陳小梅，李慧玉，曲濤，高萌，徐向紅

(1.甘肅省人民醫(yī)院生物治療中心，蘭州 730000；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院干細胞中心，武漢 430022)

乳腺癌是全球女性發(fā)病率占據(jù)第一位的惡性腫瘤[1]。近年來開發(fā)出更有效的治療乳腺癌的療法，如光動力療法(photodynamic therapy，PDT)，它通過光敏劑引發(fā)的氧化應激對目標細胞造成損傷，對一些失去手術機會或難治性的腫瘤具有良好療效[2-4]。金絲桃素(Hypericum perforatum L，Hyp)是由金絲桃屬植物分離得到的一種天然光敏劑，易被腫瘤細胞攝取，具有強大的光敏特性、低暗毒性和高單線態(tài)氧量子產(chǎn)量[5]，可對多種實體腫瘤實施PDT[5-9]。金絲桃素介導的PDT可誘導腫瘤細胞免疫原性細胞死亡(immunogenic cell death，ICD)[10-12]，其特點是分泌或暴露損傷相關分子模式(damaged associated molecular patterns，DAMPs)[5-6]。DAMPs是正常情況下存在于細胞內的具有免疫激活作用的分子，在損傷或應激的刺激下，表達在細胞表面或從細胞中釋放出來[13-16]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB-1)、熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)和鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)是3個主要的DAMPs[5-6，12]。雖然PDT并不能有效治療播散性腫瘤[2]，但可提高腫瘤細胞的免疫原性[17]，因此，有必要與其他治療模式結合，如PDT聯(lián)合過繼免疫細胞治療[18-19]，后者可治療播散性腫瘤。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer，CIK)是抗腫瘤過繼免疫細胞治療的首選方案，是將外周血單個核細胞在體外經(jīng)多種細胞因子培養(yǎng)誘導獲得的免疫效應細胞，在培養(yǎng)過程中獲得非特異性、自然殺傷類的抗腫瘤細胞毒性[20]。本研究在體外模擬PDT作用，用金絲桃素作為光敏劑誘導MCF7細胞ICD；同時，用所得上清液與CIK細胞共培養(yǎng)以模擬體內DAMPs對免疫細胞的作用，探討Hyp-PDT誘導MCF7細胞ICD對CIK抗腫瘤活性的影響，并初步探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 金絲桃素(大連美侖生物技術有限公司，含量≥98%，批號：S0807AS)；還原型谷胱甘肽(reduced L-glutathione，GSH，德國BioFroxx公司，含量：99.4%，批號：EZ1609A126)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司，批號：8072965)；Ficoll淋巴細胞分離液(美國GE公司，批號：10270607)；CIK細胞培養(yǎng)試劑(北京康愛瑞浩生物科技股份有限公司，批號：20191020)；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的CD3(FITC-CD3)、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標記的CD8及CD16/56單克隆抗體(PE-CD8、PE-CD16/56)購自美國BD公司(批號：49979)；1640培養(yǎng)基(批號：AE24464298)、胎牛血清(批號：RC35965)均購自美國Hyclone公司；CRT(批號：N21039163)、HMGB-1(批號：D01039219)和HSP70(批號：E25039218)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒均購自武漢華美生物科技有限公司，噻唑藍(MTT，Sigma公司，批號：MKBF7875)。

1.2儀器與設備 LED光源(黃光)購自深圳奇異果光電有限公司，雙通道光功率計型號2936-R(美國NEWPORT公司)，流式細胞儀型號C6PLUS(美國BD公司)，分光光度型號Epoch 2(美國Bio-Rad公司)。

1.3細胞株 人乳腺癌細胞株MCF7購自中國科學院上海生命科學院細胞庫。

1.4實驗方法

1.4.1流式細胞術檢測Hyp-PDT誘導MCF7細胞凋亡 常規(guī)培養(yǎng)靶細胞MCF-7細胞，待細胞長至瓶底的80%，給予消化、懸浮、計數(shù)，向6孔板加入細胞，每孔1×106個，待貼壁生長至瓶底的80%，加入不同濃度的金絲桃素：0.15 μmol·L-1、0.20 μmol·L-1、0.25 μmol·L-1、0.25 μmol·L-1(+0.33 μmol·L-1GSH糾正)，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，之后分別給予不同光劑量：2.05 J·(cm2)-1、4.05 J·(cm2)-1[5-6]。將未做任何藥物及光照處理的MCF-7細胞作為對照。將Hyp-PDT處理后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h。收集細胞，洗滌，用100 μL1×Binding buffer重懸細胞(1×106·mL-1)，加Annexin V-FITC 5 μL，室溫下避光反應15 min，上機前5 min再加入碘化丙啶(PI)5 μL。流式檢測各組細胞凋亡率，1 h完成檢測。實驗重復3次。

