達(以陽性細胞率表示),PPAR-γ抑制劑聯(lián)合替米沙坦、羅格列酮干預,陽性細胞率上升(P<0.05),較單用替米沙坦、羅格列酮比例下降(P<0.05),提示替米沙坦無法逆轉(zhuǎn)PPAR-γ抑制后陽性細胞率減少,替米沙坦有激活PPAR-γ受體作用。見表1。
表1 7組HK-2細胞hUAT、PPAR-γ蛋白陽性細胞率
2.2各組HK-2細胞的凋亡 應用PPAR-γ抑制劑后聯(lián)合替米沙坦、羅格列酮,凋亡率下降明顯(P<0.05),與單用替米沙坦、羅格列酮比較,凋亡率下降減弱(P<0.05),提示替米沙坦無法逆轉(zhuǎn)PPAR-γ抑制后所致的凋亡率明顯上升。見表2。
表2 7組HK-2細胞凋亡情況
2.3HK-2細胞hUAT、PPAR-γ、COX-2、MCP-1、TGF-β1的表達 應用PPAR-γ抑制劑聯(lián)合羅格列酮及替米沙坦,hUAT、PPAR-γmRNA表達增加(P<0.05),COX-2、MCP-1、TGF-β1mRNA表達減少,但差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05),與單用替米沙坦、羅格列酮比較,hUAT、PPAR-γ表達減少,COX-2、MCP-1、TGF-β1mRNA表達增加(均P<0.05)。提示替米沙坦無法逆轉(zhuǎn)PPAR-γ抑制后所致的hUAT、PPAR-γ表達減少,COX-2、MCP-1、TGF-β1mRNA表達增加。見表3。
表3 7組HK-2細胞hUAT、PPAR-γ、COX-2、MCP-1、TGF-β1 mRNA的表達
Tab.3 HUAT,PPAR-γ,COX-2,MCP-1 and TGF-β1 mRNA levels in seven groups of HK-2 cells
表3 7組HK-2細胞hUAT、PPAR-γ、COX-2、MCP-1、TGF-β1 mRNA的表達
組別hUATPPAR-γCOX-2MCP-1TGF-β1NC組1.00±0.071.00±0.191.00±0.371.00±0.131.00±0.07UM組0.19±0.25①0.17±0.02①3.65±0.9①4.07±0.55①5.35±0.33①UT組0.46±0.01②0.53±0.1②1.82±0.69②2.24±0.45②2.16±1.18②UR組0.46±0.04②0.83±0.13②1.47±0.31②2.51±0.67②1.99±0.67②UG組0.06±0.04①0.25±0.02①3.07±0.93①3.32±0.92①4.57±0.11①UTG組0.31±0.26③⑤0.5±0.02③⑤2.76±0.58③⑤3.2±0.71③⑤3.72±0.64③⑤URG組0.29±0.09④⑤0.38±0.05④⑤2.96±0.43④⑤3.04±0.89④⑤3.09±0.78④⑤F328.33659.3127.6576.69416.056P0.0000.0000.0010.0020.000
①與NC組比較,hUAT:t=-53.525,-421.549;PPAR-γ:t=-56.895,-62.681,COX-2:t=5.235,4.012,MCP-1:t=9.772,4.508,TGF-β1:t=22.846,56.010,P<0.05;②與UM組比較,hUAT:t=10.541,10.548;PPAR-γ:t=7.856,10.583,COX-2:t=-5.139,-5.412,MCP-1:t=-3.167,-5.706,TGF-β1:t=-5.726,-11.917,P<0.05;③與UT組比較,hUAT:t=-5.102;PPAR-γ:t=-3.562,COX-2:t=3.327,MCP-1:t=1.579,TGF-β1:t=4.120,P<0.05;④與UR組比較,hUAT:t=-66.732;PPAR-γ:t=-9.097,COX-2:t=7.431,MCP-1:t=3.036,TGF-β1:t=3.20,P<0.05;⑤與UG組比較,hUAT:t=8.513,16.234;PPAR-γ:t=13.650,7.184,COX-2:t=-3.720,-3.025,MCP-1:t=-3.106,-12.657,TGF-β1:t=-2.275,-3.325,P<0.05。
