楊曉，黃仁燕，李文惠，樊煒靜，徐烽，閆少慶，柳國(guó)斌

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中醫(yī)血管外科，上海 201203)

下肢靜脈性潰瘍(venous leg ulcer，VLUs)是下肢小腿潰瘍中最常見(jiàn)的一種疾病，是繼發(fā)于下肢慢性靜脈功能不全晚期最嚴(yán)重和難治的并發(fā)癥，常經(jīng)久不愈[1]，其發(fā)病率高，愈合慢且易復(fù)發(fā)[2]，隨著年齡的增加發(fā)病率和患病率逐漸升高[3]。VLUs的愈合是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，需要大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、血管再生形成肉芽組織、成纖維細(xì)胞遷移、纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞、膠原沉積 、表皮再生。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)是組織損傷修復(fù)與纖維化過(guò)程中關(guān)鍵的誘導(dǎo)因子。有效的細(xì)胞因子對(duì)于瘡面愈合至關(guān)重要[4]。紫朱軟膏是奚九一教授以“補(bǔ)虛祛瘀生肌法”為原則研制的外用藥物，具有清熱解毒、祛腐生肌、補(bǔ)氣益血之功效。紫朱軟膏組成藥物與TGF-β1/Smad3信號(hào)通路關(guān)系已有相關(guān)的研究[5]，筆者在本研究主要研究紫朱軟膏與TGF-β1/Smads信號(hào)通路的關(guān)系，通過(guò)檢測(cè) TGF-β/Smads 信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，初步探討此通路在VLUs愈合過(guò)程中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年新西蘭雄性大白兔，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2009-0069。飼養(yǎng)環(huán)境： 室溫為(23±2)℃，相對(duì)濕度為(56±10)%。以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料飼養(yǎng)，動(dòng)物自由攝食及飲水。

1.2試藥 外用重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(商品名：貝復(fù)濟(jì)，rb-bFGF，珠海億勝生物制藥公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字 S10980077)；α-SMA抗體(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：A2547)，PCNA抗體(美國(guó)Novus Biologicals公司，貨號(hào)：NB500-106)，TGF-β1抗體(美國(guó)R&D Systems公司，貨號(hào)：MAB240-100)，p-Smad2、p-Smad3(廣州智造軟件科技有限公司，貨號(hào)：9520s)，Smad7(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：AV32008)。

1.3儀器 光學(xué)顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：BK-FL21)，熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：ChemiQ4600)，數(shù)碼相機(jī)(日本Canon公司，型號(hào)：5D Mark Ⅲ)，酶標(biāo)儀(THERMO公司，型號(hào)：MK3)。

1.4紫朱軟膏制備方法

1.4.1紫朱軟膏藥物組成及配比 根據(jù)紫朱軟膏100 kg處方量，主要藥材：朱砂3.5 kg，紫草1.5 kg，龍血竭3 kg，黃芪1.5 kg，阿膠2.5 kg，冰片0.5 kg；輔料：白凡士林47.25 kg，羊毛脂15 kg，泊洛沙姆188為12 kg，聚乙二醇4000為0.5 kg，1，2-丙二醇2.5 kg，單硬脂酸甘油酯5.25 kg，對(duì)羥基苯甲酸乙酯0.03 kg，水5 kg。

1.4.2特殊藥材前處理 朱砂采用200目(內(nèi)徑0.075 mm)水飛朱砂工業(yè)化成品；阿膠以電動(dòng)粉碎機(jī)粉碎為內(nèi)徑0.250 mm(60目)粉末；紫草、冰片為有效成分熱不穩(wěn)定藥材，采用氣流粉碎方式處理；黃芪纖維性較強(qiáng)，先以8倍量75%乙醇提純2次，再將醇提后藥渣以6倍量水提取3次，得到醇提取和水提取浸膏；龍血竭制備成固體分散體以改善其在輔料中的分散性。

1.4.3軟膏制劑的制備工藝方法 將上述處理好藥材與水溶性基質(zhì)按照優(yōu)化的工藝流程混勻，制成軟膏制劑。具體通過(guò)下述步驟制備：①龍血竭固體分散體的制備：龍血竭用適量90%～95%乙醇溶解完全，加入80～85 ℃熔融的泊洛沙姆188中，攪拌均勻，揮去95%乙醇，得到龍血竭固體分散物。②黃芪提取物用適量純水混勻，阿膠加純水，55～60 ℃下烊化，形成阿膠水溶液；并將上述兩種水溶液混合均勻后加入到熔融的泊洛沙姆407中，持續(xù)攪拌均勻；另在不超過(guò)40 ℃下將冰片溶解在丙三醇中，加入到上述混合物，攪拌均勻后，再加入聚乙二醇400、聚乙二醇1500及聚乙二醇4000，混合均勻后將其加入到龍血竭的固體分散物中，持續(xù)攪拌均勻冷卻至室溫。③將朱砂細(xì)粉、紫草細(xì)粉加入，并加入對(duì)羥基苯甲酸乙酯，持續(xù)攪拌使其分散均勻即得。將制成的紫朱軟膏加熱溶解，制成紫朱軟膏紗布，每日用無(wú)菌剪刀剪成與瘡面大小一致的形狀，消毒后備用。紫朱軟膏主藥與基質(zhì)的比例為1：8，1 g藥膏的生藥質(zhì)量是0.11 g。