1.4.3ICD誘導CIK對MCF-7細胞的抑制率 參照文獻[19]方法培養(yǎng)效應細胞CIK細胞。采用淋巴細胞分離液分離健康供者外周血單個核細胞，洗滌2次，用培養(yǎng)液培養(yǎng)，加入滅活的自體血清、γ-干擾素，置37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)24 h后，加白細胞介素(IL)-2、CD3mAb，以后每2～3 d適量添加含IL-2、自體血清的新鮮培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)CIK細胞。將MCF-7細胞做PDT處理，處理方法同“1.4.2”項。收集上清液，加入24孔板內。將成熟的CIK細胞約2×106個加入含上清液的24孔板內，未做PDT處理的MCF-7培養(yǎng)上清液及同樣數(shù)量的CIK細胞加入24孔板內作為對照。24 h后取出所有CIK細胞，洗滌。將對數(shù)生長期MCF-7細胞加入96孔板，每孔2×104個，培養(yǎng)12 h貼壁，將ICD誘導后并進行洗滌的CIK細胞加入96孔板內進行殺傷MCF-7實驗，效靶比為20：1。24 h后結束殺傷，用MTT法檢測靶細胞抑制率，酶標儀上讀取波長490 nm處吸光度(A)值，計算各試驗組和對照組的平均A值和抑制率。抑制率(%)=[1-(實驗細胞孔A值-效應細胞孔A值)/靶細胞孔A值]×100%。實驗重復3次。

1.4.4ELISA法檢測Hyp-PDT誘導MCF7細胞ICD后培養(yǎng)上清中的DAMPs分子濃度 MCF7 細胞上清液中DAMPs分子常規(guī)培養(yǎng)MCF7細胞，待細胞生長至瓶底80%，給予消化、懸浮、計數(shù)，向24孔板每孔加入細胞 1×105個，待貼壁生長至瓶底80%，給予PDT處理，2 h后收集上清液，860×g離心20 min，上清液為待測樣品。按照CRT、HMGB-1、HSP70的ELISA試劑盒說明書操作，將標準品稀釋為要求的倍數(shù)，設標準孔8孔建立標準曲線，待測樣品加入檢測孔，將反應板置37 ℃、2 h。棄去孔內液體，不洗滌，每孔加入生物素標記抗體100 μL，將反應板置37 ℃、1 h。棄去孔內液體，用洗滌液將反應板充分洗滌3次，濾紙上印干，每孔加酶標試劑100 μL，將反應板充分混勻后置37 ℃、1 h。用洗滌液將反應板充分洗滌3次，濾紙上印干。每孔加底物溶液90 μL，將反應板置37 ℃、20 min，注意避光。每孔加入50 μL終止液混勻，5 min內用Epoch2分光光度計檢測波長450 nm處A值。使用curve expert軟件繪制標準曲線，標準品濃度為縱坐標，A值為橫坐標，求回歸方程，將樣本A值代入方程計算出各樣品的濃度。

2 結果

2.1流式細胞術檢測Hyp-PDT誘導ICD細胞凋亡 MCF7細胞經(jīng)Hyp-PDT處理后發(fā)生凋亡。流式細胞術檢測早期(Annexin V+/PI-)和晚期(Annexin V+/PI+)凋亡細胞的百分率，數(shù)據(jù)以百分率表示。各組Hyp-PDT(包括GSH糾正組)誘導MCF7細胞早期凋亡和晚期凋亡的細胞的比例較對照組均明顯上升(P<0.05，F(xiàn)Annexin V+/PI-=1510.58，F(xiàn)Annexin V+/PI+=962.42)，且隨著Hyp-PDT的增強凋亡細胞比例顯著上升，而外源性抗氧化劑GSH可以部分阻止Hyp-PDT誘導的ICD，結果見圖1，2。

圖1 MCF7細胞經(jīng)Hyp-PDT誘導后凋亡情況

①與正常對照組比較，P<0.05；②與GSH糾正組比較，P<0.05；③與其他Hyp-PDT組比較，均P<0.05。

A.正常對照組；B.GSH糾正組；C.0.15 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組；D.0.15 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組；E.0.20 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組；F.0.20 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組；G.0.25 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組；①與正常對照組比較，P<0.05；②與GSH糾正組比較，P<0.05；③與其他Hyp-PDT組比較，均P<0.05。

2.3ICD誘導CIK對MCF-7細胞增殖的抑制 MTT實驗結果見圖4。與對照組比較，除GSH糾正組外，不同強度Hyp-PDT誘導ICD的MCF7細胞上清液誘導的CIK對MCF7細胞增殖的抑制率明顯增高(F=111.49，P<0.05)。不同光劑量聯(lián)合不同質量濃度Hyp誘導MCF7細胞ICD的上清液誘導CIK對MCF7細胞增殖的抑制率不同，抑制率隨Hyp-PDT劑量的增加而升高。各Hyp-PDT組相互比較結果顯示，0.15 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組、0.15 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組、0.20 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組這3組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。以上結果表明，Hyp-PDT誘導ICD的MCF7細胞上清液能增強CIK細胞的抗腫瘤活性。