①Compared with NC group,hUAT:t=-53.525,-421.549;PPAR-γ:t=-56.895,-62.681,COX-2:t=5.235,4.012,MCP-1:t=9.772,4.508,TGF-β1:t=22.846,56.010,P<0.05;②Compared with UM group,hUAT:t=10.541,10.548;PPAR-γ:t=7.856,10.583.COX-2:t=-5.139,-5.412,MCP-1:t=-3.167,-5.706,TGF-β1:t=-5.726,-11.917,P<0.05;③Compared with UT group,hUAT:t=-5.102;PPAR-γ:t=-3.562,COX-2:t=3.327,MCP-1:t=1.579,TGF-β1:t=4.120,P<0.05;④Compared with UR group ,hUAT:t=-66.732;PPAR-γ:t=-9.097,COX-2:t=7.431,MCP-1:t=3.036,TGF-β1:t=3.20,P<0.05.⑤Compared with UG group,hUAT:t=8.513,16.234;PPAR-γ:t=13.650,7.184,COX-2:t=-3.720,-3.025,MCP-1:t=-3.106,-12.657,TGF-β1:t=-2.275,-3.325,P<0.05.
2.4HK-2 hUAT、PPAR-γ 、COX-2、MCP-1、TGF-β1蛋白表達 應用PPAR-γ抑制劑聯(lián)合羅格列酮及替米沙坦發(fā)現(xiàn),hUAT、PPAR-γ蛋白表達增加(P<0.05),COX-2、MCP-1、TGF-β1蛋白表達減少(P<0.05);與單用替米沙坦、羅格列酮比較,hUAT、PPAR-γ蛋白相對表達減少,COX-2、MCP-1、TGF-β1蛋白相對表達增加(P<0.05)。提示替米沙坦無法逆轉(zhuǎn)PPAR-γ抑制后所致hUAT、PPAR-γ蛋白表達減少,COX-2、MCP-1、TGF-β1蛋白表達增加。見圖1。
1.NC組;2.UM組;3.UT組;4.UR組;5.UG組;6.UTG組;7.URG組。①與NC組比較,P<0.05;②與UM組比較,P<0.05;③與UT組比較,P<0.05;④與UR組比較,P<0.05;⑤與UG組,P<0.05。
3.1尿酸性腎病腎間質(zhì)纖維化的病理生理機制 尿酸鹽刺激腎小管上皮細胞可以通過多種途徑介導腎間質(zhì)纖維化,如上皮細胞轉(zhuǎn)分化[11-13]、自噬[5]、腎小管細胞凋亡[14]等,其中氧化應激反應[4]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[12]為主要誘導機制。此外,尿酸鹽可破壞腎小管上皮細胞緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及分布異常,導致腎小管損傷[15]。TGF-β1是致纖維化因子,通過上調(diào)MCP-1,腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-1β等的表達[16],誘導氧化應激反應,影響小管細胞轉(zhuǎn)分化[17-18],抑制氧化應激,可以減少細胞凋亡[19-20]。COX-2主要產(chǎn)生部位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜,影響前列腺素的分泌,參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,產(chǎn)生級聯(lián)炎癥反應[21],減少炎癥及氧化損傷能抑制HK-2細胞凋亡[22-23]。本研究通過單鈉鹽刺激腎小管上皮細胞模型發(fā)現(xiàn),與正常HK-2細胞比較,模型組細胞凋亡率上升,TGF-β1、COX-2及MCP-1mRNA、蛋白表達明顯增強,提示存在腎間質(zhì)纖維化改變依據(jù)。