1.5動(dòng)物分組 42只新西蘭雄性大白兔按照隨機(jī)數(shù)字表法分為7組，每組各6只：VLUs+紫朱軟膏低劑量組(a1組)、VLUs+紫朱軟膏中劑量組(a2組)、VLUs+紫朱軟膏高劑量組(a3組)、VLUs+生長(zhǎng)因子組(b組)、VLUs模型組(c組)、一般潰瘍組(d組)、VLUs+基質(zhì)組(e組)。

1.6動(dòng)物模型的制備 除d組外，其他動(dòng)物制備VLUs模型。VLUs模型由靜脈高壓聯(lián)合潰瘍模型的方法建立，方法如下。①靜脈高壓模型：采用下肢深靜脈血栓模型術(shù)建立。大白兔腹腔注射3%戊巴比妥鈉 1 mL·kg-1麻醉，仰臥位，四肢固定，雙側(cè)腹股溝區(qū)備皮。左側(cè)腹股溝區(qū)切口，分離皮下組織和淺筋膜等，分離股動(dòng)脈、股靜脈，分離并暴露髂-股靜脈約1.0 cm。在其近、遠(yuǎn)心端用兔動(dòng)脈夾夾閉此靜脈，然后用無(wú)齒小蚊式鉗夾閉血管，時(shí)間持續(xù)2～3 s。松開(kāi)蚊式鉗并進(jìn)行縫合，局部皮膚常規(guī)消毒。手術(shù)后24 h，將放置的動(dòng)脈夾取出?？晌湛p線逐層縫合皮下組織層和皮膚。②一般潰瘍模型采用潰瘍模型建立方法。在兔小腿脛前距離足尖6 cm處，定為中心點(diǎn)，備皮3 cm區(qū)域，再以中心點(diǎn)為圓心，用龍膽紫溶液做直徑 1.5 cm 圓形標(biāo)記。在圓形標(biāo)記處做一“十“字形切口，準(zhǔn)備一個(gè)鐵氧體磁鐵(直徑15 mm，厚5 mm)植入皮膚下切口。接下來(lái)，用另一個(gè)磁鐵夾住切割皮膚。用棉花和紗布綁扎，膠布固定，1周之后，兩個(gè)磁鐵被移除，夾皮自然脫落，產(chǎn)生潰瘍。用組織剪修剪整齊。

1.7給藥方法 a1，a2，a3組：用紫朱軟膏藥物均勻涂抹于創(chuàng)面，分別用1，2，3層紫朱軟膏紗布，約2，4，6 g·(cm2)-1。 b組：用rb-bFGF噴灑于瘡面，每次噴3次，約100 U·(cm2)-1。c、d組未給予藥物，每次用兩層紗布覆蓋換藥。e組：基質(zhì)用凡士林，制作方法同紫朱軟膏，制成凡士林紗布，紗布與瘡面大小一致，每次用兩層紗布覆蓋。

1.8瘡面愈合時(shí)間觀察 觀察各組瘡面大小、顏色、分泌物、肉芽組織情況及創(chuàng)面隨時(shí)間推移的變化。以創(chuàng)面完全上皮化為標(biāo)準(zhǔn)，比較各組大白兔創(chuàng)面面積變化情況。采用數(shù)碼照相機(jī)聯(lián)合醫(yī)學(xué)圖像分析軟件計(jì)算，使用數(shù)碼相機(jī)采集的圖片導(dǎo)入計(jì)算機(jī)，選出最清晰圖片，應(yīng)用 Image J-ijl33-jdk15計(jì)算，潰瘍創(chuàng)面愈合率(%)=(初始面積-觀察時(shí)間點(diǎn)面積)/初始面積×100%。

1.9愈合評(píng)價(jià) 采取 3 級(jí)愈合評(píng)價(jià)法，分為完全愈合、部分愈合和不愈合。完全愈合為潰瘍面完全愈合；部分愈合為潰瘍面愈合>50%；不愈合為潰瘍面愈合<50%。