A.正常對照組；B.GSH糾正組；C.0.15 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組；D.0.15 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組；E.0.20 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組；F.0.20 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組；G.0.25 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組；①與正常對照組比較，P<0.05；②與GSH糾正組比較，P<0.05；③與E，F(xiàn)，G組比較，均P<0.05；④與F，G組比較，均P<0.05；⑤與F，G組比較，均P<0.05；⑥與G組比較，P<0.05。

2.4免疫原性死亡MCF7細胞上清液中HMGB-1、HSP70和CRT含量 ELISA實驗結果見圖5。與對照組比較，除GSH糾正組外，不同強度Hyp-PDT誘導MCF7細胞ICD的上清液中測得CRT、HMGB-1和HSP70濃度顯著升高(P<0.05，F(xiàn)CRT=389.70，F(xiàn)HMGB-1=2907.96，F(xiàn)HSP70=1897.32)，提示DAMPs是基于Hyp-PDT誘導的ICD增強CIK殺傷活性的關鍵因素。

A.正常對照組；B.GSH糾正組；C.0.15 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組；D.0.15 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組；E.0.20 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組；F.0.20 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組；G.0.25 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組；①與對照組比較，P<0.05；②與GSH糾正組比較，P<0.05；③與其他Hyp-PDT組比較，均P<0.05

3 討論

腫瘤轉移是乳腺癌治療效果不佳和死亡的主要原因[21]。目前，乳腺癌的治療主要以外科手術和藥物為主[22]，但外科手術和化療藥物會帶來嚴重的副作用。因此，尋找安全有效、毒副作用低的治療方法顯得尤為重要。Hyp-PDT已被證實是在技術上可行的腫瘤治療的新方法[7-9，23]，Hyp-PDT治療通過直接的細胞毒性作用、血管損傷和誘導免疫應答殺死腫瘤[12]，尤其是對一些失去手術機會或難治性的腫瘤，均具有良好療效且毒副作用小。本研究中，筆者將人乳腺癌MCF7細胞作為Hyp-PDT誘導乳腺癌細胞ICD的模型。為明確Hyp-PDT過程對MCF7細胞的損傷程度，分析細胞凋亡，結果顯示Hyp-PDT組細胞凋亡比例均高于對照組和GSH糾正組，證明Hyp-PDT可引起乳腺癌細胞ICD。在此基礎上進一步分析Hyp-PDT對MCF7細胞的損傷可知，凋亡細胞的比例隨著Hyp-PDT劑量的增加而顯著升高，而GSH可糾正0.25 μmol·L-1Hyp和4.05 J·(cm2)-1光劑量組引起的MCF7細胞ICD。這一結果與ZHENG等[5]研究報道一致，說明Hyp-PDT能夠激活MCF7細胞氧化應激反應并誘導ICD，而GSH能減輕氧化應激對MCF7細胞的損傷。

在Hyp-PDT中，一些關鍵DAMPs的暴露或釋放對ICD至關重要[17]。通過對Hyp-PDT誘導MCF7細胞ICD后的培養(yǎng)上清液中DAMPs的分析發(fā)現(xiàn)，Hyp-PDT組上清液中CRT、HMGB1、HSP70含量顯著高于對照組和GSH糾正組；隨著Hyp-PDT劑量的增加，ICD細胞上清液中DAMPs分子濃度亦升高，因此DAMPs可能是Hyp-PDT強化CIK殺傷腫瘤細胞活性的關鍵因素。由此可推測，經(jīng)歷ICD的腫瘤細胞通過DAMPs的釋放增加腫瘤細胞的免疫原性，改善免疫抑制微環(huán)境，破壞免疫逃逸平衡，增強淋巴細胞的抗腫瘤活性。本研究結果初步支持ICD相關的DAMPs在增強CIK殺傷效能方面的關鍵作用，當然并不排除其他分子的作用。需要說明的是，本研究只針對一種特定的癌癥類型和一種細胞系。即使在同一種癌癥中，癌癥本身也是異質性的，因此很難推斷這種治療方法對所有癌癥都有效。

綜上所述，本研究證明將Hyp-PDT與CIK治療聯(lián)合應用具有協(xié)同抗腫瘤作用，基于Hyp-PDT的ICD在CIK抗腫瘤免疫應答過程中具有重要作用，DAMPs是提高免疫應答關鍵分子，這為PDT和免疫細胞治療的結合提供了體外試驗證據(jù)，為播散性腫瘤的治療提供了新的方法和思路。