劉艷平，張秀花，劉靖華

（山東省菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，山東 菏澤274000）

小建中膠囊由桂枝、白芍、炙甘草、生姜、大棗等5味中藥經(jīng)現(xiàn)代工藝精制而成，具有溫中祛寒、緩急止痛功效［1］。標(biāo)準(zhǔn)制法中桂枝以水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油入藥，具有明顯的抗菌活性［2－5］，配方中白芍、生姜等亦具有一定抑菌作用［6－10］，進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，需首先消除樣品本身的抑菌作用，才能使被檢微生物正常繁殖［11］。本研究中采用3批樣品進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，建立了小建中膠囊的微生物限度檢查方法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與菌株

1.1 儀器

HZT－A600型電子天平（福州華志科學(xué)儀器有限公司）；MLS－3781L－PC型高壓蒸汽滅菌器（三洋工業(yè)株式會(huì)社）；ClassⅡBSC型生物安全柜（新加坡ESCD公司）；WGZ－2XJ型細(xì)菌濁度分析儀（上海昕瑞儀器儀表有限公司）；DHP－420型電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；SPX－150B型生化培養(yǎng)箱（上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

小建中膠囊（貴州太和制藥有限公司，批號分別為20190801，20200501，20200301）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA，批號為190518），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB，批號為190712），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，批號為190625），pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液（批號為190206），均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，試驗(yàn)所用菌株均為第3代。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

菌液：取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制成菌落數(shù)不大于1×104cfu／mL的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物，再用含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制成菌落數(shù)不大于1×104cfu／mL的菌懸液；取大腸埃希菌，用pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制成菌落數(shù)不大于100 cfu／mL的菌懸液［12］。

供試品溶液：取樣品內(nèi)容物10 g，加pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液溶解并稀釋至100 mL，混勻，制成1∶10（m／V）供試品溶液；用pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制成1∶20（m／V），1∶50（m／V），1∶80（m／V）的系列供試品溶液［13］。

2.2 微生物檢查常規(guī)法

試驗(yàn)組：取2.1項(xiàng)下1∶10的供試品溶液適量，分別置5支無菌試管，每管9.9 mL，分別加入2.1項(xiàng)下5種菌懸液0.1 mL，混勻，各取1 mL注入平皿，平行2份。

空白對照組：取2.1項(xiàng)下1∶10的供試品溶液適量，置無菌管，每管9.9 mL，分別加入試驗(yàn)組對應(yīng)的稀釋液0.1 mL，混勻，各取1 mL注入平皿，平行2份。

菌液對照組：取試驗(yàn)組對應(yīng)的稀釋液分裝于無菌試管中，每管9.9 mL，分別加入2.1項(xiàng)下5種菌懸液0.1 mL，混勻，各取1 mL注入平皿，平行2份。

試驗(yàn)菌加樣回收測定：取上述3組平皿，需氧菌計(jì)數(shù)中，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌在32～33℃條件下用TSA培養(yǎng)72 h；白色念珠菌、黑曲霉在33～35℃條件下用TSA培養(yǎng)5 d；霉菌酵母菌計(jì)數(shù)中，白色念珠菌、黑曲霉在23～25℃條件下用SDA培養(yǎng)5 d［12］。按公式計(jì)算回收比，回收比＝（試驗(yàn)組菌落數(shù)－空白對照組菌落數(shù)）／菌液對照組菌落數(shù)。結(jié)果需氧菌計(jì)數(shù)中，銅綠假單胞菌及枯草芽孢桿菌回收比均小于0.5，詳見表1（表中“銅綠”為銅綠假單胞菌，“枯草”為枯草芽孢桿菌，“金葡”為金黃色葡萄球菌，“白念”為白色念珠菌，表2、表4同）?？梢?，常規(guī)法不能消除樣品中抑菌成分，需進(jìn)一步試驗(yàn)。

表1 常規(guī)法試驗(yàn)菌株回收比（n＝3）Tab.1 Recovery ratio of test strains by the routine method（n＝3）

2.3 微生物檢查稀釋法

試驗(yàn)組：取2.1項(xiàng)下1∶20（m／V）的供試品溶液，分別置2支無菌試管中，每管9.9 mL，分別加入2.1項(xiàng)下銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌2種菌懸液0.1 mL，混勻，各取1 mL注入平皿，平行制備2份。同法制備1∶50（m／V），1∶80（m／V）溶液。