1.10蘇木精-伊紅(HE)染色實(shí)驗(yàn) 將新西蘭大白兔在造模成功后第1，7，21天在皮損長(zhǎng)徑邊緣取材，將組織塊用10%甲醛溶液固定，乙醇脫水、石蠟包埋、制作病理切片，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組瘡面組織病理學(xué)變化。

1.11TGF-β1/smads 信號(hào)通路及下游調(diào)控基因關(guān)鍵蛋白檢測(cè) 采用免疫印跡(Western blotting)技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)。觀察這些調(diào)控基因表達(dá)關(guān)鍵蛋白(TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad7、α-SMA)在創(chuàng)面組織修復(fù)過(guò)程中的分布特點(diǎn)。使用β- actin) 作內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1瘡面愈合評(píng)價(jià) 7組大白兔瘡面愈合情況及創(chuàng)面愈合率對(duì)比，第7天，a2、a3 組大白兔瘡面干燥，可見(jiàn)大片鮮紅色肉芽組織形成；b組、a1組大白兔瘡面輕微水腫，可見(jiàn)散在粉紅色顆粒狀肉芽組織形成；c組大白兔瘡面仍嚴(yán)重水腫、污穢模糊，無(wú)肉芽組織形成；d組、e組大白兔瘡面輕微水腫，肉芽色暗淡，周邊角化明顯。 第21天，a2、a3組大白兔瘡面完全愈合；b、a1組大白兔瘡面面積減少，基本愈合；c組大白兔瘡面少量結(jié)痂，部分假性愈合。d、e組瘡面周邊可見(jiàn)少量上皮生長(zhǎng)，瘡面面積減少，見(jiàn)表1。

表1 7組大白兔瘡面愈合率比較

2.2組織病理學(xué)變化 不同時(shí)間VLUs模型變化見(jiàn)圖1。第1天，炎細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)，組織水腫明顯，紅細(xì)胞明顯，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松；第7天，組織水腫開(kāi)始消退，炎細(xì)胞減少，結(jié)締組織開(kāi)始增生成纖維細(xì)胞增多；第21天，組織水腫消失，炎細(xì)胞減少明顯幾乎消失，結(jié)締組織增生明顯。

圖1 不同時(shí)間VLUs模型病理圖(HE，×400)

第21天HE 染色圖片見(jiàn)圖2。a1，a2，a3組細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列整齊，成纖維細(xì)胞增多明顯，下肢靜脈性潰瘍組細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂，成纖維細(xì)胞增多不明顯；成纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)增多數(shù)量：a2組>a3組>b組>a1組>e組>d組>c組。

圖2 7組下肢靜脈性潰瘍HE染色結(jié)果(×100)

2.3免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)圖3。①a2組和b組CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白水平最高，d 組含量最低，與d組比較，a2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與c組及e組比較，a2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。②a2組和b組PCNA、TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白水平含量最高，d 組含量最低，與d組比較，a2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與c組及e組比較，a2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。③a2組Smad7、Caspase3蛋白水平含量最低，d組含量最高，與d組比較，a2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與c組比較，a2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。④a2組和b組α-SMA蛋白水平含量最高，d組含量最低，與d組比較，a2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A.a1組；B.a2組；C.a3組；D.e組；E.d組；F .c組；G.b組；①與a2組比較，P<0.05。

3 討論

VLUs是周?chē)芸瞥Ｒ?jiàn)的疾病，其修復(fù)過(guò)程極為復(fù)雜，涉及多種組織和修復(fù)細(xì)胞、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)等調(diào)控因素的參與。修復(fù)細(xì)胞在創(chuàng)傷修復(fù)的過(guò)程中占核心位置。成纖維細(xì)胞貫穿創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程始終，在肉芽形成、創(chuàng)面收縮、基質(zhì)合成、傷口修復(fù)等方面均起重要作用[6]，有研究表明，瘡面愈合早期炎癥期主要由單核、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等非特異免疫細(xì)胞向傷處遷移并釋放多種細(xì)胞因子；中期由成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等形成肉芽組織，填補(bǔ)組織缺損，并由表皮細(xì)胞增殖、遷移重建皮膚屏障；后期則主要由成纖維細(xì)胞分泌并沉積基質(zhì)。這些細(xì)胞行為的調(diào)控依賴于細(xì)胞因子傳遞信息，改變細(xì)胞因子的信息傳遞過(guò)程有可能干預(yù)和調(diào)控細(xì)胞的行為 。TGF-β1/Smads 通路是 TGF-β主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，在組織修復(fù)、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和組織纖維化等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，介導(dǎo)創(chuàng)面愈合過(guò)程[7-8]。