3.2PPAR-γ表達、病理生理學意義及羅格列酮干預機制 PPAR-γ屬II型核受體超家族,與配基(或配體)結(jié)合后調(diào)節(jié)相應基因的轉(zhuǎn)錄。生理情況下,集合管強表達,間質(zhì)細胞、腎小球內(nèi)皮細胞和系膜細胞弱表達[24]。腎小管上皮細胞PPAR-γ表達活性降低,TGF-β1表達上調(diào)誘導氧化應激反應[25-26],介導細胞凋亡[27],上調(diào)腎組織中PPAR-γ的表達,降低MMP-9和TGF-β1水平,可以起到抗腎間質(zhì)纖維化的作用[28-30]。此外,激活PPAR-γ受體,可抑制促炎性遞質(zhì)(如IL-6、COX-2、MCP-1)的表達[1,31]。羅格列酮作為PPAR-γ受體激活劑,通過抑制過度的腎臟局部炎癥因子MCP-1分泌、抑制TLR/NF-KB信號通路激活、下調(diào)趨化因子表達[32-33],上調(diào)腎組織中PPAR-γmRNA及蛋白表達,發(fā)揮腎臟保護作用[16,34]。本研究也觀察到UM組PPAR-γmRNA及蛋白表達明顯低于UT組,通過羅格列酮干預后,PPAR-γmRNA及蛋白表達上調(diào),而應用PPAR-γ抑制劑后聯(lián)合羅格列酮治療,比較單用羅格列酮,PPAR-γmRNA及蛋白表達上調(diào)仍然偏低,提示單鈉鹽刺激HK-2細胞能下調(diào)PPAR-γmRNA及蛋白表達,羅格列酮具有激活PPAR-γ受體作用。本項目是基于PPAR-γ受體通路進行研究,而羅格列酮具有明確PPAR-γ受體激活作用,因此,選擇羅格列酮干預治療作為陽性對照進行觀察,如能證明替米沙坦有相似或優(yōu)于羅格列酮的作用,則能進一步證實替米沙坦具有PPAR-γ受體激活機制。
3.3替米沙坦干預尿酸性腎病PPAR-γ表達立項依據(jù) 血管緊張素能下調(diào)PPAR-γ表達,血管緊張素受體拮抗劑(angiotensin receptor blockers,ARB)能抑制這種作用[7],而且可以減輕HK-2細胞的凋亡和自噬[35]。早有研究表明,替米沙坦能夠部分激活PPAR-γ受體[36],這種作用不依賴血管緊張素II受體阻滯作用,臨床及實驗研究發(fā)現(xiàn)能上調(diào)組織中PPAR-γmRNA及蛋白表達,對心梗后心力衰竭、肥胖相關(guān)腎病及5/6腎切除大鼠有保護作用[9,37-38]。在尿酸性腎病研究中,可以預防或恢復尿酸所致NADPH氧化酶/ERK1/2/ET-1途徑的腎小管損傷,并作為尿酸誘導腎纖維化的有前途的治療藥物試驗證據(jù)[39]。陳艷梅等[10]通過動物及細胞研究發(fā)現(xiàn),替米沙坦可以調(diào)節(jié)hUAT蛋白表達,發(fā)揮腎臟保護作用。但替米沙坦這種降尿酸、腎臟保護作用是否是通過PPAR-γ途徑來實現(xiàn),其具體機制如何?筆者目前還沒有見到相關(guān)報道,因此展開此項目研究,進一步完善替米沙坦對尿酸性腎病的腎臟保護機制。
3.4項目研究的意義 本研究建立尿酸鹽刺激腎小管上皮細胞模型發(fā)現(xiàn),腎小管上皮細胞表達PPAR-γ減少,羅格列酮、替米沙坦均能上調(diào)PPAR-γ表達,抑制PPAR-γ受體后給予羅格列酮、替米沙坦干預,并不能逆轉(zhuǎn)PPAR-γ減少,因此論證替米沙坦具有羅格列酮相似激活PPAR-γ受體作用。進一步對TGF-β1、MCP-1、COX-2、hUAT蛋白表達及凋亡率研究發(fā)現(xiàn),替米沙坦不能逆轉(zhuǎn)PPAR-γ受體抑制后TGF-β1、MCP-1、COX-2表達及凋亡率上升,不能使hUAT蛋白表達的減少。因此得出結(jié)論,替米沙坦具有類似羅格列酮激活PPAR-γ受體機制,可能通過PPAR-γ途徑調(diào)節(jié)腎小管細胞凋亡、減少氧化應激及改善間質(zhì)纖維化而起到腎臟保護作用。