供試品對照組：取2.1項(xiàng)下1∶20（m／V）的供試品溶液9.9 mL，置無菌試管中，加入pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液0.1 mL，混勻，取1 mL注入平皿，平行制備2份。同法制備1∶50（m／V）和1∶80（m／V）供試品。

菌液對照組：同常規(guī)法“菌液對照組”項(xiàng)下方法制備銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌2種菌液對照組。同法制備1∶50（m／V）和1∶80（m／V）菌液。

試驗(yàn)菌加樣回收測定：按2.2項(xiàng)下方法操作。1∶20供試液，1批樣品銅綠假單胞菌、3批樣品枯草芽孢桿菌回收比均小于0.5；1∶50供試液，2批樣品枯草芽孢桿菌回收比均小于0.5；1∶80供試液，3批樣品2種菌株回收比均在0.5～2.0范圍內(nèi)，符合藥典要求。詳見表2。

表2 稀釋法試驗(yàn)菌株回收比（n＝3）Tab.2 Recovery ratio of test strains by the dilution method（n＝3）

2.4 控制菌檢查

供試品組（A組）：取2.1項(xiàng)下1∶10（m／V）供試品溶液3份，每份10 mL，分別置100，150，200 mL TSB中。

陽性對照組（B組）：取2.1項(xiàng)下1∶10（m／V）供試品溶液3份，每份10 mL，分別置100，150，200 mL TSB中，分別加入2.1項(xiàng)下大腸埃希菌菌液1 mL。

陰性對照組（C組）：以稀釋液代替供試品溶液，其余同A組。

控制菌檢查：上述3組均在33～35℃條件下培養(yǎng)24 h［14］。結(jié)果B組均檢出陽性菌，說明小建中膠囊對大腸埃希菌無抑制作用。詳見表3。

表3 不同培養(yǎng)基體積控制菌檢查結(jié)果（n＝3）Tab.3 Results of control bacteria test in different medium volume（n＝3）

2.5 微生物限度檢查法適用性驗(yàn)證

對樣品進(jìn)行微生物限度檢查法適用性驗(yàn)證。結(jié)果，微生物計(jì)數(shù)采用1∶80供試品溶液，3批樣品5種菌株回收比均在0.5～2.0范圍內(nèi)；控制菌檢查采用常規(guī)法，陽性對照組檢出陽性菌，符合藥典要求。詳見表4。

表4 微生物限度檢查法適用性驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（平均回收比）Tab.4 Results of applicability verification test of microbial limit test method（average recovery ratio）

3 討論

藥品微生物限度檢查是藥品管理體系中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，藥品受微生物污染程度直接反映藥品生產(chǎn)、運(yùn)輸、銷售、貯藏等環(huán)節(jié)的質(zhì)量管理是否規(guī)范。對藥品中污染的微生物進(jìn)行控制，建立適宜的藥品微生物限度檢查方法，可最大限度地保證公眾用藥安全有效。微生物菌落總數(shù)回收比應(yīng)在0.5～2.0之間，回收比小于0.5時(shí)，可采用稀釋法，加入適宜的中和劑或滅活劑，薄膜過濾法，以及聯(lián)合應(yīng)用上述方法可消除供試品的抑菌活性。微生物限度檢查方法建立的關(guān)鍵點(diǎn)是采用何種技術(shù)手段消除樣品中的抑菌成分，且操作方法科學(xué)、簡便、快速。

本研究中的樣品有明顯抑菌作用，將常規(guī)法回收比小于0.5的銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌作為敏感菌株，采用稀釋法、1∶80供試液，各試驗(yàn)菌回收比均在0.5～2.0之間，符合藥典要求，故可用于小建中膠囊微生物計(jì)數(shù)檢查。采用常規(guī)法和稀釋法同時(shí)進(jìn)行大腸埃希菌檢查，結(jié)果表明，小建中膠囊對大腸埃希菌無抑制作用，常規(guī)法可用于其控制菌的檢查。

本研究中根據(jù)制劑的抑菌特性，采用稀釋法對需氧菌、霉菌酵母菌及常規(guī)法對大腸埃希菌進(jìn)行驗(yàn)證，方法可行、結(jié)果可靠，可用于該產(chǎn)品微生物限度檢查的質(zhì)量控制，同時(shí)為藥監(jiān)部門科學(xué)監(jiān)管提供一定的技術(shù)參考。