筆者在本研究通過(guò)研究VLUs兔成纖維細(xì)胞增殖，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，以及Western blotting檢測(cè)，紫朱軟膏外用能促進(jìn)下肢靜脈性潰瘍的愈合速度；紫朱軟膏主要由朱砂、紫草、龍血竭、黃芪、阿膠、冰片六味中藥組成。且這六味具有清熱解毒、祛腐生肌、補(bǔ)氣益血之功效。其中，紫草具有清熱解毒、活血涼血的功效；朱砂外用有解毒生肌之功，用治瘡瘍腫毒，適用于潰瘍久不收口；黃芪、阿膠補(bǔ)益氣血，氣血充足則為創(chuàng)面愈合提供有利條件。諸藥合用共奏煨膿祛瘀、補(bǔ)虛生肌之效；紫朱軟膏治療VLUs，已經(jīng)過(guò)大量臨床觀察，療效確切[9]。

通過(guò)HE染色檢測(cè)不同瘡面組織切片中成纖維細(xì)胞的形態(tài)及變化，結(jié)果表明紫朱軟膏組比其他對(duì)照組成纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列整齊，成纖維細(xì)胞增多明顯。成纖維細(xì)胞是創(chuàng)面愈合過(guò)程中的主體細(xì)胞，其生物學(xué)效應(yīng)在創(chuàng)面修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用，成纖維細(xì)胞所合成的膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組分，膠原代謝的結(jié)果直接影響創(chuàng)面的修復(fù)質(zhì)量[10]。紫朱軟膏組成纖維細(xì)胞增多，說(shuō)明外敷紫朱軟膏有促進(jìn)創(chuàng)面成纖維細(xì)胞增殖的功效。

Western blotting法檢測(cè)α-SMA 、PCNA、p-Smad2 、 p-Smad3、 Smad7的蛋白水平，結(jié)果與正常對(duì)照組比較，TGF-β1處理組細(xì)胞增殖明顯，α-SMA蛋白水平增加，Smad2 和Smad3蛋白磷酸化水平顯著增加，Smad7蛋白水平顯著降低，TGF-β和 Smads 蛋白分別是成纖維細(xì)胞的趨化因子和下游信號(hào)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，α-SMA 是成纖維細(xì)胞標(biāo)記物，α-SMA 的表達(dá)量可間接反映成纖維細(xì)胞的增殖情況[11]。PCNA 屬于真核細(xì)胞 DNA 復(fù)制與核苷酸剪切過(guò)程中所需要的一種輔助蛋白，可有效評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)[12]。Western blotting法檢測(cè)α-SMA與PCNA的含量升高明顯，說(shuō)明紫朱軟膏外用有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的作用。

TGF-β1是目前公認(rèn)的與潰瘍愈合密切相關(guān)的細(xì)胞因子之一，是一類(lèi)多肽信號(hào)分子家族，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的重要作用[13]。其中TGF-β1是上皮再生、免疫應(yīng)答和造血功能的關(guān)鍵抑制因子，是結(jié)締組織生長(zhǎng)的促進(jìn)因子[14]，可通過(guò)自分泌、旁分泌等方式調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，刺激成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)傷口再上皮化。TGF-β1/Smads通路的激活途徑中，TGF-β1必須與其跨膜受體結(jié)合，才能活化下游效應(yīng)分子進(jìn)而激活信號(hào)傳導(dǎo)，并通過(guò)Smads 蛋白將信號(hào)由胞質(zhì)介導(dǎo)入胞核，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[1]。p-Smads是Smads分子的活化形式，只有發(fā)生磷酸化后才能傳遞 TG-β1的刺激信號(hào)。其中，Smad3的磷酸化是 TGF-β1/Smads信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)作用的最關(guān)鍵步驟及重要標(biāo)志[15]，細(xì)胞內(nèi) p-Smad3蛋白表達(dá)的多少意味著TGF-β/Smads信號(hào)通路被激活以及發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的強(qiáng)弱程度[16]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫朱軟膏外用治療VLUs，引起局部組織細(xì)胞的增殖加速，很有可能是由于局部 TGF-β1的表達(dá)增加所造成，紫朱軟膏通過(guò)在蛋白表達(dá)水平激活TGF-β/Smads 信號(hào)通路，并且伴隨著Smad7表達(dá)水平降低，TGF-β1、α-SMA 活化水平升高，表明紫朱軟膏促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖可能和TGF-β/Smad3信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，紫朱軟膏外用可有效促進(jìn)VLUs兔子創(chuàng)面的愈合，誘導(dǎo)TGF-β1/Smads表達(dá)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖可能是其作用機(jī)制之一，有待通過(guò)觀察多個(gè)相關(guān)蛋白、利用多種實(shí)驗(yàn)方法等進(jìn)一步證實(shí)。